Name: an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion
Uploaded: 2022-03-31T12:30:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion at JoVE.com

Os autores reconhecem os membros do Centro de Medicina Regenerativa do QUT, em particular, Antonia Horst e Pawel Mieszczanek por suas sugestões úteis e feedback. Este trabalho foi apoiado pelo QuT's Postgraduate Research Award for SE, e pelo Australian Research Council (ARC) sob contrato de subvenção IC160100026 (Centro de Treinamento de Transformação Industrial arc em Biomanaturação Aditiva). A NB foi apoiada por Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734), do National Health and Medical Research Council (NHMRC).

CM e DWH são fundadores e acionistas da Gelomics Pty Ltd. CM também é o Diretor da Gelomics Pty Ltd. Os autores declaram não haver conflito de interesses relevantes para o tema deste artigo. Os autores não possuem outras afiliações relevantes ou envolvimento financeiro com qualquer organização ou entidade com interesse financeiro ou conflito financeiro com o assunto ou materiais discutidos no artigo, além dos divulgados.

A tubulação de materiais viscosos, especialmente hidrogéis para aplicações biomédicas19,20,21,33,47, são tarefas rotineiras em muitos laboratórios de pesquisa para preparar uma concentração definida pelo usuário ou uma série de diluição com concentrações variadas. Embora seja repetitivo e a execução seja bastante simples, é realizada principalmente manualmente com baixo rendimento amostral18. Este tutorial está introduzindo o funcionamento de uma estação de trabalho de código aberto, que foi especificamente projetada para materiais viscosos, para permitir a mistura automatizada de materiais viscosos para geração reprodutível de concentrações desejadas. Esta estação de trabalho é otimizada para pipetização de hidrogéis para permitir o manuseio automatizado e altamente confiável pela integração de docas de temperatura para materiais termoresponsivos, pipetas de deslocamento positivas para materiais viscosos e uma doca de toque de ponta opcional para remover o excesso de material da ponta. O módulo de pipetação foi especificamente otimizado para permitir o processamento de material viscoso de forma padronizada e automatizada. Em comparação com as pipetas de almofada de ar (Figura 5a), as pipetas de deslocamento positiva (Figura 5b) dispensam materiais viscosos sem deixar o material residual deixado na ponta, resultando em volumes precisos de aspiração e dispensação. A doca de toque de ponta opcional remove o excesso de material amostral da ponta (Figura 5c,d), que é útil para materiais colados (por exemplo, 4% (w/v) alginato).
A aplicação do designer de protocolo foi especificamente programada para hidrogéis e permite a diluição de até quatro reagentes com diferentes concentrações e até dois diluentes. O risco de erros no cálculo das diluições finais é evitado neste aplicativo, pois os usuários só escolhem a concentração desejada ou as etapas de diluição seriais. Os volumes de aspiração e dispensação necessários são calculados automaticamente, salvos em um arquivo de texto de documentação separado e, em seguida, preenchidos no script do protocolo. Este aplicativo de design de protocolo dá ao usuário controle total de todos os parâmetros experimentais (por exemplo, velocidade de pipetação) e garante a documentação interna dos parâmetros importantes. O aplicativo de design de protocolo leva em conta o nível de enchimento do reservatório (por exemplo, bem) e varia a altura de aspiração/dispensação para evitar mergulhos desnecessários nos materiais viscosos. Este recurso integrado evita o acúmulo de material na parede externa da ponta e, assim, garante tarefas confiáveis de aspiração e dispensação ao longo do protocolo. Embora a aplicação do designer de protocolo tenha sido desenvolvida para etapas de diluição de hidrogel, também pode ser usada para diluição de líquidos não-escoco, como corantes Laranja G. O aplicativo de designer de protocolo, que é acessível através do repositório em '/exemplos/publicação-JoVE', é a versão que é explicada na seção de protocolo e destacada no vídeo. Esta versão não será atualizada. No entanto, uma versão atualizada do aplicativo de designer de protocolo está disponível através da página principal do repositório. O terminal de calibração foi inicialmente desenvolvido pela Sanderson48 e foi otimizado para a calibração de pipetas de deslocamento positivas.
Conforme descrito no protocolo seção 4, as pipetas e os recipientes devem ser calibrados inicialmente. Este processo de calibração é crucial para definir e salvar as posições que são então usadas para calcular os incrementos de movimento. Portanto, a execução bem-sucedida do protocolo depende de posições de calibração bem definidas, pois pontos de calibração errados podem resultar em queda da ponta em um recipiente. Uma vez que as posições do êmbolo das pipetas devem ser calibradas manualmente, a precisão e a precisão da tubulação dependem muito da calibração realizada. Esses procedimentos de calibração dependem muito da experiência do usuário com o módulo de pipetação e, portanto, o treinamento com equipe experiente é recomendado no início para garantir os procedimentos adequados de calibração. Além da calibração manual no módulo de tubulação, a pipeta em si deve ser calibrada para garantir a pipetação precisa. Recomenda-se calibrar as pipetas pelo menos a cada 12 meses para atender aos critérios de aceitação especificados na ISO 8655. Para avaliar internamente a calibração da pipeta, a validação e a verificação estão disponíveis conforme descrito por Stangegaard et al.16.
Para a geração de um conjunto de dados confiável, é crucial começar com reagentes de alta qualidade. Isso é especialmente importante para tarefas de processamento de hidrogel, uma vez que as variações em lote a lote podem impactar os resultados gerados dentro deste protocolo. Além das variações em lote a lote, mudanças sutis na preparação de pequenos volumes também podem contribuir para as diferenças de propriedade. Para evitar isso, recomenda-se a preparação de volumes maiores, que podem ser usados para todos os experimentos.
Os procedimentos de validação e verificação dependem do uso de um corante para identificar misturas confiáveis. O protocolo apresentado descreve a aplicação do Laranja G, mas o protocolo geral e o fluxo de trabalho de análise também podem ser adaptados a corantes fluorescentes49,50. O uso de Laranja G reduz os requisitos técnicos do espectotômetro e elimina as precauções tomadas para evitar o branqueamento dos corantes fluorescentes após a exposição à luz. Problemas no comportamento dissolvido ou formação de cluster do corante não foram observados com os materiais apresentados durante os experimentos, mas podem aparecer com outros materiais. A formação potencial de aglomerados e, portanto, a interação entre corante e material poderia ser facilmente detectada com um microscópio.
Os procedimentos e técnicas apresentados neste tutorial adicionam capacidade de automação aos fluxos de trabalho atuais para materiais viscosos para alcançar tarefas altamente confiáveis com trabalho humano mínimo. A tabela de solução de problemas fornecida (Tabela 2) inclui problemas identificados e apresenta possíveis razões, bem como soluções para resolver os problemas. A estação de trabalho apresentada foi aplicada com sucesso a materiais poliméricos naturais (gelatina, gengiva de gellan, matrigel) e sintéticos (por exemplo, poli(etileno glicol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) para tarefas automatizadas de pipetação. Em particular, a combinação de uma estação de trabalho de código aberto e um aplicativo de design de protocolo de código aberto projetado para materiais viscosos será muito útil para pesquisadores que trabalham nas áreas de engenharia biomédica, ciência de materiais e microbiologia.

