Name: an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion
Uploaded: 2022-03-31T12:30:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion at JoVE.com

Los autores reconocen a los miembros del Centro de Medicina Regenerativa de QUT, en particular, Antonia Horst y Pawel Mieszczanek por sus útiles sugerencias y comentarios. Este trabajo fue apoyado por el Premio de Investigación de Postgrado de QUT para SE, y por el Consejo Australiano de Investigación (ARC) bajo el acuerdo de subvención IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). NB fue apoyado por un Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC) Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734).

CM y DWH son fundadores y accionistas de Gelomics Pty Ltd. CM es también el Director de Gelomics Pty Ltd. Los autores declaran que no hay conflicto de intereses relevante para el tema de este artículo. Los autores no tienen otras afiliaciones relevantes o participación financiera con ninguna organización o entidad con un interés financiero o conflicto financiero con el tema o los materiales discutidos en el artículo, aparte de los divulgados.

El pipeteo de materiales viscosos, especialmente hidrogeles para aplicaciones biomédicas19,20,21,33,47, son tareas rutinarias en muchos laboratorios de investigación para preparar una concentración definida por el usuario o una serie de dilución con concentraciones variables. Aunque es repetitivo y la ejecución es bastante simple, se realiza principalmente manualmente con bajo rendimiento de muestra18. Este tutorial presenta el funcionamiento de una estación de trabajo de código abierto, que ha sido diseñada específicamente para materiales viscosos, para permitir la mezcla automatizada de materiales viscosos para la generación reproducible de las concentraciones deseadas. Esta estación de trabajo está optimizada para pipetear hidrogeles para permitir un manejo automatizado y altamente confiable mediante la integración de muelles de temperatura para materiales termosensibles, pipetas de desplazamiento positivo para materiales viscosos y un muelle táctil de punta opcional para eliminar el exceso de material de la punta. El módulo de pipeteo se ha optimizado específicamente para permitir el procesamiento de material viscoso de manera estandarizada y automatizada. En comparación con las pipetas de cojín de aire (Figura 5a), las pipetas de desplazamiento positivo (Figura 5b) dispensan materiales viscosos sin dejar material residual en la punta, lo que resulta en volúmenes precisos de aspiración y dispensación. La base táctil de punta opcional elimina el exceso de material de muestra de la punta (Figura 5c, d), que es útil para materiales pegajosos (por ejemplo, 4% (p/v) de alginato).
La aplicación del diseñador de protocolos ha sido programada específicamente para hidrogeles y permite la dilución de hasta cuatro reactivos con diferentes concentraciones y hasta dos diluyentes. El riesgo de errores en el cálculo de las diluciones finales se evita en esta aplicación, ya que los usuarios solo eligen la concentración deseada o los pasos de dilución en serie. Los volúmenes de aspiración y dispensación requeridos se calculan automáticamente, se guardan en un archivo de texto de documentación independiente y, a continuación, se rellenan en el script de protocolo. Esta aplicación de diseño de protocolos proporciona al usuario un control total de todos los parámetros experimentales (por ejemplo, la velocidad de pipeteo) y garantiza la documentación interna de los parámetros importantes. La aplicación de diseño de protocolo tiene en cuenta el nivel de llenado del depósito (por ejemplo, pozo) y varía la altura de aspiración / dispensación para evitar la inmersión innecesaria en los materiales viscosos. Esta característica integrada evita la acumulación de material en la pared exterior de la punta y, por lo tanto, garantiza tareas de aspiración y dispensación confiables durante todo el protocolo. Aunque la aplicación de diseño de protocolos se ha desarrollado para los pasos de dilución de hidrogel, también se puede utilizar para la dilución de líquidos no visuales, como los colorantes Orange G. La aplicación de diseño de protocolos, a la que se puede acceder a través del repositorio en '/examples/publication-JoVE', es la versión que se explica en la sección de protocolo y se destaca en el vídeo. Esta versión no se actualizará. Sin embargo, una versión actualizada de la aplicación de diseño de protocolos está disponible a través de la página principal del repositorio. El terminal de calibración fue desarrollado inicialmente por Sanderson48 y ha sido optimizado para la calibración de pipetas de desplazamiento positivo.
