Name: an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion
Uploaded: 2022-03-31T12:30:00
Duration: 8 min 29 s
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著者らは、QUTの再生医療センターのメンバー、特にアントニア・ホルストとパヴェル・ミェシュチャネクの有益な提案とフィードバックを認めている。この研究は、QUTのSEのための大学院研究賞と、助成金契約IC160100026(アディティブバイオマニュファクチャリングのARC産業変革トレーニングセンター)に基づくオーストラリア研究評議会(ARC)によって支援されました。NBは、National Health and Medical Research Council(NHMRC)Peter Doherty Early Career Research Fellowship(APP1091734)の支援を受けました。

CMとDWHはGelomics Pty Ltd.の創設者および株主であり、CMはGelomics Pty Ltd.の取締役でもあります。著者は、この記事の主題に関連する利益相反を宣言しません。著者は、開示されたものを除いて、記事で議論されている主題または資料に金銭的利益または財政的矛盾を有する組織または団体と、他の関連する所属または財政的関与を有しません。

粘性物質、特に生物医学的用途のためのヒドロゲル19,20,21,33,47のピペッティングは、ユーザー定義濃度または様々な濃度の希釈シリーズを調製するための多くの研究室における日常的な作業である。これは反復的であり、実行はかなり単純ですが、ほとんどの場合、サンプルスループットが低くて手動で実行されます18。このチュートリアルでは、粘性材料用に特別に設計されたオープンソースワークステーションの動作を紹介し、粘性材料の自動混合を可能にして、所望の濃度を再現可能に生成します。このワークステーションは、ハイドロゲルのピペッティングに最適化されており、温度応答性材料用の温度ドック、粘性材料用の正の変位ピペット、およびチップから余分な材料を除去するオプションのチップタッチドックの統合により、自動で信頼性の高い取り扱いを可能にします。ピペッティングモジュールは、標準化された自動化された方法で粘性材料の処理を可能にするために特別に最適化されています。エアクッションピペット(図5a)と比較して、容積式ピペット(図5b)は、先端に残留材料を残さずに粘性のある材料を分配し、正確な吸引量と分配量をもたらします。オプションのチップタッチドックは、チップから余分なサンプル材料を除去し(図5c、d)、これは接着剤材料(例えば、4%(w / v)アルギン酸塩)に有用である。
プロトコール設計アプリケーションは、ヒドロゲル用に特別にプログラムされており、異なる濃度の最大4つの試薬と最大2つの希釈剤の希釈が可能です。最終希釈の計算におけるエラーのリスクは、ユーザーが所望の濃度または段階希釈ステップのみを選択するため、このアプリケーションでは防止されます。必要な吸引量と分注量は自動的に計算され、別のドキュメントテキストファイルに保存され、プロトコルスクリプトに入力されます。このプロトコル設計アプリケーションは、ユーザーがすべての実験パラメータ(ピペッティング速度など)を完全に制御し、重要なパラメータの内部文書化を保証します。プロトコル設計アプリは、リザーバの充填レベル(例えば、ウェル)を考慮に入れ、粘性材料への不必要な浸漬を防ぐために吸引/分配高さを変化させる。この統合された機能は、先端の外壁への材料の蓄積を回避し、それによって、プロトコル全体にわたって信頼性の高い吸引および分配タスクを保証します。プロトコールデザイナーアプリケーションはヒドロゲル希釈ステップ用に開発されましたが、オレンジG染料などの非粘性液体の希釈にも使用できます。プロトコルデザイナーアプリケーションは、リポジトリの '/examples/publication-JoVE' からアクセス可能で、プロトコルのセクションで説明され、ビデオで強調表示されているバージョンです。このバージョンは更新されません。ただし、プロトコル・デザイナー・アプリケーションの更新バージョンは、メイン・リポジトリー・ページから入手できます。キャリブレーションターミナルは、最初にSanderson48によって開発され、正の変位ピペットのキャリブレーション用に最適化されています。
プロトコルセクション4で説明したように、ピペットと容器は最初に較正する必要があります。このキャリブレーションプロセスは、動きの増分を計算するために使用される位置を定義して保存するために重要です。したがって、プロトコルの実行が成功するかどうかは、キャリブレーションポイントを間違えるとチップがコンテナにクラッシュする可能性があるため、明確に定義されたキャリブレーション位置に依存します。ピペットのプランジャー位置は手動で校正する必要があるため、ピペッティングの精度と精度は、実行される校正に大きく依存します。これらの校正手順は、ピペッティングモジュールのユーザーエクスペリエンスに大きく依存するため、適切な校正手順を確実にするために、最初に経験豊富なスタッフとのトレーニングをお勧めします。ピペッティングモジュールの手動キャリブレーションに加えて、正確なピペッティングを保証するためにピペット自体をキャリブレーションする必要があります。ISO 8655で規定されている合格基準を満たすために、少なくとも12ヶ月ごとにピペットを校正することをお勧めします。ピペットキャリブレーションを内部的に評価するために、Stangegaard et al.16によって記述されているように、検証および検証が利用可能である。