A reprodutibilidade e a replicabilidade são de suma importância no trabalho científico1,2,3,4. No entanto, evidências recentes têm destacado desafios significativos na repetição de estudos biomédicos de alto impacto em ciências fundamentais, bem como pesquisas translacionais4,5,6,7. Os fatores que contribuem para resultados irreprodutíveis são complexos e múltiplos, como design de estudo ruim ou tendencioso6,8, poder estatístico insuficiente3,9, falta de conformidade com padrões de relatório7,10,11, pressão para publicar6 ou métodos indisponíveis ou código de software6,9 . Entre elas, mudanças sutis no protocolo e erros humanos na execução de experimentos foram identificados como elementos adicionais que contabilizam a irreproducibilidade4. Por exemplo, as tarefas manuais de pipetação introduzem imprecisões intra e inter-individuais12,13 e aumentam a probabilidade de erros humanos14. Embora os robôs comerciais de manuseio de líquidos sejam capazes de superar essas desvantagens e tenham demonstrado maior confiabilidade para líquidos15,16,17, o manuseio automatizado de materiais com propriedades viscosas significativas ainda é desafiador.
Robôs comerciais de manuseio de líquidos geralmente usam pipetas de almofada de ar, também conhecidas como pistão de ar ou pipetas de deslocamento de ar. O reagente e o pistão são separados por uma almofada de ar que encolhe durante as etapas de distribuição e se expande durante as etapas de aspiração. Usando pipetas de almofada de ar, materiais viscosos 'fluem' apenas lentamente para dentro e para fora da ponta, e a retirada antecipada da pipeta do reservatório pode resultar na aspiração de bolhas de ar. Durante a dispensação das tarefas, o material viscoso deixa um filme na parede da ponta interna que "flui" apenas lentamente ou não quando é forçado pelo ar. Para superar essas questões, pipetas de deslocamento positivas foram introduzidas comercialmente para extrusir ativamente o material viscoso da ponta usando um pistão sólido. Embora essas pipetas de deslocamento positivas permitam o manuseio preciso e confiável de materiais viscosos, soluções automatizadas com pipetas de deslocamento positivas ainda são muito caras para configurações acadêmicas de laboratório e, portanto, a maioria dos fluxos de trabalho com materiais viscosos dependem apenas de tarefas manuais de tubulação18.
Em geral, a viscosidade é definida como a resistência de um fluido ao fluxo, e materiais viscosos estão sendo definidos como materiais com maior viscosidade da água (0,89 mPa·s a 25 °C). No campo das aplicações biomédicas, as configurações experimentais geralmente contêm múltiplos materiais com uma viscosidade maior do que a água, como o sulfóxido de dimetil (DMSO; 1,99 mPa·s a 25 °C), glicerol (208,1 mPa·s a 25 °C para 90% glicerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s a 25 °C) e polímeros inchados pela água, chamados de hidrogéis19, Dia 20. Hidrogéis são redes de polímeros hidrofílicos dispostas em um modo físico ou/e químico usado para várias aplicações, incluindo encapsulamento celular, entrega de medicamentos e atuadores macios19,20,21,22. A viscosidade dos hidrogéis depende da concentração de polímeros e do peso molecular19. Hidrogéis usados rotineiramente para aplicações biomédicas apresentam valores de viscosidade entre 1 e 1000 mPa·s, enquanto sistemas específicos de hidrogel foram relatados com valores de até 6 x 107 mPa·s19,23,24. No entanto, as medidas de viscosidade dos hidrogéis não são padronizadas em termos de protocolo de medição e preparação de amostras, e, portanto, os valores de viscosidade entre diferentes estudos são difíceis de comparar.
Uma vez que as soluções automatizadas disponíveis comercialmente especificamente para hidrogéis estão faltando ou muito caras, os fluxos de trabalho atuais para hidrogel dependem do manuseio manual18. Para entender as limitações do fluxo de trabalho manual atual para a pipetação de hidrogéis, é importante compreender tarefas essenciais de manuseio18. Por exemplo, uma vez sintetizado um novo material de hidrogel, uma concentração desejada ou uma série de diluição com concentrações variadas é gerada para identificar protocolos de síntese confiáveis e características de crosslinking com análise subsequente das propriedades mecânicas25,26,27,28 . Em geral, uma solução de estoque é preparada ou comprada e, posteriormente, misturada com um diluído e/ou outros reagentes para obter uma mistura. As tarefas de mistura não são realizadas diretamente em uma placa de poço (ou qualquer formato de saída), e são bastante executadas em um tubo de reação separado, que é comumente referido como mix mestre. Durante essas tarefas de preparação, várias etapas de aspiração e dispensação