Como se describe en la sección 4 del protocolo, las pipetas y los contenedores deben calibrarse inicialmente. Este proceso de calibración es crucial para definir y guardar las posiciones que luego se utilizan para calcular los incrementos de movimiento. Por lo tanto, la ejecución exitosa del protocolo se basa en posiciones de calibración bien definidas, ya que los puntos de calibración incorrectos podrían provocar el choque de la punta en un contenedor. Dado que las posiciones del émbolo de las pipetas deben calibrarse manualmente, la exactitud y precisión del pipeteo dependen en gran medida de la calibración realizada. Estos procedimientos de calibración dependen en gran medida de la experiencia del usuario con el módulo de pipeteo y, por lo tanto, se recomienda la capacitación con personal experimentado al principio para garantizar los procedimientos de calibración adecuados. Además de la calibración manual en el módulo de pipeteo, la pipeta en sí debe calibrarse para garantizar un pipeteo preciso. Se recomienda calibrar las pipetas al menos cada 12 meses para cumplir con los criterios de aceptación especificados en ISO 8655. Para evaluar internamente la calibración de la pipeta, la validación y la verificación están disponibles según lo descrito por Stangegaard et al.16.
Para la generación de un conjunto de datos confiable, es crucial comenzar con reactivos de alta calidad. Esto es especialmente importante para las tareas de procesamiento de hidrogel, ya que las variaciones de lote a lote pueden afectar los resultados generados dentro de este protocolo. Además de las variaciones de lote a lote, los cambios sutiles en la preparación de pequeños volúmenes también pueden contribuir a las diferencias de propiedad. Para evitar esto, se recomienda la preparación de volúmenes más grandes, que se pueden usar para todos los experimentos.
Los procedimientos de validación y verificación se basan en el uso de un tinte para identificar mezclas confiables. El protocolo presentado describe la aplicación de Orange G, pero el protocolo general y el flujo de trabajo de análisis también se pueden adaptar a colorantes fluorescentes49,50. El uso de Orange G reduce los requisitos técnicos del espectrofotómetro y elimina las precauciones tomadas para evitar el blanqueo de los colorantes fluorescentes después de la exposición a la luz. No se han observado problemas en el comportamiento de disolución o la formación de grupos del tinte con los materiales presentados durante los experimentos, pero pueden aparecer con otros materiales. La posible formación de grupos y, por lo tanto, la interacción entre el tinte y el material podría detectarse fácilmente con un microscopio.
Los procedimientos y técnicas presentados en este tutorial agregan capacidad de automatización a los flujos de trabajo actuales para materiales viscosos para lograr tareas altamente confiables con un mínimo de mano de obra humana. La tabla de solución de problemas proporcionada (Tabla 2) incluye los problemas identificados y presenta las posibles razones, así como las soluciones para resolver los problemas. La estación de trabajo presentada se ha aplicado con éxito a materiales poliméricos naturales (gelatina, goma gellan, matrigel) y sintéticos (por ejemplo, poli(etilenglicol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) para tareas de pipeteo automatizado. En particular, la combinación de una estación de trabajo de código abierto y una aplicación de diseño de protocolo de código abierto diseñada para materiales viscosos será muy útil para los investigadores que trabajan en los campos de la ingeniería biomédica, la ciencia de los materiales y la microbiología.

