Name: an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion
Uploaded: 2022-03-31T12:30:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion at JoVE.com

Gli autori riconoscono i membri del Centro di Medicina Rigenerativa di QUT, in particolare Antonia Horst e Pawel Mieszczanek per i loro utili suggerimenti e feedback. Questo lavoro è stato supportato dal PREMIO PER LA RICERCA POST-laurea del QUT per SE e dall'Australian Research Council (ARC) nell'ambito dell'accordo di sovvenzione IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). NB è stato supportato da un National Health and Medical Research Council (NHMRC) Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734).

CM e DWH sono fondatori e azionisti di Gelomics Pty Ltd. CM è anche il direttore di Gelomics Pty Ltd. Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi rilevante per l'argomento di questo articolo. Gli autori non hanno altre affiliazioni rilevanti o coinvolgimento finanziario con qualsiasi organizzazione o entità con un interesse finanziario o un conflitto finanziario con l'argomento o i materiali discussi nell'articolo oltre a quelli divulgati.

Il pipettaggio di materiali viscosi, in particolare idrogel per applicazioni biomediche19,20,21,33,47, sono compiti di routine in molti laboratori di ricerca per preparare una concentrazione definita dall'utente o una serie di diluizione con concentrazioni variabili. Sebbene sia ripetitivo e l'esecuzione sia piuttosto semplice, viene eseguita principalmente manualmente con un throughput di campionamento basso18. Questo tutorial introduce il funzionamento di una workstation open source, che è stata specificamente progettata per materiali viscosi, per consentire la miscelazione automatizzata di materiali viscosi per la generazione riproducibile delle concentrazioni desiderate. Questa workstation è ottimizzata per il pipettaggio di idrogel per consentire una gestione automatizzata e altamente affidabile mediante l'integrazione di banchine di temperatura per materiali termoresponsivi, pipette a spostamento positivo per materiali viscosi e un dock touch a punta opzionale per rimuovere il materiale in eccesso dalla punta. Il modulo di pipettaggio è stato specificamente ottimizzato per consentire la lavorazione di materiale viscoso in modo standardizzato e automatizzato. Rispetto alle pipette a cuscino d'aria (Figura 5a), le pipette a spostamento positivo (Figura 5b) erogano materiali viscosi senza lasciare materiale residuo lasciato nella punta, con conseguente aspirazione e dosaggio accurati. Il touch dock opzionale rimuove il materiale campione in eccesso dalla punta (Figura 5c,d), utile per i materiali incollati (ad esempio, il 4% (p/v) di alginato).
L'applicazione del progettista del protocollo è stata specificamente programmata per gli idrogel e consente la diluizione di un massimo di quattro reagenti con diverse concentrazioni e fino a due diluenti. Il rischio di errori nel calcolo delle diluizioni finali è evitato in questa applicazione, poiché gli utenti scelgono solo la concentrazione desiderata o le fasi di diluizione seriale. I volumi di aspirazione ed erogazione richiesti vengono calcolati automaticamente, salvati in un file di testo di documentazione separato e quindi inseriti nello script di protocollo. Questa applicazione di progettazione del protocollo offre all'utente il pieno controllo di tutti i parametri sperimentali (ad esempio, velocità di pipettaggio) e garantisce la documentazione interna dei parametri importanti. L'app di progettazione del protocollo tiene conto del livello di riempimento del serbatoio (ad esempio, pozzo) e varia l'altezza di aspirazione / erogazione per evitare inutili immersioni nei materiali viscosi. Questa funzione integrata evita l'accumulo di materiale sulla parete esterna della punta e, quindi, garantisce attività di aspirazione ed erogazione affidabili in tutto il protocollo. Sebbene l'applicazione di progettazione del protocollo sia stata sviluppata per le fasi di diluizione dell'idrogel, può essere utilizzata anche per la diluizione di liquidi non viscosi, come i coloranti Orange G. L'applicazione di progettazione del protocollo, accessibile tramite il repository sotto '/examples/publication-JoVE', è la versione spiegata nella sezione protocollo ed evidenziata nel video. Questa versione non verrà aggiornata. Tuttavia, una versione aggiornata dell'applicazione di progettazione del protocollo è disponibile tramite la pagina principale del repository. Il terminale di calibrazione è stato inizialmente sviluppato da Sanderson48 ed è stato ottimizzato per la calibrazione di pipette a spostamento positivo.