são necessárias para transferir o material viscoso(s), misturar os reagentes e transferir a mistura para um formato de saída (por exemplo, uma placa de 96 poços). Essas tarefas requerem uma alta quantidade de trabalho humano18, longas horas experimentais e aumentam a probabilidade de erros humanos que poderiam potencialmente se manifestar como resultados imprecisos. Além disso, o manuseio manual impede a preparação eficiente de números de alta amostra para tela de várias combinações de parâmetros para caracterização detalhada. O processamento manual também impede o uso de hidrogéis para aplicações de triagem de alto rendimento, como a identificação de compostos promissores durante o desenvolvimento de medicamentos. As atuais etapas de preparação manual não são viáveis para a triagem de bibliotecas de drogas compostas por milhares de drogas. Por essas razões, soluções automatizadas são necessárias para fornecer um processo de desenvolvimento eficiente e permitir a tradução bem-sucedida de hidrogéis para aplicações de triagem de medicamentos.
Para passar de fluxos de trabalho baseados em manual para processos automatizados, otimizamos um robô comercial de pipetação de código aberto para o manuseio de materiais viscosos pela integração de docas de temperatura para materiais termoresponsivos, o uso de pipetas de deslocamento positivas fora da prateleira usando pontas de pistão capilar, e uma doca de toque de ponta opcional para limpeza de ponta de pipeta. Este robô pipetting foi ainda mais integrado como um módulo de pipetação em uma estação de trabalho de código aberto recém-desenvolvida, que consiste em módulos prontos para instalação e personalizáveis18,29. Instruções detalhadas de montagem para a estação de trabalho desenvolvida, incluindo arquivos de hardware e software, são livremente acessíveis a partir do GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) e do repositório Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Além do desenvolvimento de hardware, um aplicativo de design de protocolo de código aberto foi programado e liberado para orientar o usuário através do processo de seleção de parâmetros e gerar um código de protocolo pronto para uso (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Este código é executado no robô de tubulação de código aberto comercial, bem como na estação de trabalho de código aberto desenvolvida.
Aqui, um tutorial abrangente é fornecido sobre o funcionamento da estação de trabalho de código aberto para automatizar tarefas de mistura para materiais viscosos (Figura 1). As etapas de protocolo específicas do tutorial podem ser realizadas com a estação de trabalho de código aberto desenvolvida, bem como o robô comercial de pipetting de código aberto. Apoiado por um aplicativo de design de protocolo de código aberto desenvolvido internamente, demonstra-se a mistura automatizada e a preparação das concentrações necessárias para glicerol, gelatina methacryloyl (GelMA) e alginato. O Glicerol foi selecionado neste tutorial, uma vez que é bem caracterizado30,31, é barato e prontamente disponível, e, portanto, é comumente usado como material de referência viscoso para tarefas automatizadas de pipetação. Como exemplos para hidrogéis usados em aplicações biomédicas, soluções precursoras de gelma e hidrogel alginato têm sido aplicadas para experimentos automatizados de mistura. O GelMA apresenta um dos hidrogéis mais utilizados para estudos de encapsulamento celular32,33, e o alginato foi selecionado neste estudo para demonstrar a capacidade de fabricar hidrogéis de rede dupla34,35. Utilizando o Laranja G como corante, foi implementado um procedimento rápido e barato para validar e verificar os resultados da mistura com um espectotômetro16.
Um robô comercial de pipetação de código aberto foi integrado como um módulo de pipetação na estação de trabalho de código aberto desenvolvida (Figura 2a), e, portanto, o nome 'módulo de pipetação' é ainda usado para descrever o robô pipetting. Uma descrição detalhada do hardware instalado está além do escopo deste protocolo e está disponível através dos repositórios fornecidos, que também incluem instruções passo a passo para a assembleia geral da plataforma de código aberto. O módulo de tubulação pode ser equipado com duas pipetas (pipeta de um ou 8 canais) que são instaladas no eixo A (direita) e no eixo B (esquerda) (Figura 2b). O módulo de tubulação oferece uma capacidade de 10 decks de acordo com as normas do American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS), e as seguintes posições de localização são definidas no convés: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (Figura 2c). Para iniciar a polimerização induzida por foto de soluções de