Name: an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion
Uploaded: 2022-03-31T12:30:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner medlemmene av senteret for regenerativ medisin ved QUT, spesielt Antonia Horst og Pawel Mieszczanek for deres nyttige forslag og tilbakemeldinger. Dette arbeidet ble støttet av QUTs Postgraduate Research Award for SE, og av Australian Research Council (ARC) under tilskuddsavtale IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). NB ble støttet av National Health and Medical Research Council (NHMRC) Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734).

CM og DWH er grunnleggere og aksjonærer i Gelomics Pty Ltd. CM er også direktør for Gelomics Pty Ltd. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt som er relevant for emnet i denne artikkelen. Forfatterne har ingen andre relevante tilknytninger eller økonomisk involvering med noen organisasjon eller enhet med økonomisk interesse i eller økonomisk konflikt med emnet eller materialet som er diskutert i artikkelen bortsett fra de som er avslørt.

Pipettering av viskøse materialer, spesielt hydrogeler for biomedisinske anvendelser19,20,21,33,47, er rutinemessige oppgaver i mange forskningslaboratorier for å forberede en brukerdefinert konsentrasjon eller en fortynningsserie med varierende konsentrasjoner. Selv om det er repeterende og utførelsen er ganske enkel, utføres den for det meste manuelt med lav prøvegjennomstrømning18. Denne opplæringen introduserer driften av en åpen kildekode-arbeidsstasjon, som er spesielt designet for viskøse materialer, for å muliggjøre automatisert blanding av viskøse materialer for reproduserbar generering av ønskede konsentrasjoner. Denne arbeidsstasjonen er optimalisert for pipettering av hydrogeler for å muliggjøre automatisert og svært pålitelig håndtering ved integrering av temperaturdokker for termoresponsive materialer, positive forskyvningspipetter for viskøse materialer og en valgfri berøringsdokk for å fjerne overflødig materiale fra spissen. Pipetteringsmodulen er spesielt optimalisert for å muliggjøre behandling av viskøst materiale på en standardisert og automatisert måte. Sammenlignet med luftputepipetter (figur 5a) dispenserer positive forskyvningspipetter (figur 5b) viskøse materialer uten å etterlate restmateriale igjen i spissen, noe som resulterer i nøyaktige aspirerende og dispenserende volumer. Den valgfrie berøringsdokken fjerner overflødig prøvemateriale fra spissen (figur 5c,d), som er nyttig for limmaterialer (f.eks. 4 % (w/v) alginat).
Protokolldesignerapplikasjonen er spesielt programmert for hydrogeler og tillater fortynning av opptil fire reagenser med forskjellige konsentrasjoner og opptil to fortynningsstoffer. Risikoen for feil i beregningen av endelige fortynninger forhindres i dette programmet, da brukerne bare velger ønsket konsentrasjon eller de serielle fortynningstrinnene. Nødvendige aspirerende og dispenserende volumer beregnes automatisk, lagres i en egen dokumentasjonstekstfil og fylles deretter ut i protokollskriptet. Denne protokolldesignapplikasjonen gir brukeren full kontroll over alle eksperimentelle parametere (f.eks. pipetteringshastighet) og sikrer intern dokumentasjon av de viktige parametrene. Protokolldesignappen tar hensyn til reservoarets fyllingsnivå (f.eks. godt) og varierer den aspirerende/ dispenserende høyden for å forhindre unødvendig dypping i de viskøse materialene. Denne integrerte funksjonen unngår materialakkumulering på spissens yttervegg, og sikrer dermed pålitelige aspirerende og dispenserende oppgaver gjennom hele protokollen. Selv om protokolldesignerapplikasjonen er utviklet for hydrogelfortynningstrinn, kan den også brukes til fortynning av ikke-utilcous væsker, for eksempel Orange G-fargestoffer. Protokolldesignerprogrammet, som er tilgjengelig via repositoriet under '/examples/publication-JoVE', er versjonen som er forklart i protokolldelen og uthevet i videoen. Denne versjonen vil ikke bli oppdatert. En oppdatert versjon av protokolldesignerprogrammet er imidlertid tilgjengelig via hovedrepositoriet. Kalibreringsterminalen ble opprinnelig utviklet av Sanderson48 og er optimalisert for kalibrering av positive forskyvningspipetter.
Som beskrevet i protokollen avsnitt 4, må pipetter og beholdere kalibreres i utgangspunktet. Denne kalibreringsprosessen er avgjørende for å definere og lagre posisjonene som deretter brukes til å beregne bevegelsesintervallene. Derfor er vellykket protokollutførelse avhengig av veldefinerte kalibreringsposisjoner, da feil kalibreringspunkter kan føre til krasj av spissen i en beholder. Siden pipettenes stempelposisjoner må kalibreres manuelt, avhenger pipetteringsnøyaktigheten og presisjonen sterkt av den utførte kalibreringen. Disse kalibreringsprosedyrene avhenger sterkt av brukeropplevelsen med pipetteringsmodulen, og derfor anbefales opplæring med erfarne ansatte i begynnelsen for å sikre riktige kalibreringsprosedyrer. I tillegg til den manuelle kalibreringen på pipetteringsmodulen, må pipetten selv kalibreres for å sikre nøyaktig pipettering. Det anbefales å kalibrere pipettene minst hver 12. For å evaluere pipettekalibrering internt er validering og verifisering tilgjengelig som beskrevet av Stangegaard et al.16.
For generering av et pålitelig datasett er det avgjørende å starte med reagenser av høy kvalitet. Dette er spesielt viktig for hydrogelbehandlingsoppgaver, da satsvise variasjoner kan påvirke de genererte resultatene i denne protokollen. I tillegg til batch-til-batch-variasjoner kan små endringer i utarbeidelsen av små volumer også bidra til egenskapsforskjeller. For å forhindre dette anbefales forberedelse av større volumer, som kan brukes til hele forsøkene.
Validerings- og verifiseringsprosedyrene er avhengige av bruk av fargestoff for å identifisere pålitelige blandinger. Den presenterte protokollen beskriver anvendelsen av Orange G, men den generelle protokollen og analysearbeidsflyten kan også tilpasses fluorescerende fargestoffer49,50. Bruken av Orange G reduserer de tekniske kravene til spektrofotometeret og eliminerer forholdsregler som tas for å forhindre bleking av fluorescerende fargestoffer etter eksponering for lys. Problemer i oppløsningsadferd eller klyngedannelse av fargestoffet har ikke blitt observert med de presenterte materialene under eksperimenter, men kan vises med andre materialer. Potensiell klyngedannelse og derfor kan samspillet mellom fargestoff og materiale lett oppdages med et mikroskop.
Prosedyrene og teknikkene som presenteres i denne opplæringen, legger til automatiseringsevne i gjeldende arbeidsflyter for viskøse materialer for å oppnå svært pålitelige oppgaver med minimal menneskelig arbeidskraft. Feilsøkingstabellen (tabell 2) inneholder identifiserte problemer og presenterer mulige årsaker i tillegg til løsninger for å løse problemene. Den presenterte arbeidsstasjonen har blitt brukt på naturlig (gelatin, gellan tyggegummi, matrigel) og syntetisk (f.eks. poly(etylenglykol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) polymere materialer for automatiserte pipetteringsoppgaver. Spesielt vil kombinasjonen av en åpen kildekode-arbeidsstasjon og en åpen kildekode-protokolldesignapplikasjon designet for viskøse materialer være svært nyttig for forskere som arbeider innen biomedisinsk ingeniørfag, materialvitenskap og mikrobiologi.