Come descritto nella sezione 4 del protocollo, le pipette e i contenitori devono essere calibrati inizialmente. Questo processo di calibrazione è fondamentale per definire e salvare le posizioni che vengono poi utilizzate per calcolare gli incrementi di movimento. Pertanto, l'esecuzione corretta del protocollo si basa su posizioni di calibrazione ben definite, poiché punti di calibrazione errati potrebbero causare l'arresto anomalo della punta in un contenitore. Poiché le posizioni dello stantuffo delle pipette devono essere calibrate manualmente, l'accuratezza e la precisione del pipettaggio dipendono in gran parte dalla calibrazione eseguita. Queste procedure di calibrazione dipendono fortemente dall'esperienza dell'utente con il modulo di pipettaggio e, pertanto, si consiglia all'inizio la formazione con personale esperto per garantire procedure di calibrazione adeguate. Oltre alla calibrazione manuale sul modulo di pipettaggio, la pipetta stessa deve essere calibrata per garantire un pipettaggio accurato. Si raccomanda di calibrare le pipette almeno ogni 12 mesi per soddisfare i criteri di accettazione specificati nella norma ISO 8655. Per valutare internamente la calibrazione della pipetta, sono disponibili la convalida e la verifica come descritto da Stangegaard et al.16.
Per la generazione di un set di dati affidabile, è fondamentale iniziare con reagenti di alta qualità. Ciò è particolarmente importante per le attività di elaborazione dell'idrogel, poiché le variazioni da lotto a lotto potrebbero influire sui risultati generati all'interno di questo protocollo. Oltre alle variazioni da lotto a lotto, anche sottili cambiamenti nella preparazione di piccoli volumi possono contribuire a differenze di proprietà. Per evitare ciò, si consiglia la preparazione di volumi maggiori, che possono essere utilizzati per l'intero esperimento.
Le procedure di convalida e verifica si basano sull'uso di un colorante per identificare miscele affidabili. Il protocollo presentato descrive l'applicazione di Orange G, ma il protocollo generale e il flusso di lavoro di analisi possono anche essere adattati ai coloranti fluorescenti49,50. L'uso di Orange G riduce i requisiti tecnici dello spettrofotometro ed elimina le precauzioni prese per prevenire lo sbiancamento dei coloranti fluorescenti dopo l'esposizione alla luce. Problemi nel comportamento di dissoluzione o nella formazione di cluster del colorante non sono stati osservati con i materiali presentati durante gli esperimenti, ma potrebbero apparire con altri materiali. La potenziale formazione di cluster e, quindi, l'interazione tra colorante e materiale potrebbero essere facilmente rilevati con un microscopio.
Le procedure e le tecniche presentate in questo tutorial aggiungono funzionalità di automazione ai flussi di lavoro correnti per materiali viscosi per ottenere attività altamente affidabili con il minimo lavoro umano. La tabella di risoluzione dei problemi fornita (Tabella 2) include i problemi identificati e presenta possibili motivi e soluzioni per risolverli. La postazione di lavoro presentata è stata applicata con successo a materiali polimerici naturali (gelatina, gomma di gellano, matrigel) e sintetici (ad esempio, poli(glicole etilenico) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) per attività di pipettaggio automatizzate. In particolare, la combinazione di una workstation open source e di un'applicazione di progettazione di protocolli open source progettata per materiali viscosi sarà molto utile per i ricercatori che lavorano nei campi dell'ingegneria biomedica, della scienza dei materiali e della microbiologia.

La riproducibilità e la replicabilità sono di fondamentale importanza nel lavoro scientifico1,2,3,4. Tuttavia, prove recenti hanno evidenziato sfide significative nel ripetere studi biomedici ad alto impatto nella scienza fondamentale e nella ricerca traslazionale4,5,6,7. I fattori che contribuiscono a risultati irriproducibili sono complessi e molteplici, come la progettazione di studi scadente o distorta6,8, una potenza statistica insufficiente3,9, la mancata conformità agli standard di segnalazione7,10,11, la pressione per la pubblicazione6 o metodi non disponibili o codice software6,9 . Tra questi, sottili cambiamenti nel protocollo ed errori umani nell'esecuzione degli esperimenti sono stati identificati come ulteriori elementi che spiegano l'irriproducibilità4. Ad esempio, le attività di pipettaggio manuale introducono imprecisione intra e interindividuale12,13 e aumentano la probabilità di errori umani14. Mentre i robot commerciali per la movimentazione dei liquidi sono in grado di superare questi inconvenienti e hanno dimostrato una maggiore affidabilità per i liquidi15,16,17, la movimentazione automatizzata di materiali con proprietà viscose significative è ancora impegnativa.