La reproducibilidad y la replicabilidad son de suma importancia en el trabajo científico1,2,3,4. Sin embargo, la evidencia reciente ha puesto de relieve importantes desafíos en la repetición de estudios biomédicos de alto impacto en ciencias fundamentales, así como en la investigación traslacional4,5,6,7. Los factores que contribuyen a resultados irreproducibles son complejos y múltiples, como un diseño de estudio deficiente o sesgado6,8, un poder estadístico insuficiente3,9, la falta de cumplimiento de las normas de información7,10,11, la presión para publicar6 o los métodos o códigos de software no disponibles6,9 . Entre ellos, los cambios sutiles en el protocolo y los errores humanos en la ejecución de los experimentos se han identificado como elementos adicionales que explican la irreproducibilidad4. Por ejemplo, las tareas de pipeteo manual introducen imprecisión intra e interindividual12,13 y aumentan la probabilidad de errores humanos14. Si bien los robots comerciales de manejo de líquidos pueden superar estos inconvenientes y han demostrado una mayor confiabilidad para líquidos15,16,17, el manejo automatizado de materiales con propiedades viscosas significativas sigue siendo un desafío.
Los robots comerciales de manejo de líquidos comúnmente usan pipetas de cojín de aire, también conocidas como pipetas de pistón de aire o de desplazamiento de aire. El reactivo y el pistón están separados por un cojín de aire que se encoge durante los pasos de dispensación y se expande durante los pasos de aspiración. Usando pipetas de cojín de aire, los materiales viscosos "fluyen" solo lentamente dentro y fuera de la punta, y la retirada temprana de la pipeta del depósito puede resultar en la aspiración de burbujas de aire. Durante las tareas de dispensación, el material viscoso deja una película en la pared de la punta interior que "fluye" lentamente o no fluye en absoluto cuando es forzado por el aire. Para superar estos problemas, se introdujeron comercialmente pipetas de desplazamiento positivo para extruir activamente el material viscoso de la punta utilizando un pistón sólido. Aunque estas pipetas de desplazamiento positivo permiten un manejo preciso y confiable de materiales viscosos, las soluciones automatizadas con pipetas de desplazamiento positivo siguen siendo demasiado costosas para entornos de laboratorio académicos y, por lo tanto, la mayoría de los flujos de trabajo con materiales viscosos se basan únicamente en tareas de pipeteo manual18.
En general, la viscosidad se define como la resistencia de un fluido al flujo, y los materiales viscosos se definen además como materiales con una mayor viscosidad del agua (0,89 mPa·s a 25 °C). En el campo de las aplicaciones biomédicas, las configuraciones experimentales a menudo contienen múltiples materiales con una mayor viscosidad que el agua, como el dimetilsulfóxido (DMSO; 1,99 mPa·s a 25 °C), glicerol (208,1 mPa·s a 25 °C para el 90% de glicerol [v/v]), Tritón X-100 (240 mPa·s a 25 °C) y polímeros hinchados por agua, denominados hidrogeles19, 20. Los hidrogeles son redes de polímeros hidrófilos dispuestas en un modo físico y/o químico utilizado para diversas aplicaciones, incluyendo encapsulación celular, administración de fármacos y actuadores blandos19,20,21,22. La viscosidad de los hidrogeles depende de la concentración del polímero y del peso molecular19. Los hidrogeles utilizados habitualmente para aplicaciones biomédicas presentan valores de viscosidad entre 1 y 1000 mPa·s, mientras que se han reportado sistemas de hidrogel específicos con valores de hasta 6 x 107 mPa·s19,23,24. Sin embargo, las mediciones de viscosidad de los hidrogeles no están estandarizadas en términos de protocolo de medición y preparación de la muestra, y, por lo tanto, los valores de viscosidad entre diferentes estudios son difíciles de comparar.