信頼性の高いデータセットを生成するためには、高品質の試薬から始めることが重要です。これは、バッチ間の変動がこのプロトコル内で生成された結果に影響を与える可能性があるため、ヒドロゲル処理タスクにとって特に重要です。バッチ間の変動に加えて、少量の調製における微妙な変化も特性の違いに寄与する可能性がある。これを防ぐために、実験全体に使用できるより大きなボリュームの準備が推奨されます。
検証および検証手順は、信頼性の高い混合物を識別するために染料の使用法に依存しています。提示されたプロトコルは、Orange Gの適用を記述しているが、一般的なプロトコルおよび分析ワークフローは、蛍光色素にも適合させることができる49,50。オレンジGの使用は、分光光度計の技術的要件を低減し、光に曝露した後の蛍光色素の漂白を防止するために取られた予防措置を排除する。色素の溶解挙動またはクラスター形成における問題は、実験中に提示された材料では観察されていないが、他の材料では現れる可能性がある。潜在的なクラスター形成、したがって色素と物質との間の相互作用は、顕微鏡で容易に検出することができた。
このチュートリアルで紹介する手順と技術は、粘性材料の現在のワークフローに自動化機能を追加し、最小限の人的労力で信頼性の高いタスクを実現します。提供されているトラブルシューティング表 (表 2) には、特定された問題が含まれ、考えられる理由と問題を解決するための解決策が示されています。提示されたワークステーションは、自動ピペッティング作業のための天然(ゼラチン、ジェランガム、マトリゲル)および合成(例えば、ポリ(エチレングリコール)[PEG]、プルロニックF127、ルトロールF127)ポリマー材料に首尾よく適用されている。特に、オープンソースワークステーションと粘性材料用に設計されたオープンソースプロトコル設計アプリケーションの組み合わせは、生物医学工学、材料科学、微生物学の分野で働く研究者にとって非常に有用です。

再現性と再現性は、科学的な研究において最も重要です1,2,3,4。しかし、最近のエビデンスは、基礎科学におけるインパクトの大きい生物医学研究とトランスレーショナルリサーチを繰り返す上での重大な課題を強調しています4,5,6,7。再現不可能な結果に寄与する要因は、研究デザインが貧弱または偏っている6,8、不十分な統計的検出力3,9、報告基準への準拠の欠如7,10,11、出版圧力6、または利用できない方法やソフトウェアコード6,9など、複雑で多様です6,9.その中で、プロトコルの微妙な変化や実験実施における人為的ミスが、再現性の欠如を説明するさらなる要素として特定されています4。たとえば、手動ピペッティング作業では、個人内および個人間の不正確さがもたらされ12,13、人為的ミスの可能性が高まります14。市販の液体処理ロボットはこれらの欠点を克服し、液体の信頼性の向上を実証していますが15,16,17が、粘性特性が著しい材料の自動処理は依然として困難です。
市販の液体処理ロボットは、一般に、エアピストンまたは空気置換ピペットとも呼ばれるエアクッションピペットを使用します。試薬とピストンは、分注ステップ中に収縮し、吸引ステップ中に膨張するエアクッションによって分離される。エアクッションピペットを使用すると、粘性のある材料は先端にゆっくりと出入りするだけになり、リザーバからピペットを早期に引き抜くと気泡が吸引される可能性があります。分配作業中、粘性材料は、空気によって強制されたときにゆっくりとしか「流れない」フィルムを内先端壁に残す。これらの問題を克服するために、固体ピストンを用いて粘性材料を先端から積極的に押し出すために、正変位ピペットを商業的に導入した。これらの容積式ピペットは粘性材料の正確で信頼性の高い取り扱いを可能にしますが、容積式ピペットを使用した自動ソリューションは依然として学術実験室の設定には高価すぎるため、粘性物質を使用するほとんどのワークフローは手動ピペッティングタスクのみに依存しています18。
一般に、粘度は流体が流れる抵抗として定義され、粘性材料はさらに水の粘度(25°Cで0.89mPa・s)が大きい材料として定義されています。生物医学用途の分野では、実験セットアップは、ジメチルスルホキシド(DMSO;25°Cで1.99mPa·s)、グリセロール(90%グリセロール[v/v]に対して25°Cで208.1mPa·s)、Triton X-100(25°Cで240mPa·s)、およびヒドロゲルと呼ばれる水膨潤ポリマーなど、水よりも粘度の高い複数の材料を含むことがよくあります19。20。ヒドロゲルは、細胞封入、薬物送達、およびソフトアクチュエータを含む様々な用途に使用される物理的または/および化学的モードに配置された親水性ポリマーネットワークである19、20、21、22。ヒドロゲルの粘度は、ポリマー濃度および分子量に依存する19。生物医学的用途に日常的に使用されるヒドロゲルは、1〜1000mPa・sの粘度値を示すが、特定のヒドロゲル系は、最大6 x 107mPa·s19,23,24の値で報告されている。しかしながら、ヒドロゲルの粘度測定は、測定プロトコールおよびサンプル調製に関して標準化されていないため、異なる研究間の粘度値を比較することは困難である。