Reproduserbarhet og replikerbarhet er av avgjørende betydning i vitenskapelig arbeid1,2,3,4. Nyere bevis har imidlertid fremhevet betydelige utfordringer med å gjenta biomedisinske studier med stor innvirkning i grunnleggende vitenskap samt translasjonell forskning4,5,6,7. Faktorer som bidrar til uopprettelige resultater er komplekse og mangfoldige, for eksempel dårlig eller partisk studiedesign6,8, utilstrekkelig statistisk kraft3,9, manglende overholdelse av rapporteringsstandarder7,10,11, press for å publisere6, eller utilgjengelige metoder eller programvarekode6,9 . Blant dem har subtile endringer i protokollen og menneskelige feil i utførelsen av eksperimenter blitt identifisert som ytterligere elementer som står for irreproducibility4. For eksempel introduserer manuelle pipetteringsoppgaver intra- og interpersonlig upresision12,13 og øker sannsynligheten for menneskelige feil14. Mens kommersielle væskehåndteringsroboter er i stand til å overvinne disse ulempene og har vist økt pålitelighet for væsker15,16,17, er automatisert håndtering av materialer med betydelige viskøse egenskaper fortsatt utfordrende.
Kommersielle væskehåndteringsroboter bruker vanligvis luftputepipetter, også kjent som luftstempel eller luftforskyvningspipetter. Reagenset og stempelet er skilt av en luftpute som krymper under dispenseringstrinn og utvides under aspirerende trinn. Ved hjelp av luftputepipetter strømmer viskøse materialer bare sakte inn og ut av spissen, og tidlig tilbaketrekking av pipetten fra reservoaret kan føre til aspirasjon av luftbobler. Under dispenseringsoppgaver etterlater det viskøse materialet en film på den indre spissveggen som "strømmer" bare sakte eller ikke i det hele tatt når det blir tvunget med luft. For å overvinne disse problemene ble positive forskyvningspipetter introdusert kommersielt for aktivt å ekstrudere det viskøse materialet ut av spissen ved hjelp av et solidt stempel. Selv om disse positive forskyvningspipettene muliggjør nøyaktig og pålitelig håndtering av viskøse materialer, er automatiserte løsninger med positive forskyvningspipetter fortsatt for dyre for akademiske laboratorieinnstillinger, og derfor er de fleste arbeidsflyter med viskøse materialer utelukkende avhengige av manuelle pipetteringsoppgaver18.
Generelt er viskositet definert som motstanden til en væske å strømme, og viskøse materialer defineres videre som materialer med større viskositet av vann (0,89 mPa·s ved 25 °C). Innen biomedisinske anvendelser inneholder eksperimentelle oppsett ofte flere materialer med større viskositet enn vann, for eksempel dimetylsulfoksid (DMSO; 1,99 mPa·s ved 25 °C), glyserol (208,1 mPa·s ved 25 °C ved 90 % glyserol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s ved 25 °C) og vannhovne polymerer, referert til som hydrogeler19, 20. Hydrogeler er hydrofile polymernettverk arrangert i en fysisk eller/og kjemisk modus som brukes til ulike bruksområder, inkludert celleinnkapsling, legemiddellevering og myke aktuatorer19,20,21,22. Viskositeten til hydrogeler avhenger av polymerkonsentrasjonen og molekylvekten19. Rutinemessig brukte hydrogeler for biomedisinske applikasjoner viser viskositetsverdier mellom 1 og 1000 mPa·s, mens spesifikke hydrogelsystemer er rapportert med verdier på opptil 6 x 107 mPa·s19,23,24. Viskositetsmålinger av hydrogeler er imidlertid ikke standardisert når det gjelder måleprotokoll og prøvepreparering, og derfor er viskositetsverdier mellom forskjellige studier vanskelig å sammenligne.
Siden kommersielt tilgjengelige automatiserte løsninger spesielt designet for hydrogeler enten mangler eller er for dyre, er gjeldende arbeidsflyter for hydrogel avhengig av manuell håndtering18. For å forstå begrensningene i den nåværende manuelle arbeidsflyten for pipettering av hydrogeler, er det viktig å forstå viktige håndteringsoppgaver18. For eksempel, når et nytt hydrogelmateriale er syntetisert, genereres en ønsket konsentrasjon eller en fortynningsserie med varierende konsentrasjoner for å identifisere pålitelige synteseprotokoller og krysskoblingsegenskaper med etterfølgende analyse av de mekaniske egenskapene25,26,27,28 . Generelt fremstilles eller kjøpes en lagerløsning, og deretter blandes med et fortynningsmiddel og / eller andre reagenser for å oppnå en blanding. Blandingsoppgavene utføres for det meste ikke direkte i en brønnplate (eller noe utdataformat), og utføres heller i et eget reaksjonsrør, som ofte kalles mesterblanding. Under disse forberedelsesoppgavene kreves det ulike aspirerende og dispenseringstrinn for å overføre viskøse materialer, blande reagensene og overføre blandingen til et utdataformat (f.eks. en 96 brønnplate). Disse oppgavene krever en høy mengde menneskelig arbeidskraft18, lange eksperimentelle timer, og øker sannsynligheten for menneskelige feil som potensielt kan manifestere seg som unøyaktige resultater. Videre forhindrer manuell håndtering effektiv forberedelse av høye prøvetall for å screene ulike parameterkombinasjoner for detaljert karakterisering. Den manuelle behandlingen hindrer også bruk av hydrogeler for screeningapplikasjoner med høy gjennomstrømning, for eksempel identifisering av lovende forbindelser under narkotikautvikling. De nåværende manuelle forberedelsestrinnene er ikke gjennomførbare for å screene narkotikabiblioteker som består av tusenvis av stoffer. Av disse grunnene kreves automatiserte løsninger for å gi en effektiv utviklingsprosess og muliggjøre vellykket oversettelse av hydrogeler for narkotikascreeningsapplikasjoner.
For å gå fra manuelle arbeidsflyter til automatiserte prosesser, har vi optimalisert en kommersiell pipetteringsrobot med åpen kildekode for håndtering av viskøse materialer ved integrering av temperaturdokker for termoresponserende materialer, bruk av positive forskyvningspipetter utenfor hyllen ved hjelp av kapillære stempelspisser og en valgfri berøringsdokk for pipettespissrengjøring. Denne pipetteringsroboten er videre integrert som en pipetteringsmodul i en nyutviklet åpen kildekode-arbeidsstasjon, som består av ferdige og tilpassbare moduler18,29. Detaljerte monteringsinstruksjoner for den utviklede arbeidsstasjonen, inkludert maskinvare- og programvarefiler, er fritt tilgjengelige fra GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) og Zenodo-repositoriet (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). I tillegg til maskinvareutviklingen er en åpen kildekode-protokolldesignapplikasjon programmert og utgitt for å veilede brukeren gjennom parametervalgprosessen og generere en bruksklar protokollkode (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Denne koden kjører på den kommersielle open source pipetteringsroboten så vel som på den utviklede open source-arbeidsstasjonen.