hidrogel, é necessário um módulo crosslinker separado e foi adicionado à estação de trabalho. O módulo crosslinker é equipado com LEDs com um comprimento de onda de 400 nm e, portanto, substâncias que excitam em um comprimento de onda de luz visível podem ser usadas com os sistemas atuais, como fenil de lítio-2,4,6 trimetilbenzoylphosphinate (LAP)36,37. A intensidade (em mW/cm2) dos LEDs pode ser abordada pelo usuário no aplicativo de design de protocolo para estudar o comportamento de crosslinking38. A estação de trabalho inclui também um módulo de armazenamento para permitir o aumento dos estudos de throughput; no entanto, este módulo não é utilizado neste estudo e, portanto, não descrito posteriormente. Em geral, recomenda-se operar o módulo de tubulação em um armário de segurança biológica para evitar a contaminação da amostra. O principal circuito de potência para operar o módulo de tubulação é um circuito de 12 V, que é considerado como uma aplicação de baixa tensão na maioria dos países. Todos os componentes elétricos são baseados em uma caixa de controle dedicada que impede que os usuários entrem em contato com a fonte de um perigo elétrico.
Seguindo esses protocolos padronizados de mistura, os pesquisadores são capazes de alcançar misturas confiáveis para materiais viscosos e não viscosos de forma automatizada. A abordagem de código aberto permite que os usuários otimizem sequências de mixagem e compartilhem protocolos recém-desenvolvidos com a comunidade. Em última análise, essa abordagem facilitará a triagem de múltiplas combinações de parâmetros para investigar as interdependências entre diferentes fatores e, assim, acelerar a aplicação confiável e o desenvolvimento de materiais viscosos para aplicações biomédicas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:260px;">5 mL tubes</td>
			<td style="width:301px;">Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SCT-5ML</td>
			<td style="width:301px;">size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-432-22</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;70% w/w Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">LabChem, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">aja726-5Lpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">96-well plate</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Alginate</td>
			<td style="width:301px;">NovaMatrix</td>
			<td align="right" style="width:203px;">4200001</td>
			<td>https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Demineralized or ultrapure (MilliQ) water</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:260px;">Gelatin methacryloyl (GelMA)</td>
			<td style="width:301px;">Synthetized in-house</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:301px;">detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich, Inc. (USA)</td>
			<td align="right" style="width:203px;">900889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M4 and M5 Allen key</td>
			<td style="width:301px;">OpenBuilds, inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">179, 190</td>
			<td>also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">OrangeG</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific (USA)</td>
			<td style="width:203px;">O267-25</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14190-144</td>
			<td style="width:301px;">alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Equipment</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Aluminium blocks for temperature dock</td>
			<td style="width:301px;">Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SB16</td>
			<td>blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;Analytical balance</td>
			<td style="width:301px;">Sartorius AG (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">ED224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Open source liquid handling robot: commercial product</td>
			<td style="width:301px;">Opentrons Laboratories, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">OT-One S Pro</td>
			<td>https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td>Open source liquid handling robot: open source hardware</td>
			<td>Assembled in-house following an open source approach</td>
			<td></td>
			<td>hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Positive displacement pipette: MicromanE</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">FD10006</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">BMG LABTECH GmbH (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">CLARIOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips: capillary pistons</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">F148180</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion

As etapas atuais de mistura de materiais viscosos dependem de tarefas repetitivas e demoradas que são executadas principalmente manualmente em um modo de baixa produtividade. Essas questões representam desvantagens nos fluxos de trabalho que podem, em última análise, resultar em irreprodutividade dos resultados da pesquisa. Os fluxos de trabalho baseados em manual estão limitando ainda mais o avanço e a adoção generalizada de materiais viscosos, como hidrogéis usados para aplicações biomédicas. Esses desafios podem ser superados usando fluxos de trabalho automatizados com processos padronizados de mixagem para aumentar a reprodutibilidade. Neste estudo, apresentamos instruções passo a passo para usar um designer de protocolo de código aberto, operar uma estação de trabalho de código aberto e identificar misturas reprodutíveis. Especificamente, o designer de protocolo de código aberto orienta o usuário através da seleção experimental de parâmetros e gera um código de protocolo pronto para uso para operar a estação de trabalho. Esta estação de trabalho é otimizada para pipetação de materiais viscosos para permitir o manuseio automatizado e altamente confiável pela integração de docas de temperatura para materiais termoresponsivos, pipetas de deslocamento positiva para materiais viscosos e uma doca opcional de toque de ponta para remover o excesso de material da ponta da pipeta. A validação e verificação das misturas são realizadas por uma medição de absorvância rápida e barata da Laranja G. Este protocolo apresenta resultados para obter 80% (v/v) misturas de glicerol, uma série de diluição para methacryloyl de gelatina (GelMA), e hidrogéis de rede dupla de 5% (w/v) GelMA e 2% (w/v) alginato. Um guia de solução de problemas está incluído para apoiar os usuários com adoção de protocolo. O fluxo de trabalho descrito pode ser amplamente aplicado a uma série de materiais viscosos para gerar concentrações definidas pelo usuário de forma automatizada.