Dado que las soluciones automatizadas disponibles en el mercado diseñadas específicamente para hidrogeles faltan o son demasiado caras, los flujos de trabajo actuales para el hidrogel dependen de la manipulación manual18. Para comprender las limitaciones del flujo de trabajo manual actual para el pipeteo de hidrogeles, es importante comprender las tareas de manipulación esenciales18. Por ejemplo, una vez que se ha sintetizado un nuevo material de hidrogel, se genera una concentración deseada o una serie de dilución con concentraciones variables para identificar protocolos de síntesis confiables y características de reticulación con el análisis posterior de las propiedades mecánicas25,26,27,28 . En general, se prepara o compra una solución madre, y posteriormente se mezcla con un diluyente y / u otros reactivos para obtener una mezcla. Las tareas de mezcla en su mayoría no se realizan directamente en una placa de pozo (o cualquier formato de salida), y se realizan en un tubo de reacción separado, que comúnmente se conoce como mezcla maestra. Durante estas tareas de preparación, se requieren varios pasos de aspiración y dispensación para transferir el material (s) viscoso (s), mezclar los reactivos y transferir la mezcla a un formato de salida (por ejemplo, una placa de 96 pocillos). Estas tareas requieren una gran cantidad de trabajo humano18, largas horas experimentales y aumentan la probabilidad de errores humanos que podrían manifestarse como resultados inexactos. Además, el manejo manual impide la preparación eficiente de números de muestra altos para filtrar varias combinaciones de parámetros para una caracterización detallada. El procesamiento manual también impide el uso de hidrogeles para aplicaciones de cribado de alto rendimiento, como la identificación de compuestos prometedores durante el desarrollo de fármacos. Los pasos actuales de preparación manual no son factibles para examinar las bibliotecas de medicamentos que consisten en miles de medicamentos. Por estas razones, se requieren soluciones automatizadas para proporcionar un proceso de desarrollo eficiente y permitir la traducción exitosa de hidrogeles para aplicaciones de detección de drogas.
Para pasar de los flujos de trabajo manuales a los procesos automatizados, hemos optimizado un robot de pipeteo comercial de código abierto para el manejo de materiales viscosos mediante la integración de muelles de temperatura para materiales termosensibles, el uso de pipetas de desplazamiento positivo listas para usar utilizando puntas de pistón capilar y una base táctil de punta opcional para la limpieza de la punta de la pipeta. Este robot pipeteador se ha integrado aún más como un módulo de pipeteo en una estación de trabajo de código abierto recientemente desarrollada, que consta de módulos listos para instalar y personalizables18,29. Las instrucciones de montaje detalladas para la estación de trabajo desarrollada, incluidos los archivos de hardware y software, son de libre acceso desde GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) y el repositorio de Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Además del desarrollo de hardware, se ha programado y lanzado una aplicación de diseño de protocolo de código abierto para guiar al usuario a través del proceso de selección de parámetros y generar un código de protocolo listo para usar (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Este código se ejecuta en el robot de pipeteo de código abierto comercial, así como en la estación de trabajo de código abierto desarrollada.
Aquí, se proporciona un tutorial completo sobre el funcionamiento de la estación de trabajo de código abierto para automatizar las tareas de mezcla de materiales viscosos (Figura 1). Los pasos del protocolo específico del tutorial se pueden llevar a cabo con la estación de trabajo de código abierto desarrollada, así como con el robot de pipeteo comercial de código abierto. Con el apoyo de una aplicación de diseño de protocolo de código abierto desarrollada internamente, se demuestra la mezcla automatizada y la preparación de las concentraciones requeridas para glicerol, gelatina metacriloil (GelMA) y alginato. El glicerol ha sido seleccionado en este tutorial, ya que está bien caracterizado30,31, es barato y fácilmente disponible, y, por lo tanto, se utiliza comúnmente como material de referencia viscoso para tareas de pipeteo automatizado. Como ejemplos de hidrogeles utilizados en aplicaciones biomédicas, se han aplicado soluciones precursoras de hidrogel GelMA y alginato para experimentos de mezcla automatizados. GelMA presenta uno de los hidrogeles más utilizados para estudios de encapsulación celular32,33, y el alginato fue seleccionado en este estudio para demostrar la capacidad de fabricar hidrogeles de doble red34,35. Utilizando Orange G como colorante, se implementó un procedimiento rápido y económico para validar y verificar los resultados de la mezcla con un espectrofotómetro16.