I robot commerciali per la movimentazione dei liquidi utilizzano comunemente pipette a cuscino d'aria, note anche come pipette a pistone d'aria o a spostamento d'aria. Il reagente e il pistone sono separati da un cuscino d'aria che si restringe durante le fasi di erogazione e si espande durante le fasi di aspirazione. Utilizzando pipette a cuscino d'aria, i materiali viscosi "fluiscono" solo lentamente dentro e fuori dalla punta e il ritiro anticipato della pipetta dal serbatoio può comportare l'aspirazione di bolle d'aria. Durante le attività di erogazione, il materiale viscoso lascia un film sulla parete interna della punta che "scorre" solo lentamente o per niente quando viene forzato dall'aria. Per ovviare a questi problemi, sono state introdotte commercialmente pipette a spostamento positivo per estrudere attivamente il materiale viscoso dalla punta utilizzando un pistone solido. Sebbene queste pipette a spostamento positivo consentano una gestione accurata e affidabile di materiali viscosi, le soluzioni automatizzate con pipette a spostamento positivo sono ancora troppo costose per le impostazioni di laboratorio accademiche e, pertanto, la maggior parte dei flussi di lavoro con materiali viscosi si basa esclusivamente su attività di pipettaggio manuale18.
In generale, la viscosità è definita come la resistenza di un fluido al flusso e i materiali viscosi vengono ulteriormente definiti come materiali con una maggiore viscosità dell'acqua (0,89 mPa·s s a 25 °C). Nel campo delle applicazioni biomediche, le configurazioni sperimentali contengono spesso più materiali con una viscosità maggiore dell'acqua, come il dimetilsolfossido (DMSO; 1,99 mPa·s a 25 °C), il glicerolo (208,1 mPa·s a 25 °C per il 90% di glicerolo [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s a 25 °C) e polimeri gonfi d'acqua, denominati idrogel19, 20. Gli idrogel sono reti polimeriche idrofile disposte in modalità fisica e / e chimica utilizzate per varie applicazioni, tra cui l'incapsulamento cellulare, la somministrazione di farmaci e attuatori morbidi19,20,21,22. La viscosità degli idrogel dipende dalla concentrazione del polimero e dal peso molecolare19. Gli idrogel utilizzati di routine per applicazioni biomediche presentano valori di viscosità compresi tra 1 e 1000 mPa·s, mentre sono stati riportati sistemi idrogel specifici con valori fino a 6 x 107 mPa·s19,23,24. Tuttavia, le misurazioni della viscosità degli idrogel non sono standardizzate in termini di protocollo di misurazione e preparazione del campione e, pertanto, i valori di viscosità tra diversi studi sono difficili da confrontare.
Poiché le soluzioni automatizzate disponibili in commercio specificamente progettate per gli idrogel sono mancanti o troppo costose, gli attuali flussi di lavoro per l'idrogel dipendono dalla movimentazione manuale18. Per comprendere i limiti dell'attuale flusso di lavoro manuale per il pipettaggio degli idrogel, è importante comprendere le attività di gestione essenziali18. Ad esempio, una volta che un nuovo materiale idrogel è stato sintetizzato, viene generata una concentrazione desiderata o una serie di diluizione con concentrazioni variabili per identificare protocolli di sintesi affidabili e caratteristiche di reticolazione con successiva analisi delle proprietà meccaniche25,26,27,28 . In generale, una soluzione madre viene preparata o acquistata e successivamente miscelata con un diluente e/o altri reagenti per ottenere una miscela. Le attività di miscelazione non vengono per lo più eseguite direttamente in una piastra di pozzo (o in qualsiasi formato di output) e vengono piuttosto eseguite in un tubo di reazione separato, che viene comunemente indicato come mix master. Durante queste attività di preparazione, sono necessarie varie fasi di aspirazione ed erogazione per trasferire il materiale viscoso, mescolare i reagenti e trasferire la miscela in un formato di uscita (ad esempio, una piastra da 96 pozzetti). Questi compiti richiedono un'elevata quantità di lavoro umano18, lunghe ore sperimentali e aumentano la probabilità di errori umani che potrebbero potenzialmente manifestarsi come risultati imprecisi. Inoltre, la movimentazione manuale impedisce la preparazione efficiente di numeri di campioni elevati per lo screening di varie combinazioni di parametri per una caratterizzazione dettagliata. L'elaborazione manuale impedisce anche l'uso di idrogel per applicazioni di screening ad alto rendimento, come l'identificazione di composti promettenti durante lo sviluppo di farmaci. Le attuali fasi di preparazione basate su manuale non sono fattibili per lo screening di librerie di farmaci costituite da migliaia di farmaci. Per questi motivi, sono necessarie soluzioni automatizzate per fornire un processo di sviluppo efficiente e consentire la traduzione di successo di idrogel per applicazioni di screening dei farmaci.