ヒドロゲル用に特別に設計された市販の自動ソリューションは不足しているか高価すぎるため、ヒドロゲルの現在のワークフローは手動処理に依存しています18。ヒドロゲルのピペッティングに関する現在の手動ベースのワークフローの限界を理解するには、本質的な取り扱いタスクを理解することが重要です18。例えば、新規なヒドロゲル材料が合成されると、所望の濃度または様々な濃度の希釈系列が生成され、その後の機械的特性の分析により、信頼性の高い合成プロトコルおよび架橋特性が同定される25、26、27、28.一般に、原液を調製または購入し、続いて希釈剤および/または他の試薬と混合して混合物を得る。混合タスクは、ほとんどの場合、ウェルプレート(または任意の出力形式)で直接実行されず、むしろ一般にマスターミックスと呼ばれる別の反応管で実行されます。これらの調製作業中に、粘性物質を移送し、試薬を混合し、混合物を出力フォーマット(例えば、96ウェルプレート)に移送するために、様々な吸引および分配ステップが必要である。これらの作業は、大量の人的労働18、長い実験時間を必要とし、不正確な結果として潜在的に現れる可能性のある人為的ミスの可能性を高めます。さらに、手作業による取り扱いにより、詳細な特性評価のためにさまざまなパラメータの組み合わせをスクリーニングするための高いサンプル番号の効率的な準備が妨げられます。手作業による処理は、医薬品開発中の有望な化合物の同定など、ハイスループットスクリーニング用途向けのヒドロゲルの使用を妨げます。現在の手動ベースの調製ステップでは、何千もの薬物からなる薬物ライブラリーをスクリーニングすることは現実的ではありません。これらの理由から、効率的な開発プロセスを提供し、薬物スクリーニング用途向けのヒドロゲルの翻訳を成功させるためには、自動化されたソリューションが必要です。
手動ベースのワークフローから自動プロセスに移行するために、温度応答性材料用の温度ドックの統合、キャピラリーピストンチップを使用した既製の容積式ピペットの使用、およびピペットチップ洗浄用のオプションのチップタッチドックにより、粘性材料の取り扱いのための商用オープンソースピペッティングロボットを最適化しました。このピペッティングロボットは、ピペッティングモジュールとして、すぐにインストールできカスタマイズ可能なモジュールで構成される新しく開発されたオープンソースワークステーションにさらに統合されました18,29。ハードウェアファイルやソフトウェアファイルを含む、開発されたワークステーションの詳細な組み立て手順は、GitHub(https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation)とZenodoリポジトリ(https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757)から自由にアクセスできます。ハードウェア開発に加えて、オープンソースのプロトコル設計アプリケーションがプログラムされ、リリースされ、パラメータ選択プロセスを通じてユーザーをガイドし、すぐに使用できるプロトコルコード(https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp)を生成します。このコードは、商用のオープンソースピペッティングロボットと開発されたオープンソースワークステーションで実行されます。
ここでは、粘性材料の混合タスクを自動化するためのオープンソースワークステーションの動作に関する包括的なチュートリアルを提供します(図1)。チュートリアル固有のプロトコル手順は、開発されたオープンソースワークステーションと商用オープンソースピペッティングロボットで実行できます。自社開発のオープンソースプロトコル設計アプリケーションによってサポートされ、グリセロール、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)およびアルギン酸塩に必要な濃度の自動混合および調製が実証されています。グリセロールは、十分に特徴付けられているため30,31、安価で容易に入手可能であり、したがって、自動ピペッティングタスクの粘性基準物質として一般的に使用されているため、このチュートリアルで選択されています。生物医学的用途に使用されるヒドロゲルの例として、GelMAおよびアルギン酸ヒドロゲル前駆体溶液が自動混合実験に適用されている。GelMAは、細胞封入研究のために最も一般的に使用されるヒドロゲルの1つを提示し32,33、および二重ネットワークヒドロゲルを製造する能力を実証するためにこの研究においてアルギン酸塩を選択した34,35。オレンジGを染料として使用して、分光光度計16で混合結果を検証および検証するために、迅速かつ安価な手順が実装されました。
商用のオープンソースピペッティングロボットは、開発されたオープンソースワークステーションにピペッティングモジュールとして統合されているため(図2a)、ピペッティングロボットを説明するために「ピペッティングモジュール」という名前がさらに使用されています。インストールされているハードウェアの詳細な説明は、このプロトコルの範囲外であり、オープンソースプラットフォームの一般アセンブリのためのステップバイステップの指示を含む、提供されているリポジトリを介して入手できます。ピペッティングモジュールには、軸A(右)と軸B(左)に取り付けられた2つのピペット(シングルチャンネルまたは8チャンネルピペット)を装備することができます(図2b)。ピペッティングモジュールは、米国規格協会/検査自動化およびスクリーニング協会(ANSI/SLAS)規格に準拠した10デッキ容量を提供し、デッキ上にはA1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E1、E2の位置が定義されています(図2c)。ヒドロゲル溶液の光誘起重合を開始するには、別の架橋モジュールが必要であり、ワークステーションに追加されています。架橋剤モジュールには波長400nmのLEDが装備されているため、可視光波長で励起する物質は、フェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)36,37などの現在のシステムで使用できます。LEDの強度(mW/cm2)は、プロトコル設計アプリケーションにおいて、架橋挙動を研究するためにユーザが対処することができる38。ワークステーションには、スループット研究の向上を可能にするストレージモジュールも含まれています。ただし、このモジュールはこの研究では使用されていないため、これ以上説明されていません。一般に、サンプルの汚染を避けるために、生物学的安全キャビネット内でピペッティングモジュールを操作することをお勧めします。ピペッティングモジュールを動作させるための主電源回路は12V回路で、ほとんどの国で低電圧アプリケーションと見なされています。すべての電気部品は専用のコントロールボックスに組み込まれており、ユーザーが電気的な危険の原因と接触するのを防ぎます。