Heri er det gitt en omfattende veiledning om driften av open source-arbeidsstasjonen for å automatisere blandingsoppgaver for viskøse materialer (figur 1). De opplæringsspesifikke protokolltrinnene kan utføres med den utviklede åpen kildekode-arbeidsstasjonen samt den kommersielle pipetteringsroboten med åpen kildekode. Støttet av en egenutviklet åpen kildekode protokoll design applikasjon, automatisert blanding og forberedelse av nødvendige konsentrasjoner for glyserol, gelatin methacryloyl (GelMA) og alginat er demonstrert. Glyserol har blitt valgt i denne opplæringen, siden den er godt karakterisert30,31, er den billig og lett tilgjengelig, og derfor brukes den ofte som viskøst referansemateriale for automatiserte pipetteringsoppgaver. Som eksempler på hydrogeler som brukes i biomedisinske anvendelser, er GelMA og alginathydrgelforløperløsninger brukt til automatiserte blandeforsøk. GelMA presenterer en av de mest brukte hydrogelene for celleinnkapslingsstudier32,33, og alginat ble valgt i denne studien for å demonstrere evnen til å produsere doble nettverkshydrgeler34,35. Ved hjelp av Orange G som fargestoff ble det implementert en rask og billig prosedyre for å validere og verifisere blandingsresultatene med et spektrofotometer16.
En kommersiell pipetteringsrobot med åpen kildekode er integrert som en pipetteringsmodul i den utviklede åpen kildekode-arbeidsstasjonen (figur 2a), og derfor brukes navnet 'pipetteringsmodul' videre til å beskrive pipetteringsroboten. En detaljert beskrivelse av den installerte maskinvaren er utenfor omfanget av denne protokollen og er tilgjengelig via de medfølgende repositoriene som også inkluderer trinnvise instruksjoner for den generelle monteringen av open source-plattformen. Pipetteringsmodulen kan utstyres med to pipetter (en- eller 8-kanals pipette) som er installert på akse A (høyre) og akse B (venstre) (figur 2b). Pipetteringsmodulen tilbyr en kapasitet på 10 dekk i henhold til american National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS) standarder, og følgende posisjonsposisjoner er definert på dekk: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (figur 2c). For å initiere fotoindusert polymerisering av hydrogelløsninger, er det nødvendig med en egen krysskoblingsmodul og er lagt til arbeidsstasjonen. Crosslinker-modulen er utstyrt med lysdioder med en bølgelengde på 400 nm, og derfor kan stoffer som begeistrer ved en synlig lysbølgelengde brukes med dagens systemer, for eksempel litiumfenyl-2,4,6 trimethylbenzoylfosponat (LAP)36,37. Intensiteten (i mW/cm2) av lysdiodene kan adresseres av brukeren i protokolldesignprogrammet for å studere krysskoblingsatferden38. Arbeidsstasjonen inneholder også en lagringsmodul for å muliggjøre økt gjennomstrømningsstudier; Denne modulen brukes imidlertid ikke i denne studien og er derfor ikke nærmere beskrevet. Generelt anbefales det å bruke pipetteringsmodulen i et biologisk sikkerhetsskap for å unngå prøveforurensning. Hovedstrømkretsen for å betjene pipetteringsmodulen er en 12 V-krets, som regnes som en lavspenningsapplikasjon i de fleste land. Alle elektriske komponenter er basert i en dedikert kontrollboks som hindrer brukere i å komme i kontakt med kilden til en elektrisk fare.
Ved å følge disse standardiserte blandeprotokollene kan forskere oppnå pålitelige blandinger for viskøse så vel som ikke-viskøse materialer på en automatisert måte. Åpen kildekode-tilnærmingen lar brukerne optimalisere blandingssekvenser og dele nyutviklede protokoller med samfunnet. Til syvende og sist vil denne tilnærmingen lette screeningen av flere parameterkombinasjoner for å undersøke gjensidig avhengighet mellom ulike faktorer og dermed akselerere pålitelig anvendelse og utvikling av viskøse materialer for biomedisinske applikasjoner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:260px;">5 mL tubes</td>
			<td style="width:301px;">Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SCT-5ML</td>
			<td style="width:301px;">size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-432-22</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;70% w/w Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">LabChem, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">aja726-5Lpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">96-well plate</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Alginate</td>
			<td style="width:301px;">NovaMatrix</td>
			<td align="right" style="width:203px;">4200001</td>
			<td>https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Demineralized or ultrapure (MilliQ) water</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:260px;">Gelatin methacryloyl (GelMA)</td>
			<td style="width:301px;">Synthetized in-house</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:301px;">detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich, Inc. (USA)</td>
			<td align="right" style="width:203px;">900889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M4 and M5 Allen key</td>
			<td style="width:301px;">OpenBuilds, inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">179, 190</td>
			<td>also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">OrangeG</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific (USA)</td>
			<td style="width:203px;">O267-25</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14190-144</td>
			<td style="width:301px;">alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Equipment</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Aluminium blocks for temperature dock</td>
			<td style="width:301px;">Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SB16</td>
			<td>blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;Analytical balance</td>
			<td style="width:301px;">Sartorius AG (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">ED224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Open source liquid handling robot: commercial product</td>
			<td style="width:301px;">Opentrons Laboratories, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">OT-One S Pro</td>
			<td>https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td>Open source liquid handling robot: open source hardware</td>
			<td>Assembled in-house following an open source approach</td>
			<td></td>
			<td>hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Positive displacement pipette: MicromanE</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">FD10006</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">BMG LABTECH GmbH (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">CLARIOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips: capillary pistons</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">F148180</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion

Nåværende blandingstrinn av viskøse materialer er avhengige av repeterende og tidkrevende oppgaver som hovedsakelig utføres manuelt i lav gjennomstrømningsmodus. Disse problemene representerer ulemper i arbeidsflyter som til slutt kan føre til uopprettelighet av forskningsfunn. Manuelle arbeidsflyter begrenser videre utviklingen og utbredt bruk av viskøse materialer, for eksempel hydrogeler som brukes til biomedisinske applikasjoner. Disse utfordringene kan løses ved å bruke automatiserte arbeidsflyter med standardiserte blandingsprosesser for å øke reproduserbarheten. I denne studien presenterer vi trinnvise instruksjoner for å bruke en åpen kildekode-protokolldesigner, for å drive en åpen kildekode-arbeidsstasjon og for å identifisere reproduserbare blandinger. Spesielt guider open source-protokolldesigneren brukeren gjennom det eksperimentelle parametervalget og genererer en bruksklar protokollkode for å betjene arbeidsstasjonen. Denne arbeidsstasjonen er optimalisert for pipettering av viskøse materialer for å muliggjøre automatisert og svært pålitelig håndtering ved integrering av temperaturdokker for termoresponsive materialer, positive forskyvningspipetter for viskøse materialer og en valgfri berøringsdokk for å fjerne overflødig materiale fra pipettespissen. Validering og verifisering av blandinger utføres ved en rask og billig absorbansmåling av Orange G. Denne protokollen presenterer resultater for å oppnå 80% (v / v) glyserolblandinger, en fortynningsserie for gelatinmetakryloyl (GelMA), og doble nettverkshydrgeler på 5% (w / v) GelMA og 2% (w / v) alginat. En feilsøkingsveiledning er inkludert for å støtte brukere med protokolladopsjon. Den beskrevne arbeidsflyten kan brukes bredt på en rekke viskøse materialer for å generere brukerdefinerte konsentrasjoner på en automatisert måte.