Per passare da flussi di lavoro manuali a processi automatizzati, abbiamo ottimizzato un robot di pipettaggio open source commerciale per la movimentazione di materiali viscosi mediante l'integrazione di banchine di temperatura per materiali termoresponsivi, l'utilizzo di pipette a spostamento positivo pronte all'uso utilizzando punte a pistone capillare e un dock touch a punta opzionale per la pulizia della punta della pipetta. Questo robot di pipettaggio è stato ulteriormente integrato come modulo di pipettaggio in una workstation open source di nuova concezione, composta da moduli pronti per l'installazione e personalizzabili18,29. Le istruzioni di montaggio dettagliate per la workstation sviluppata, inclusi i file hardware e software, sono liberamente accessibili da GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) e dal repository Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Oltre allo sviluppo hardware, è stata programmata e rilasciata un'applicazione di progettazione di protocolli open source per guidare l'utente attraverso il processo di selezione dei parametri e generare un codice di protocollo pronto all'uso (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Questo codice viene eseguito sul robot di pipettaggio open source commerciale e sulla workstation open source sviluppata.
Qui viene fornito un tutorial completo sul funzionamento della workstation open source per automatizzare le attività di miscelazione per materiali viscosi (Figura 1). I passaggi del protocollo specifici del tutorial possono essere eseguiti con la workstation open source sviluppata e il robot di pipettaggio open source commerciale. Supportato da un'applicazione di progettazione del protocollo open source sviluppata internamente, viene dimostrata la miscelazione e la preparazione automatizzate delle concentrazioni richieste per glicerolo, gelatina metacriloil (GelMA) e alginato. Il glicerolo è stato selezionato in questo tutorial, poiché è ben caratterizzato30,31, è economico e prontamente disponibile e, pertanto, è comunemente usato come materiale di riferimento viscoso per attività di pipettaggio automatizzate. Come esempi per gli idrogel utilizzati in applicazioni biomediche, le soluzioni precursori di GelMA e alginato idrogel sono state applicate per esperimenti di miscelazione automatizzati. GelMA presenta uno degli idrogel più comunemente usati per gli studi di incapsulamento cellulare32,33 e l'alginato è stato selezionato in questo studio per dimostrare la capacità di produrre idrogel a doppia rete34,35. Utilizzando Orange G come colorante, è stata implementata una procedura rapida ed economica per convalidare e verificare i risultati della miscelazione con uno spettrofotometro16.
Un robot di pipettaggio open source commerciale è stato integrato come modulo di pipettaggio nella workstation open source sviluppata (Figura 2a) e, pertanto, il nome "modulo di pipettaggio" viene ulteriormente utilizzato per descrivere il robot di pipettaggio. Una descrizione dettagliata dell'hardware installato esula dallo scopo di questo protocollo ed è disponibile tramite i repository forniti che includono anche istruzioni dettagliate per l'assemblaggio generale della piattaforma open source. Il modulo di pipettaggio può essere dotato di due pipette (pipetta a singolo o 8 canali) che sono installate sull'asse A (a destra) e sull'asse B (a sinistra) (Figura 2b). Il modulo di pipettaggio offre una capacità di 10 ponti secondo gli standard ANSI/SLAS (American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening) e sul ponte sono definite le seguenti posizioni di posizione: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (Figura 2c). Per avviare la polimerizzazione fotoindotta di soluzioni di idrogel, è necessario un modulo reticolante separato che è stato aggiunto alla workstation. Il modulo reticolante è dotato di LED con una lunghezza d'onda di 400 nm e, quindi, sostanze che eccitano a una lunghezza d'onda della luce visibile possono essere utilizzate con i sistemi attuali, come il litio fenil-2,4,6 trimetilboilfosfinato (LAP)36,37. L'intensità (in mW/cm2) dei LED può essere affrontata dall'utente nell'applicazione di progettazione del protocollo per studiare il comportamento di reticolazione38. La workstation include anche un modulo di archiviazione per consentire studi di maggiore produttività; tuttavia, questo modulo non viene utilizzato all'interno di questo studio e, pertanto, non ulteriormente descritto. In generale, si consiglia di utilizzare il modulo di pipettaggio in un armadio di sicurezza biologica per evitare la contaminazione del campione. Il circuito di alimentazione principale per far funzionare il modulo di pipettaggio è un circuito a 12 V, che è considerato un'applicazione a bassa tensione nella maggior parte dei paesi. Tutti i componenti elettrici sono basati su una scatola di controllo dedicata che impedisce agli utenti di entrare in contatto con la fonte di un pericolo elettrico.