これらの標準化された混合プロトコルに従うことで、研究者は粘性材料と非粘性材料の信頼性の高い混合物を自動化された方法で達成することができます。オープンソースのアプローチにより、ユーザーはミキシングシーケンスを最適化し、新しく開発されたプロトコルをコミュニティと共有できます。最終的に、このアプローチは、異なる因子間の相互依存性を調査するための複数のパラメータ組み合わせのスクリーニングを容易にし、それによって、生物医学的用途のための粘性材料の信頼性の高い適用および開発を加速する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:260px;">5 mL tubes</td>
			<td style="width:301px;">Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SCT-5ML</td>
			<td style="width:301px;">size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-432-22</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;70% w/w Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">LabChem, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">aja726-5Lpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">96-well plate</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Alginate</td>
			<td style="width:301px;">NovaMatrix</td>
			<td align="right" style="width:203px;">4200001</td>
			<td>https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Demineralized or ultrapure (MilliQ) water</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:260px;">Gelatin methacryloyl (GelMA)</td>
			<td style="width:301px;">Synthetized in-house</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:301px;">detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich, Inc. (USA)</td>
			<td align="right" style="width:203px;">900889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M4 and M5 Allen key</td>
			<td style="width:301px;">OpenBuilds, inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">179, 190</td>
			<td>also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">OrangeG</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific (USA)</td>
			<td style="width:203px;">O267-25</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14190-144</td>
			<td style="width:301px;">alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Equipment</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Aluminium blocks for temperature dock</td>
			<td style="width:301px;">Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SB16</td>
			<td>blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;Analytical balance</td>
			<td style="width:301px;">Sartorius AG (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">ED224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Open source liquid handling robot: commercial product</td>