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An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Este protocolo serve como um tutorial abrangente para a mistura padronizada e reprodutível de materiais viscosos com uma nova tecnologia de automação de código aberto. Instruções detalhadas são fornecidas sobre o funcionamento de uma estação de trabalho de código aberto recém-desenvolvida, o uso de um designer de protocolo de código aberto e a validação e verificação para identificar misturas reprodutíveis.

Uma plataforma de tecnologia de código aberto para fabricar modelos de cultura 3D à base de hidrogel de forma automatizada e padronizada

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

A pesquisa biomédica enfrenta uma crise de reprodutibilidade na forma de que novos achados de pesquisa raramente são traduzidos em aplicações terapêuticas. Este protocolo reduz o fator humano e introduz automação e padronização na fabricação. Este método se concentra especificamente em hidrogéis foto-transfronteiriços para aplicações de cultura celular 3D, pois os hidrogéis tornaram-se a plataforma mais usada em câncer e outros modelos de tecido de doenças na última década.Abordamos com sucesso as atuais limitações de hardware e software com o desenvolvimento de uma plataforma de tecnologia de código aberto. Esta plataforma foi especificamente projetada para hidrogéis e permite fluxos de trabalho de fabricação automatizados para pesquisa de engenharia de tecidos. Para instalar a API, abra a interface da linha de comando.Para instalar a API de trabalho, digite pip instale estação de trabalho aberta e pressione Enter. Para operar o módulo de bio fabricação de tubulação, digite o comando para instalar a API opentrons. Em seguida, use a linha de comando para abrir um script Python e verificar se ambas as APIs foram instaladas com sucesso.Para gerar o código de protocolo, abra o aplicativo de design de protocolo para gerar um script de protocolo personalizado que será executado pela plataforma. A interface é executada em todos os navegadores de internet comumente usados. Digite o nome do protocolo na página de configuração e clique em Continuar.Na configuração da bandeja de entrada, selecione três por quatro blocos de aquecimento para definir a bandeja de entrada. Para definir os materiais e concentrações de estoque, selecione Gel 1 no menu de entradas definidas e digite GelMA como o nome. Defina a concentração de estoque para 20% e o número de amostras para três e clique em Adicionar para salvar as entradas e preencher a primeira coluna.Selecione Gel 2 no menu de entradas definir e digite Alginate como o nome. Defina a concentração de estoque para 4% e o número de amostras para três e clique em Adicionar para salvar as entradas e preencher a segunda coluna. Depois de definir os parâmetros fotoiniciais e diluidores como demonstrado, selecione o crosslinking de fotos, defina o tempo para 30 segundos e a intensidade para dois e clique em OK. Em seguida, defina o tipo de placa de poço para placa de 96 poços e clique no Grupo 1 para permitir que os parâmetros para a criação de hidrogéis de rede dupla sejam especificados.Em seguida, verifique a caixa de protocolo de mistura avançada, se necessário, defina o número de amostras para 96 e clique em Continuar. Para definir o layout do deck, selecione o tipo de bandeja apropriado para cada slot. Quando todos os tipos de bandeja tiverem sido selecionados, clique na caixa esquerda da pipeta e selecione deslocamento positivo de 10 a 100 microliter do menu suspenso.Coloque a velocidade de aspiração em 600 e a velocidade de distribuição para 800. Em seguida, coloque os parâmetros certos da pipeta da mesma maneira. Em seguida, clique em Gerar Protocolo para gerar e salvar o script do protocolo.Antes de executar o protocolo, pulverize os consumíveis com 70% de etanol e posicione-os de acordo com a configuração definida na configuração do usuário. Coloque os tubos de reação com os materiais no bloco de alumínio nas docas de temperatura de acordo com a configuração selecionada. Em seguida, pulverize suas luvas com 70% de etanol e abra os tubos de reação cuidadosamente sem tocar nos tubos abertos.Quando as substâncias atingirem a temperatura experimental apropriada, execute o protocolo gerado usando a interface do usuário. A