Seguendo questi protocolli di miscelazione standardizzati, i ricercatori sono in grado di ottenere miscele affidabili per materiali viscosi e non viscosi in modo automatizzato. L'approccio open source consente agli utenti di ottimizzare le sequenze di mixaggio e condividere i protocolli di nuova concezione con la comunità. In definitiva, questo approccio faciliterà lo screening di più combinazioni di parametri per indagare le interdipendenze tra diversi fattori e, quindi, accelerare l'applicazione affidabile e lo sviluppo di materiali viscosi per applicazioni biomediche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:260px;">5 mL tubes</td>
			<td style="width:301px;">Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SCT-5ML</td>
			<td style="width:301px;">size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-432-22</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;70% w/w Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">LabChem, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">aja726-5Lpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">96-well plate</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Alginate</td>
			<td style="width:301px;">NovaMatrix</td>
			<td align="right" style="width:203px;">4200001</td>
			<td>https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Demineralized or ultrapure (MilliQ) water</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:260px;">Gelatin methacryloyl (GelMA)</td>
			<td style="width:301px;">Synthetized in-house</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:301px;">detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich, Inc. (USA)</td>
			<td align="right" style="width:203px;">900889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M4 and M5 Allen key</td>
			<td style="width:301px;">OpenBuilds, inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">179, 190</td>
			<td>also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">OrangeG</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific (USA)</td>
			<td style="width:203px;">O267-25</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14190-144</td>
			<td style="width:301px;">alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Equipment</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Aluminium blocks for temperature dock</td>
			<td style="width:301px;">Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SB16</td>
			<td>blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;Analytical balance</td>
			<td style="width:301px;">Sartorius AG (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">ED224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Open source liquid handling robot: commercial product</td>
			<td style="width:301px;">Opentrons Laboratories, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">OT-One S Pro</td>
			<td>https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td>Open source liquid handling robot: open source hardware</td>
			<td>Assembled in-house following an open source approach</td>
			<td></td>
			<td>hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Positive displacement pipette: MicromanE</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">FD10006</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">BMG LABTECH GmbH (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">CLARIOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips: capillary pistons</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">F148180</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion

Le attuali fasi di miscelazione di materiali viscosi si basano su attività ripetitive e dispendiose in termini di tempo che vengono eseguite principalmente manualmente in una modalità a bassa produttività. Questi problemi rappresentano svantaggi nei flussi di lavoro che possono alla fine comportare l'irriproducibilità dei risultati della ricerca. I flussi di lavoro manuali stanno ulteriormente limitando il progresso e l'adozione diffusa di materiali viscosi, come gli idrogel utilizzati per applicazioni biomediche. Queste sfide possono essere superate utilizzando flussi di lavoro automatizzati con processi di miscelazione standardizzati per aumentare la riproducibilità. In questo studio, presentiamo istruzioni dettagliate per utilizzare un progettista di protocolli open source, per gestire una workstation open source e per identificare miscele riproducibili. In particolare, il progettista di protocollo open source guida l'utente attraverso la selezione dei parametri sperimentali e genera un codice di protocollo pronto all'uso per far funzionare la workstation. Questa workstation è ottimizzata per il pipettaggio di materiali viscosi per consentire una gestione automatizzata e altamente affidabile mediante l'integrazione di banchine di temperatura per materiali termoresponsivi, pipette a spostamento positivo per materiali viscosi e un dock touch a punta opzionale per rimuovere il materiale in eccesso dalla punta della pipetta. La validazione e la verifica delle miscele vengono eseguite mediante una misurazione dell'assorbanza rapida ed economica di Orange G. Questo protocollo presenta i risultati per ottenere miscele di glicerolo all'80% (v/v), una serie di diluizione per gelatina metacriloil (GelMA) e idrogel a doppia rete del 5% (p/v) gelMA e 2% (p/v) alginato. È inclusa una guida alla risoluzione dei problemi per supportare gli utenti con l'adozione del protocollo. Il flusso di lavoro descritto può essere ampiamente applicato a una serie di materiali viscosi per generare concentrazioni definite dall'utente in modo automatizzato.