			<td style="width:301px;">Opentrons Laboratories, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">OT-One S Pro</td>
			<td>https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td>Open source liquid handling robot: open source hardware</td>
			<td>Assembled in-house following an open source approach</td>
			<td></td>
			<td>hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Positive displacement pipette: MicromanE</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">FD10006</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">BMG LABTECH GmbH (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">CLARIOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips: capillary pistons</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">F148180</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion

粘性材料の現在の混合ステップは、主に低スループットモードで手動で実行される反復的で時間のかかるタスクに依存しています。これらの問題は、最終的に研究成果の再現性につながるワークフローの欠点を表しています。手動ベースのワークフローは、生物医学的用途に使用されるヒドロゲルなどの粘性材料の進歩と広範な採用をさらに制限しています。これらの課題は、標準化された混合プロセスで自動化されたワークフローを使用して再現性を高めることで克服できます。この研究では、オープンソースのプロトコル設計者の使用、オープンソースワークステーションの操作、および再現可能な混合物の特定について、段階的な手順を提示します。具体的には、オープンソースのプロトコル設計者は、実験的なパラメータ選択を通してユーザをガイドし、ワークステーションを操作するためのすぐに使用できるプロトコルコードを生成する。このワークステーションは、粘性材料のピペッティングに最適化されており、温度応答性材料用の温度ドック、粘性材料用の容積ピペット、およびピペットチップから余分な材料を除去するオプションのチップタッチドックの統合により、自動的かつ信頼性の高い取り扱いを可能にします。混合物の検証および検証は、オレンジGの迅速かつ安価な吸光度測定によって行われる。このプロトコルは、80%(v/v)グリセロール混合物、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)の希釈シリーズ、および5%(w/v)GelMAおよび2%(w/v)アルギン酸のダブルネットワークヒドロゲルを得るための結果を提示する。プロトコルの採用でユーザーをサポートするためのトラブルシューティングガイドが含まれています。記載されたワークフローは、多数の粘性材料に広く適用して、自動化された方法でユーザー定義の濃度を生成することができる。

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An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

このプロトコルは、粘性材料を新しいオープンソースの自動化技術と標準化された再現可能な混合のための包括的なチュートリアルとして機能します。新しく開発されたオープンソースワークステーションの操作、オープンソースプロトコル設計者の使用、および再現可能な混合物を識別するための検証と検証に関する詳細な手順が提供されています。

ヒドロゲルベースの3D培養モデルを自動化および標準化された方法で製造するためのオープンソース技術プラットフォーム

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

生物医学研究は、新しい研究成果が治療用途にはほとんど変換されないという点で再現性の危機に直面しています。このプロトコルは、人的要因を減らし、製造に自動化と標準化を導入します。この方法は、ヒドロゲルが過去10年以内に癌および他の疾患組織モデルにおいて最も使用されるプラットフォームとなっているため、3D細胞培養用途のための写真架橋性ヒドロゲルに特に焦点を合わせている。私たちは、オープンソースの技術プラットフォームの開発により、現在のハードウェアとソフトウェアの制限に首尾よく対処しました。このプラットフォームは、ヒドロゲル用に特別に設計されており、組織工学研究のための自動化された製造ワークフローを可能にします。API をインストールするには、コマンド行インターフェースを開きます。作業 API をインストールするには、「pip install openworkstation」と入力し、Enter キーを押します。ピペッティングバイオ製造モジュールを操作するには、opentrons APIをインストールするコマンドを入力します。次に、コマンド ラインを使用して Python スクリプトを開き、両方の API が正常にインストールされたかどうかを確認します。