Denne opplæringen presenterer resultater for eksperimenter med glyserol (figur 3) og GelMA med LAP og alginat (figur 4).
Genereringen av en 80 % (v/v) glyserolløsning ble undersøkt enten uten temperaturkontroll (romtemperatur, 22 °C) og uten tuppberøring (definert som oppsett 1), med temperaturkontroll (40 °C) og uten tuppberøring (oppsett 2), eller med temperaturkontroll (40 °C) og med tuppberøring (oppsett 3) (figur 3a-i). Disse to temperaturinnstillingene ble valgt for å evaluere håndteringsforskjellen, siden glyserolens viskositet avtar nesten med en faktor på 3 ved oppvarming fra 22 °C (139,5 mPa·s) til 40 °C (46,6 mPa·s)30. En 85% (v / v) lagerløsning av glyserol ble fortynnet til en endelig konsentrasjon på 80% og jevnt fordelt på en 96 brønnplate (n = 96 per oppsett). Den eksperimentelle tiden, som inkluderer dispensering av hvert materiale i blandingsrøret, de respektive blandingsoppgavene og prøvefordelingen til en 96 brønnplate, var 30 min 42 s. For å identifisere forskjeller mellom fortynningsblandinger ble ultrarent vann – som fortynningsmiddel for glyserol – tilberedt med 1 mg/ml oransje G. Absorbansavlesningene fremhever at integreringen av temperaturkontrollen og spissberøringen påvirker blandingene betydelig (p < 0,0001). I tillegg til den utførte toveis variansanalysen (ANOVA) ble CV-verdiene beregnet for å evaluere det relative standardavviket. Variasjonskoeffisienten beskriver en standardisert indikator for å identifisere graden av avvik i forhold til gjennomsnittet og uttrykkes i prosent. Hvis utvalgsmidlene ikke er spesielt interessepunktet, men variasjonen i målingene, gir variasjonskoeffisienten ytterligere innsikt for å identifisere reproduserbare blandinger46. Innenfor dette eksperimentet med tre forskjellige oppsett viste absorbansverdiene synkende CV-verdier fra henholdsvis 5,6 %, 4,2 % til 2,0 % for oppsett 1, oppsett 2 og oppsett 3, noe som viser den betydelige påvirkningen av temperaturdokken og berøringsfunksjonen for spissen på å produsere pålitelige resultater (figur 3a-ii). Plotting av prøveabsorberingsverdier for oppsett 3 (prøvenummer #1 til #96 i en 96 brønnplate) gir ingen økende eller synkende verdier gjennom hele eksperimentet, og indikerer derfor ingen påvirkning av prøveposisjonen på absorbansverdiene (figur 3a-iii). Visualisering av dataene for hver målte brønnplate med varmekart gir ytterligere innsikt for å identifisere heterogeniteter for en bestemt rad eller kolonne, eller varierende absorberingsverdier gjennom dispenseringsoppgavene. De visualiserte varmekartene for de tre oppsettene viser reduserte heterogeniteter på tvers av hele brønnplatene fra oppsett 1 til oppsett 3 (figur 3b). Til slutt ble replikerbarheten av den utførte blandingen evaluert innen åtte uavhengige løp (figur 3c-i,ii), hvor hvert løp tok 6 min 57 s. Enkeltblandingskjøringer viste lave CV-verdier mellom 1,1 % og 2,6 %, noe som indikerer svært pålitelige blandings- og dispenseringsoppgaver for de enkelte kjøringene. Absorbansverdier for alle åtte kjøringene ga en CV-verdi på 3,3 % og demonstrerte reproduserbarheten til den etablerte blandeprotokollen.
GelMA-fortynningsserien ble utarbeidet ved å fortynne en 20% (w / v) lagerløsning med PBS til 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 og 0% (w / v) og legge LAP til en konstant konsentrasjon på 0,15% (w / v) (figur 4a-i), som tok totalt 55 min 12 s. Som spesifisert i det eksperimentelle protokollskriptet, var hydrogelen krysskobling i 30 s med en intensitet på 2,0 mW/cm2 ved 400 nm. For å evaluere forskjellene mellom blandingene, PBS ―som fortynningsmiddel for GelMA og alginat―ble tilberedt med 1 mg / ml Orange G. Derfor er absorbansforskjell mellom prøver i en blanding så vel som mellom serielle fortynninger identifisert med et spektrofotometer. Målte absorbansverdier for hvert konsentrasjonstrinn er signifikant forskjellige (p < 0,0001) og har svært lave CV-verdier mellom 1,2% og 3,4% gjennom konsentrasjonstrinnene (n = 12 per konsentrasjonstrinn). Lineær regresjon viste høy passform med en R²-verdi på 0,9869 (figur 4a-ii) og et varmekart bekreftet den homogene fordelingen for hver konsentrasjon og forskjellen mellom konsentrasjonene (figur 4a-iii). Automatisert blanding av fire reagenser ble utført for generering av 5% (w/v) GelMA, 2 % (w/v) alginat, 0,15 % (w/v) LAP og PBS som fortynningsmiddel uten (oppsett 2) og med (oppsett 3) berøringstips (n = 96 for hvert oppsett) med de samme krysskoblingsparametrene (30 s, 2,0 mW/cm2, 400 nm). Utlevering av de fire materialene, blanding og distribusjon i en 96 brønnplate tok 32 min 22 s. Alle eksperimenter med GelMA og alginat ble utført ved 37 °C for å forhindre termisk gelling som forhindrer pipettering av GelMA. Med berøringsalternativet ble CV-verdien redusert fra 5,2% til 3,4%, og spesielt ble outliers i nedre region forhindret ved å fjerne overflødig materiale fra spissen (figur 4b-i). Selv om gjennomsnittsverdien på 1,927 og 1,944 for oppsett 2 og oppsett 3 er svært nær, fremhever variasjonskoeffisienten det synkende avviket i forhold til gjennomsnittet. Enkeltrader på 96 brønnplaten kan sammenlignes med hverandre ved hjelp av en varmekartvisualisering for å oppdage rad- og/eller kolonneforskjeller (figur 4b-ii).