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An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Questo protocollo funge da tutorial completo per la miscelazione standardizzata e riproducibile di materiali viscosi con una nuova tecnologia di automazione open source. Vengono fornite istruzioni dettagliate sul funzionamento di una workstation open source di nuova concezione, sull'utilizzo di un progettista di protocolli open source e sulla convalida e verifica per identificare miscele riproducibili.

Una piattaforma tecnologica open source per la produzione di modelli di cultura 3D basati su idrogel in modo automatizzato e standardizzato

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

La ricerca biomedica sta affrontando una crisi di riproducibilità in quanto i nuovi risultati della ricerca sono raramente tradotti in applicazioni terapeutiche. Questo protocollo riduce il fattore umano e introduce l'automazione e la standardizzazione nella produzione. Questo metodo si concentra specificamente sugli idrogel fotocollegabili per applicazioni di coltura cellulare 3D poiché gli idrogel sono diventati la piattaforma più utilizzata nel cancro e in altri modelli di tessuto patologico nell'ultimo decennio.Abbiamo affrontato con successo le attuali limitazioni hardware e software con lo sviluppo di una piattaforma tecnologica open source. Questa piattaforma è stata specificamente progettata per gli idrogel e consente flussi di lavoro di produzione automatizzati per la ricerca sull'ingegneria tissutale. Per installare l'API, aprire l'interfaccia della riga di comando.Per installare l'API di lavoro, inserisci pip install openworkstation e premi Invio. Per utilizzare il modulo di bio fabbricazione del pipettaggio, immettere il comando per installare l'API opentrons. Quindi usa la riga di comando per aprire uno script Python e verificare se entrambe le API sono state installate correttamente.Per generare il codice di protocollo, aprire l'applicazione di progettazione del protocollo per generare uno script di protocollo personalizzato che verrà eseguito dalla piattaforma. L'interfaccia funziona su tutti i browser Internet comunemente usati. Immettere il nome del protocollo nella pagina di configurazione e fare clic su Continua.Nella configurazione del vassoio di alimentazione, selezionare il blocco di riscaldamento tre per quattro per definire il vassoio di alimentazione. Per definire i materiali e le concentrazioni di stock, selezionare Gel 1 dal menu Definisci input e immettere GelMA come nome. Impostare la concentrazione di stock su 20% e il numero di campioni su tre e fare clic su Aggiungi per salvare le voci e riempire la prima colonna.Selezionate Gel 2 dal menu Definisci ingressi e immettete Alginato come nome. Impostare la concentrazione di stock su 4% e il numero di campioni su tre e fare clic su Aggiungi per salvare le voci e riempire la seconda colonna. Dopo aver impostato i parametri del fotoiniziatore e del diluente come dimostrato, selezionare la reticolazione delle foto, impostare il tempo su 30 secondi e l'intensità su due e fare clic su OK. Quindi, impostare il tipo di piastra del pozzo su piastra del pozzo 96 e fare clic su Gruppo 1 per consentire di specificare i parametri per la creazione di idrogel a doppia rete.Quindi selezionare la casella Applica protocollo di miscelazione avanzato, se necessario, impostare il numero di campioni su 96 e fare clic su Continua. Per impostare il layout del mazzo, selezionare il tipo di vassoio appropriato per ogni slot. Quando tutti i tipi di vassoio sono stati selezionati, fare clic sulla casella di sinistra della pipetta e selezionare lo spostamento positivo da 10 a 100 microlitro dal menu a discesa.Impostare la velocità di aspirazione su 600 e la velocità di erogazione su 800. Quindi impostare i parametri corretti della pipetta nello stesso modo. Quindi fare clic su Genera protocollo per generare e salvare lo script del protocollo.Prima di eseguire il protocollo, spruzzare i materiali di consumo con etanolo al 70% e posizionarli in base alla configurazione definita nella configurazione dell'utente. Posizionare i tubi di reazione con i materiali nel blocco di alluminio sui dock di temperatura in base alla configurazione selezionata. Quindi, spruzzare i guanti con etanolo al 70% e aprire attentamente i tubi di reazione senza toccare i tubi aperti.Quando