estação de trabalho começará com o processo de guinadas, seguida por obter uma placa de poço vazia do módulo de armazenamento. Depois de remover a tampa da placa do poço, a placa é transportada para o próximo módulo.O protocolo especifica o volume que está sendo pipetado de cada solução de estoque e altera automaticamente as pontas após cada material para evitar contaminação cruzada. Para misturar soluções viscosas de forma reprodutível, a estação de trabalho executa um protocolo de mixagem específico que foi otimizado para hidrogéis viscosos. O aplicativo de design de protocolo leva em conta o nível de enchimento do reservatório e adapta automaticamente a altura de mistura para evitar mergulhos desnecessários nos materiais viscosos.Após geração automática de modelos 3D e placas de poço, a estação de trabalho fecha a placa do poço com a tampa novamente e armazena a placa de poço na posição programada no módulo de armazenamento. Uma vez terminado o protocolo, remova a placa do módulo de armazenamento. Para validação e verificação do protocolo conduzido, carregue a placa em um espectotômetro e leia a absorvência duas vezes a 450 nanômetros.Após salvar os valores de absorção, abra o arquivo da planilha de análise que é fornecido como material complementar na publicação e copie as leituras de absorvência na tabela na folha de dados bruta. Em seguida, clique na folha de análise para visualizar os valores médios, o desvio padrão e o coeficiente de valores de variância, que são automaticamente calculados e exibidos para uma distribuição uniforme de amostra para linhas específicas e para colunas específicas de uma placa de poço 96. Para encontrar a configuração que garante uma alta reprodutibilidade para soluções de glicerol, foram gerados protocolos sem controle de temperatura e sem toque de ponta, com controle de temperatura e sem toque de ponta, ou com controle de temperatura e com toque de ponta.O coeficiente calculado de valores de variação para as três configurações revelou uma influência significativa da doca de temperatura e da função de toque de ponta, destacando a capacidade do protocolo de gerar resultados altamente reprodutíveis quando utilizado ambos os recursos. Utilizando a função de toque de ponta com a doca de temperatura, o desvio padrão foi significativamente reduzido na configuração três. A plotagem dos valores de absorção da amostra para a configuração três não produziu valores crescentes ou decrescentes ao longo do experimento e, portanto, não indicou influência da posição amostral sobre os valores de absorção.Em seguida, uma série de diluição do GelMA foi preparada diluindo uma solução de estoque de 20% GelMA e avaliando as diferenças entre diferentes diluições de GelMA. O valor de absorção medido a cada etapa de concentração foi significativamente diferente e a regressão linear demonstrou um alto ajuste confirmando a capacidade de etapas de concentração distintas a serem geradas. Além disso, a influência do toque de ponta foi avaliada para hidrogéis de rede dupla com 5%GelMA, 2%alginate e 0,15%LAP, que foram gerados automaticamente com a configuração.A integração do toque de ponta resulta em uma diminuição significativa do desvio padrão que suporta a geração de um conjunto de dados reprodutível. A visualização dos valores de absorção e mapas de calor confirmou o desvio reduzido ao usar o toque de ponta para remover o excesso de material da ponta. Nossa tecnologia permite a automação da fabricação de hidrogel para cultura celular 3D e engenharia de tecidos.É uma solução de baixo custo para aumentar o throughput e a reprodutibilidade de fluxos de trabalho tecnicamente desafiadores. Ao fornecer uma abordagem de código aberto personalizável, essa tecnologia abre caminho para a adaptação generalizada da automação de processos em pesquisas de engenharia de tecidos.

Research

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Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

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Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform para testar as lentes de contato

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

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A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

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