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig1.jpg"> Figur 1: Protokollarbeidsflyt med individuelle oppgaver. Den beskrevne arbeidsflyten er delt inn i sju oppgaver, som er delt inn i oppsett, klargjøring, utførelse og analyse. I begynnelsen må programvaren (oppgave 1) og maskinvaren (oppgave 2) være konfigurert. Etter utarbeidelsen av materialene (oppgave 3) og genereringen av protokollskriptet (oppgave 4), kalibreres pipetteringsmodulen ved å definere pipette- og beholderposisjonene (oppgave 5). Deretter utføres protokollskriptet på arbeidsstasjonen (oppgave 6) og validering og verifisering (oppgave 7) av blandinger utføres for å evaluere blandinger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig2.jpg"> Figur 2: Arbeidsstasjon med åpen kildekode og dekkoppsett av pipetteringsmodulen. (a) Den utviklede arbeidsstasjonen er inspirert av en samlebåndstilnærming, der prøver transporteres gjennom forskjellige moduler, og består av følgende moduler: pipettering, krysskobling, lagring, transport og beregningsmodul. (b) Dekk til pipetteringsmodulen er satt opp avhengig av eksperimentell layout (f.eks. brønnplatetype, rørvolum, etc.). Det viste dekkoppsettet ble brukt til de presenterte eksperimentene og består av positive forskyvningspipetter med et område fra 10-100 μL (M100E) og 100−1000 μL (M 1000E), spissstativene med kapillære stempler (CP) for 100 μL (CP1000) og 1000 μL (CP1000), en søppelbeholder, en blandebrett, og en inngangsskuff for inngangsreagensene. (c) Tilgjengelige dekkposisjoner defineres med tallene som vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig3.jpg"> Figur 3: Resultater for automatisert pipettering av glyserolblandinger. (a) Den fleksible arbeidsstasjonsutformingen gjør det mulig å evaluere tre forskjellige oppsett (i) for å identifisere optimale parametere for reproduserbare resultater. (ii) Tilsetning av en tupp berøring og oppvarming av materialet resulterte i en redusert varianskoeffisient (CV) verdier og svært reproduserbare blandinger for oppsett 3. Hvert eksperiment ble utført med 96 prøver. (iii) Plotting av enkeltprøveverdier viste ingen påvirkning på pipetteringssekvensen. (b) Eksperimentelle resultater fra hvert oppsett ble visualisert med varmekart for å identifisere påvirkningen på rå/kolonneforskjeller, kanter eller hovedblanding. (c) Reproduserbarheten til oppsett 3 ble analysert innen åtte uavhengige kjøringer ved hjelp av (i) median, standardavvik, CV-verdi og (ii) varmekart. Data i panelene a-ii (n = 96) og b-i (n = 12) presenteres med midler og enkeltdatapunkt. Statistisk signifikans ble definert som ****p < 0,0001 ved hjelp av toveis variansanalyse (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig4.jpg"> Figur 4: Resultater for blanding av oppgaver med hydrogeler. (a) Fra en gelatin metacryloyl (GelMA) 20% (w / v) lagerløsning, ble en seriell fortynning av 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 og 0% (w / v) generert innen ett eksperimentelt løp ved hjelp av en 96 brønnplate (n = 12 per konsentrasjon). (i) Varianskoeffisienten (CV) varierte mellom 1,2 % og 3,4 % gjennom de tilberedte konsentrasjonene, og (ii) lineær regresjon viste en høy passform med en R²-verdi på 0,9869. (iii) Homogene fortynninger ble bekreftet visuelt med det genererte varmekartet. (b) Doble nettverkshydrgeler ble generert med 5 % (w/v) GelMA, 2 % (w/v) alginat og 0,15 % (w/v) LAP (i) med og uten tuppberøring (n = 96 for hvert oppsett) og krysskoblet i 30 s med en intensitet på 2,0 mW/cm2 ved 400 nm. Integreringen av tipsberøringen resulterte i reduserte CV-verdier fra 5,2 % til 3,4 %. (ii,iii) Varmekart bekrefter færre avvik ved bruk av tuppberøring for å fjerne overflødig materiale fra spissen. Data i paneler a-i og b-i presenteres med midler og enkeltdatapunkter. Statistisk signifikans ble definert som *p < 0,05, ***p < 0,001 og ****p < 0,0001 ved hjelp av enveisvariasjonsanalyse (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig5.jpg"> Figur 5: Oppsummering av pipettetypeforskjellen og problemer med viskøse biomaterialer. (a) Reagenset og stempelet er adskilt av en luftpute som krymper under dispenseringstrinn og utvides under aspirerende trinn. Når du aspirerer og dispenserer viskøse materialer, introduserer den langsomme "strømmen" problemer som luftbobler og uregelmessig pipetteringsadferd. (b) Positive forskyvningspipetter muliggjør pålitelig aspirering og dispensering av viskøst materiale ved bruk av et stempel inne i spissen. (c) Pipettering av svært viskøse materialer (f.eks. 4% (w/v) alginat) kan resultere i opphopning av overflødig materiale på spissen, noe som fører til unøyaktighet gjennom forsøkene. (d) Implementeringen av en enkel berøringsskuff gjør det mulig å fjerne overflødig materiale på spissen og resulterer i nøyaktige aspirerende og dispenserende volumer. Dette realiseres ved å bruke innsiden av brønnplatelokket plassert på en spissstativbeholder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:font-size="9px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Materiale #1 (lagerkonsentrasjon)</td>
			<td>Endelig konsentrasjon av materiale #1</td>
			<td>Materiale #2 (lagerkonsentrasjon)</td>
			<td>Endelig konsentrasjon av materiale #2</td>
			<td>Materialer #3 (lagerkonsentrasjon)</td>
			<td>Endelig konsentrasjon av materiale #3</td>
			<td>Fortynningsmiddel (Orange G arbeidsløsning)</td>
			<td>Endelig Orange G-konsentrasjon i blanding</td>
			<td>Vist i figur</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glyserol (85 % (m/v))</td>
			<td>80 % (m/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>vann (1 mg/ml oransje G)</td>
			<td>0,059 mg/ml</td>
			<td>Figur 3a-c</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20 % (uten v))</td>
			<td>0 % (m/v)</td>
			<td>RUNDE (3 % (m/v))</td>
			<td>0,15 % (med/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/ml oransje G)</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20 % (uten v))</td>
			<td>2 % (m/v)</td>
			<td>RUNDE (3 % (m/v))</td>