le sostanze hanno raggiunto la temperatura sperimentale appropriata, eseguire il protocollo generato utilizzando l'interfaccia utente. La postazione di lavoro inizierà con il processo di homing, seguito dall'ottenimento di una piastra di pozzo vuota dal modulo di archiviazione. Dopo aver rimosso il coperchio dalla piastra del pozzo, la piastra viene trasportata al modulo successivo.Il protocollo specifica il volume da pipettare da ciascuna soluzione madre e modifica automaticamente le punte dopo ciascun materiale per evitare contaminazioni incrociate. Per miscelare soluzioni viscose in modo riproducibile, la workstation esegue un protocollo di miscelazione specifico che è stato ottimizzato per idrogel viscosi. L'app di progettazione del protocollo tiene conto del livello di riempimento del serbatoio e adatta automaticamente l'altezza di miscelazione per evitare inutili immersioni nei materiali viscosi.Dopo la generazione automatica di modelli 3D e piastre di pozzo, la postazione di lavoro chiude nuovamente la piastra del pozzo con il coperchio e memorizza la piastra del pozzo nella posizione programmata nel modulo di stoccaggio. Una volta terminato il protocollo, rimuovere la piastra dal modulo di archiviazione. Per la convalida e la verifica del protocollo condotto, caricare la piastra su uno spettrofotometro e leggere l'assorbanza due volte a 450 nanometri.Dopo aver salvato i valori di assorbanza, aprire il foglio di calcolo di analisi fornito come materiale supplementare nella pubblicazione e copiare le letture di assorbanza nella tabella nella scheda tecnica grezza. Quindi fare clic sul foglio di analisi per visualizzare i valori medi, la deviazione standard e il coefficiente dei valori di varianza, che vengono calcolati e visualizzati automaticamente per una distribuzione uniforme del campione per righe specifiche e per colonne specifiche di una piastra a 96 pozzetti. Per trovare il setup che garantisce un'elevata riproducibilità delle soluzioni di glicerolo, sono stati generati protocolli senza controllo della temperatura e senza tip touch, con controllo della temperatura e senza tip touch, o con controllo della temperatura e con tip touch.Il coefficiente calcolato dei valori di variazione per le tre configurazioni ha rivelato un'influenza significativa del dock di temperatura e della funzione tip touch, evidenziando la capacità del protocollo di generare risultati altamente riproducibili quando si utilizzano entrambe le funzionalità. Utilizzando la funzione tip touch con il dock di temperatura, la deviazione standard è stata significativamente ridotta nella configurazione tre. Il tracciato dei valori di assorbanza del campione per la configurazione tre non ha prodotto valori crescenti o decrescenti durante l'esperimento e quindi non ha indicato alcuna influenza della posizione del campione sui valori di assorbanza.Successivamente, è stata preparata una serie di diluizioni GelMA diluendo una soluzione madre GelMA al 20% e valutando le differenze tra le diverse diluizioni GelMA. Il valore di assorbanza misurato in ogni fase di concentrazione era significativamente diverso e la regressione lineare ha dimostrato un elevato adattamento confermando la capacità di generare fasi di concentrazione distinte. Inoltre, l'influenza del tocco della punta è stata valutata per idrogel a doppia rete con 5% GelMA, 2% alginato e 0,15% LAP, che sono stati generati automaticamente con la configurazione.L'integrazione del tip touch si traduce in una significativa diminuzione della deviazione standard che supporta la generazione di un set di dati riproducibile. La visualizzazione dei valori di assorbanza e delle mappe termiche ha confermato la deviazione ridotta quando si utilizza il tocco della punta per rimuovere il materiale in eccesso dalla punta. La nostra tecnologia consente l'automazione della fabbricazione di idrogel per la coltura cellulare 3D e l'ingegneria tissutale.Si tratta di una soluzione a basso costo per aumentare il throughput e la riproducibilità di flussi di lavoro tecnicamente impegnativi. Fornendo un approccio open source personalizzabile, questa tecnologia apre la strada all'adattamento diffuso dell'automazione dei processi nella ricerca sull'ingegneria tissutale.

Research

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Bioengineering

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