プロトコルコードを生成するには、プロトコル設計アプリケーションを開き、プラットフォームによって実行されるカスタマイズされたプロトコルスクリプトを生成します。インターフェイスは、一般的に使用されるすべてのインターネットブラウザ上で実行されます。セットアップ・ページでプロトコル名を入力し、「続行」をクリックします。給紙トレイの設定で、3 x 4 個の加熱ブロックを選択して給紙トレイを定義します。材料とストック濃度を定義するには、入力の定義メニューからゲル 1 を選択し、名前として GelMA と入力します。ストック濃度を20%、サンプル数を3に設定し、「追加」をクリックしてエントリを保存し、最初の列に入力します。入力の定義メニューからゲル 2 を選択し、名前として「アルギン酸」と入力します。ストック濃度を4%、サンプル数を3に設定し、「追加」をクリックしてエントリを保存し、2番目の列を埋めます。図に示すように光開始剤および希釈剤パラメータを設定した後、光架橋を選択し、時間を30秒に設定し、強度を2に設定して[OK]をクリックします。次に、ウェルプレートタイプを 96 ウェルプレートに設定し、「グループ 1」をクリックして、ダブルネットワークヒドロゲルを作成するためのパラメータを指定できるようにします。次に、必要に応じて [高度なミキシングプロトコルを適用] チェックボックスをオンにし、サンプル数を 96 に設定して、[続行] をクリックします。デッキレイアウトを設定するには、スロットごとに適切なトレイタイプを選択します。すべてのトレイタイプを選択したら、ピペットの左ボックスをクリックし、ドロップダウンメニューから10~100マイクロリットルの正の変位を選択します。吸引速度を 600 に設定し、ディスペンス速度を 800 に設定します。次に、同じ方法でピペットの正しいパラメータを設定します。次に、「プロトコルの生成」をクリックして、プロトコル・スクリプトを生成して保存します。プロトコルを実行する前に、消耗品に70%エタノールを噴霧し、ユーザー設定で定義された設定に従って配置します。選択したセットアップに従って、アルミニウムブロック内の材料を含む反応チューブを温度ドックの上に置きます。次に、手袋に70%エタノールをスプレーし、開いたチューブに触れずに反応チューブを慎重に開きます。物質が適切な実験温度に達したら、ユーザーインターフェイスを使用して生成されたプロトコルを実行します。ワークステーションはホーミングプロセスから始まり、ストレージモジュールから空のウェルプレートを取得します。ウェルプレートから蓋を取り外した後、プレートは次のモジュールに搬送される。このプロトコルは、各ストックソリューションからピペットでピペットされる量を指定し、交差汚染を防ぐために各材料の後のチップを自動的に変更します。粘性溶液を再現性のある方法で混合するために、ワークステーションは、粘性ヒドロゲル用に最適化された特定の混合プロトコルを実行する。プロトコル設計アプリは、リザーバの充填レベルを考慮に入れ、粘性材料への不必要な浸漬を防ぐために混合高さを自動的に適応させます。3Dモデルとウェルプレートの自動生成後、ワークステーションはウェルプレートを蓋で再び閉じ、ウェルプレートをストレージモジュール内のプログラムされた位置に保管します。プロトコルが完了したら、ストレージ・モジュールからプレートを取り外します。実施されたプロトコルの検証と検証のために、プレートを分光光度計にロードし、450ナノメートルで吸光度を2回読み取ります。吸光度値を保存した後、出版物に補足資料として提供されている分析スプレッドシートファイルを開き、吸光度測定値を生データシートの表にコピーします。次に、分析シートをクリックして平均値、標準偏差、分散係数の値を表示し、96ウェルプレートの特定の行および特定の列の均一なサンプル分布に対して自動的に計算および表示されます。グリセロール溶液の高い再現性を保証するセットアップを見つけるために、温度制御なしでチップタッチなしで、温度制御とチップタッチなしで、または温度制御とチップタッチでプロトコルを生成しました。3つのセットアップで計算された変動係数値は、温度ドックとチップタッチ機能の有意な影響を明らかにし、両方の機能を使用した場合に再現性の高い結果を生成するプロトコルの能力を強調しました。温度ドックでチップタッチ機能を使用すると、セットアップ3で標準偏差が大幅に減少しました。セットアップ3のサンプル吸光度値をプロットすると、実験全体を通して増減値は得られず、したがって、吸光度値に対するサンプル位置の影響は示されなかった。次に、20%GelMAストック溶液を希釈し、異なるGelMA希釈液間の差異を評価することによって、GelMA希釈シリーズを調製した。各濃縮ステップで測定された吸光度値は有意に異なり、線形回帰は、異なる濃縮ステップが生成される能力を確認する高い適合を実証した。さらに、セットアップで自動的に生成された5%GelMA、2%アルギン酸、および0.15%LAPのダブルネットワークヒドロゲルについて、先端タッチの影響を評価しました。先端タッチの統合により、再現可能なデータセットの生成をサポートする標準偏差が大幅に減少します。吸光度値とヒートマップの視覚化により、先端タッチを使用して先端から余分な材料を除去すると、偏差が減少することが確認されました。当社の技術は、3D細胞培養および組織工学のためのヒドロゲル製造の自動化を可能にします。これは、技術的に困難なワークフローのスループットと再現性を向上させる低コストのソリューションです。カスタマイズ可能なオープンソースアプローチを提供することにより、この技術は、組織工学研究におけるプロセス自動化の広範な適応への道を開きます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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