			<td>0,15 % (med/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/ml oransje G)</td>
			<td>0,85 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20 % (uten v))</td>
			<td>4 % (m/v)</td>
			<td>RUNDE (3 % (m/v))</td>
			<td>0,15 % (med/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/ml oransje G)</td>
			<td>0,75 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20 % (uten v))</td>
			<td>6 % (med/v)</td>
			<td>RUNDE (3 % (m/v))</td>
			<td>0,15 % (med/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/ml oransje G)</td>
			<td>0,65 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20 % (uten v))</td>
			<td>8 % (m/v)</td>
			<td>RUNDE (3 % (m/v))</td>
			<td>0,15 % (med/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/ml oransje G)</td>
			<td>0,55 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20 % (uten v))</td>
			<td>10 % (med/v)</td>
			<td>RUNDE (3 % (m/v))</td>
			<td>0,15 % (med/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/ml oransje G)</td>
			<td>0,45 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20 % (uten v))</td>
			<td>12 % (m/v)</td>
			<td>RUNDE (3 % (m/v))</td>
			<td>0,15 % (med/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/ml oransje G)</td>
			<td>0,35 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20 % (uten v))</td>
			<td>14 % (med/v)</td>
			<td>RUNDE (3 % (m/v))</td>
			<td>0,15 % (med/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/ml oransje G)</td>
			<td>0,25 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20 % (uten v))</td>
			<td>5 % (m/v)</td>
			<td>Alginat (4 % (m/v))</td>
			<td>2 % (m/v)</td>
			<td>RUNDE (3 % (m/v))</td>
			<td>0,15 % (med/v)</td>
			<td>PBS (1 mg/ml oransje G)</td>
			<td>0,2 mg/ml</td>
			<td>Figur 4b</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Parameteroversikt for de utførte forsøkene.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Protokolltrinn</td>
			<td>Problem</td>
			<td>Mulig årsak</td>
			<td>Løsning</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1</td>
			<td>Programvaren kan ikke installeres eller oppdateres</td>
			<td>Går tom for diskplass på SD-kort</td>
			<td>Kontroller diskplassen på SD-kortet. Fjern om nødvendig unødvendige varer, tøm papirkurven eller bruk et SD-kort med riktig størrelse</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>API kan ikke installeres</td>
			<td>Brukeres mulighet for installasjon er begrenset (ingen rotbrukertillatelse)</td>
			<td>Bruk sudo-kommandoen foran angitte kommandoer for å få administratorrettigheter. I Linux er denne typen tilgang kjent som superbrukeren.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3.1</td>
			<td>Problemer med GelMA</td>
			<td>Funksjonalisering, dialyse eller lyofilisering</td>
			<td>Detaljert trinnvis protokoll, inkludert feilsøkingsliste tilgjengelig i Loessner et al.33.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.1 og 6.2</td>
			<td>Arbeidsstasjonen reagerer ikke på kommandoer</td>
			<td>Problemer med tilkobling</td>
			<td>Slå av alt og slå av datamaskinen. Slå av strømforsyningen i 10 s. Slå på strømdatamaskinen og arbeidsstasjonen igjen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.1 og 6.2</td>
			<td>Arbeidsstasjonen reagerer ikke på kommandoer</td>
			<td>Problemer med tilkobling</td>
			<td>Kontroller om datamaskinen gjenkjenner USB-tilkoblingen og USB-porten er riktig definert. Kontroller at brannmuren ikke hindrer tilkoblingsprosessen (se koblingen under tabell 2).</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.1 og 6.2</td>
			<td>Kan ikke åpne filen</td>
			<td>Feil katalog</td>
			<td>Kontroller mappedirektøren (mappebanen) for å sikre at riktig bane brukes. Hvis en fil (f.eks. interface.py) ikke blir funnet, er det sannsynlig at feil bane brukes.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Spissen er ikke ordentlig festet eller faller under bevegelse</td>
			<td>Kalibreringsproblem</td>
			<td>Gjenta kalibreringstrinnene for pipetten, og kontroller at kapillærstempelet er riktig koblet til pipetten.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Spissen er ikke ordentlig festet eller faller under bevegelse</td>
			<td>Problem med vedlegg</td>
			<td>Pipette er ikke riktig koblet til pipetteaksen og beveger seg under bevegelsestrinnene. Stram skruene godt for å unngå dette.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Tipset aspirerer over materiale</td>
			<td>Kalibreringsproblem</td>
			<td>Gjenta kalibreringen av denne skufftypen for å definere høyden riktig.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Tipset aspirerer over materiale</td>
			<td>Kalibreringsproblem</td>
			<td>Kontroller volumet i røret, og kontroller at volumet er lik volumet som er definert i protokollutformingsprogrammet.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Materialet dypper under bevegelse</td>
			<td>For mye overflødig materiale på spissen</td>
			<td>Legg til alternativet for berøringsdokk med tupp. Eventuelt kan også tiden for tuppberøring økes.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Materialet er fast eller for viskøst for pipettering</td>
			<td>Termoresponsiv oppførsel av materiale</td>
			<td>Kontroller karakterisering av termoresponsivt materiale og juster oppvarmings-/kjøletemperaturen til temperaturdokken tilsvarende.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Feilsøkingstabell med identifiserte problemer, mulige årsaker samt løsninger for å løse problemene.
Tilleggsfil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/supplementary_template-analysis.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion at JoVE.com

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Denne protokollen fungerer som en omfattende opplæring for standardisert og reproduserbar blanding av viskøse materialer med en ny åpen kildekode-automatiseringsteknologi. Detaljerte instruksjoner er gitt om driften av en nyutviklet åpen kildekode-arbeidsstasjon, bruk av en åpen kildekode-protokolldesigner og validering og verifisering for å identifisere reproduserbare blandinger.

En åpen kildekode-teknologiplattform for produksjon av Hydrogel-baserte 3D-kulturmodeller på en automatisert og standardisert måte

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Biomedisinsk forskning står overfor en reproduserbarhetskrise ved at nye forskningsfunn sjelden oversettes til terapeutiske anvendelser. Denne protokollen reduserer den menneskelige faktoren og introduserer automatisering og standardisering i produksjon. Denne metoden fokuserer spesielt på fotokryssbare hydrogeler for 3D-cellekulturapplikasjoner, da hydrogeler har blitt den mest brukte plattformen i kreft og andre sykdomsvevsmodeller i løpet av det siste tiåret.Vi har løst de nåværende maskinvare- og programvarebegrensningene med utviklingen av en åpen kildekode-teknologiplattform. Denne plattformen er spesielt designet for hydrogeler og muliggjør automatiserte produksjonsarbeidsflyter for vevsteknikkforskning. Hvis du vil installere APIen, åpner du kommandolinjegrensesnittet.For å installere arbeids-API-en, skriv inn pip install openworkstation og trykk Enter. For å betjene pipettering bio fabrikasjonsmodulen, skriv inn kommandoen for å installere opentrons API. Bruk deretter kommandolinjen til å åpne et Python-skript og kontrollere om begge APIene er installert.Hvis du vil generere protokollkoden, åpner du protokollutformingsprogrammet for å generere et tilpasset protokollskript som skal kjøres av plattformen. Grensesnittet kjører på alle vanlige nettlesere. Skriv inn protokollnavnet på oppsettsiden, og klikk Fortsett.I oppsettet av innskuffen velger du tre ganger fire varmeblokker for å definere inngangsskuffen. Hvis du vil definere materialene og lagerkonsentrasjonene, velger du Gel 1 på menyen for definering av innganger og angir GelMA som navn. Sett lagerkonsentrasjonen til 20 %, og antall prøver til tre, og klikk Legg til for å lagre oppføringene og fylle den første kolonnen.Velg Gel 2 på menyen definer inndata, og angi Alginate som navn. Sett lagerkonsentrasjonen til 4 % og antall prøver til tre, og klikk Legg til for å lagre oppføringene og fylle den andre kolonnen. Når du har angitt fotoinitiatoren og fortynningsparametrene som demonstrert, velger du krysskobling av bilder, setter tiden til 30 sekunder og intensiteten til to og klikker OK. Sett deretter brønnplatetypen til 96 brønnplate og klikk på Gruppe 1 for å la parametrene for å lage doble netthydrgeler spesifiseres.Merk deretter av for Bruk avansert blandeprotokoll om nødvendig, sett antall prøver til 96, og klikk Fortsett. Hvis du vil angi dekkoppsettet, velger du riktig skufftype for hvert spor. Når alle skufftypene er valgt, klikker du på pipetten til venstre og velger 10 til 100 mikroliter positiv forskyvning fra rullegardinmenyen.Sett den aspirerende hastigheten til 600 og dispenseringshastigheten til 800. Sett deretter pipetterettighetsparametrene på samme måte. Klikk deretter Generer protokoll for å generere og lagre protokollskriptet.Før du utfører protokollen, spray forbruksvarer med 70% etanol og plasser dem i henhold til oppsettet som er definert i brukeroppsettet. Plasser reaksjonsrørene med materialene i aluminiumsblokken på temperaturdokkene i henhold til det valgte oppsettet. Spray deretter hanskene dine med 70% etanol og åpne reaksjonsrørene forsiktig uten å berøre åpne rør.Når stoffene har nådd riktig eksperimentell temperatur, kjører du den genererte protokollen ved hjelp av brukergrensesnittet. Arbeidsstasjonen vil begynne med homing-prosessen, etterfulgt av å få en tom brønnplate fra lagringsmodulen. Etter at lokket er fjernet fra brønnplaten, transporteres platen til neste modul.Protokollen spesifiserer volumet som pipetteres fra hver lagerløsning og endrer automatisk spissene etter hvert materiale for å forhindre krysskontaminering. For å blande viskøse løsninger på en reproduserbar måte, utfører arbeidsstasjonen en spesifikk blandeprotokoll som er optimalisert for viskøse hydrogeler. Protokolldesignappen tar hensyn til reservoarets fyllingsnivå og tilpasser automatisk blandehøyden for å forhindre unødvendig dypping i de viskøse materialene.Etter automatisk generering av 3D-modeller og brønnplater lukker arbeidsstasjonen brønnplaten med lokket igjen og lagrer brønnplaten i programmert posisjon i lagringsmodulen. Når protokollen er ferdig, fjerner du platen fra lagringsmodulen. For validering og verifisering av den utførte protokollen, last platen på et spektrofotometer og les absorbansen to ganger ved 450 nanometer.Når du har lagret absorbansverdiene, åpner du analyseregnearkfilen som leveres som tilleggsmateriale i publikasjonen, og kopierer absorbansavlesningene til tabellen i rådataarket. Klikk deretter på analysearket for å vise gjennomsnittsverdiene, standardavviket og variansens koeffisient, som automatisk beregnes og vises for en jevn utvalgsfordeling for bestemte rader og for bestemte kolonner på en 96 brønnplate. For å finne oppsettet som sikrer høy reproduserbarhet for glyserolløsninger, ble protokoller generert uten temperaturkontroll og uten spiss berøring, med temperaturkontroll og uten spiss berøring, eller med temperaturkontroll og med spiss berøring.Den beregnede variasjonskoeffisienten for de tre oppsettene viste en betydelig påvirkning av temperaturdokken og berøringsfunksjonen, og fremhevet protokollens evne til å generere svært reproduserbare resultater når de ble brukt begge funksjonene. Ved hjelp av berøringsfunksjonen med temperaturdokken ble standardavviket betydelig redusert i oppsett tre. Plotting av prøveabsorberingsverdiene for oppsett tre ga ingen økende eller synkende verdier gjennom hele eksperimentet og indikerte derfor ingen påvirkning av prøveposisjonen på absorbansverdiene.Deretter ble en GelMA-fortynningsserie utarbeidet ved å fortynne en 20% GelMA-lagerløsning og vurdere forskjellene mellom forskjellige GelMA-fortynninger. Absorbansverdien målt ved hvert konsentrasjonstrinn var betydelig forskjellig, og lineær regresjon viste en høy passform som bekreftet evnen til distinkte konsentrasjonstrinn som skulle genereres. I tillegg ble påvirkningen av tip touch evaluert for doble nettverkshydrgeler med 5% GelMA, 2% alginat og 0,15% LAP, som automatisk ble generert med oppsettet.Integreringen av tuppberøring resulterer i en betydelig reduksjon av standardavviket som støtter genereringen av et reproduserbart datasett. Visualisering av absorbansverdiene og varmekartene bekreftet det reduserte avviket ved bruk av tuppberøring for å fjerne overflødig materiale fra spissen. Vår teknologi muliggjør automatisering av hydrogelproduksjon for 3D-cellekultur og vevsteknikk.Det er en rimelig løsning for å øke gjennomstrømningen og reproduserbarheten til teknisk utfordrende arbeidsflyter. Ved å tilby en tilpassbar åpen kildekode-tilnærming, baner denne teknologien vei for den utbredte tilpasningen av prosessautomatisering i vevsteknikkforskning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: en Automated Plattform for Biomasse enzym Discovery og Cocktail Optimization

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Utvikling av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform til Test kontaktlinser

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

En additiv produksjon teknikk for lettvinte og rask fabrikasjon av Hydrogel-basert Micromachines med magnetisk forståelsesfull komponenter

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En av beryllium gjennomstrømming Microfluidic plattform for enkeltceller genomet sekvensering

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En kirurgiske teknikken som grunnlag for i Vivo delvis leveren Engineering i rotte

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Design av en åpen kildekode, lavpris bioink og matsmelteekstrudering 3D-skriver

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Søknader om åpen kilde Mikroplate-kompatibel belysning paneler

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening og identifisering av små peptider målretting Fibroblast vekstfaktor Receptor2 ved hjelp av en Phage display peptid bibliotek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoller av 3D Bioprinting av gelatin Methacryloyl hydrogel basert Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...