Un robot de pipeteo de código abierto comercial se ha integrado como un módulo de pipeteo en la estación de trabajo de código abierto desarrollada (Figura 2a), y por lo tanto, el nombre 'módulo de pipeteo' se utiliza además para describir el robot de pipeteo. Una descripción detallada del hardware instalado está más allá del alcance de este protocolo y está disponible a través de los repositorios proporcionados que también incluyen instrucciones paso a paso para el ensamblaje general de la plataforma de código abierto. El módulo de pipeteo puede equiparse con dos pipetas (pipeta de uno u 8 canales) que se instalan en el eje A (derecha) y el eje B (izquierda) (Figura 2b). El módulo de pipeteo ofrece una capacidad de 10 cubiertas de acuerdo con los estándares del American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS), y las siguientes posiciones de ubicación se definen en la cubierta: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (Figura 2c). Para iniciar la polimerización fotoinducida de soluciones de hidrogel, se requiere un módulo de reticulación separado y se ha agregado a la estación de trabajo. El módulo de reticulación está equipado con LEDs con una longitud de onda de 400 nm y, por lo tanto, las sustancias que excitan a una longitud de onda de luz visible se pueden utilizar con los sistemas actuales, como el trimetilbenzoilfosfinato de litio 2,4,6 (LAP)36,37. La intensidad (en mW/cm2) de los LEDs puede ser abordada por el usuario en la aplicación de diseño de protocolo para estudiar el comportamiento de reticulación38. La estación de trabajo incluye también un módulo de almacenamiento para permitir un mayor rendimiento de los estudios; sin embargo, este módulo no se utiliza dentro de este estudio y, por lo tanto, no se describe más a fondo. En general, se recomienda operar el módulo de pipeteo en un gabinete de seguridad biológica para evitar la contaminación de la muestra. El circuito de alimentación principal para operar el módulo de pipeteo es un circuito de 12 V, que se considera una aplicación de bajo voltaje en la mayoría de los países. Todos los componentes eléctricos se basan en una caja de control dedicada que evita que los usuarios entren en contacto con la fuente de un peligro eléctrico.
Al seguir estos protocolos de mezcla estandarizados, los investigadores pueden lograr mezclas confiables para materiales viscosos y no viscosos de manera automatizada. El enfoque de código abierto permite a los usuarios optimizar las secuencias de mezcla y compartir protocolos recientemente desarrollados con la comunidad. En última instancia, este enfoque facilitará la detección de múltiples combinaciones de parámetros para investigar las interdependencias entre diferentes factores y, por lo tanto, acelerar la aplicación confiable y el desarrollo de materiales viscosos para aplicaciones biomédicas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:260px;">5 mL tubes</td>
			<td style="width:301px;">Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SCT-5ML</td>
			<td style="width:301px;">size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-432-22</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;70% w/w Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">LabChem, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">aja726-5Lpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">96-well plate</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Alginate</td>
			<td style="width:301px;">NovaMatrix</td>
			<td align="right" style="width:203px;">4200001</td>
			<td>https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Demineralized or ultrapure (MilliQ) water</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:260px;">Gelatin methacryloyl (GelMA)</td>
			<td style="width:301px;">Synthetized in-house</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:301px;">detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich, Inc. (USA)</td>
			<td align="right" style="width:203px;">900889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M4 and M5 Allen key</td>
			<td style="width:301px;">OpenBuilds, inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">179, 190</td>
			<td>also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">OrangeG</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific (USA)</td>
			<td style="width:203px;">O267-25</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14190-144</td>
			<td style="width:301px;">alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Equipment</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Aluminium blocks for temperature dock</td>
			<td style="width:301px;">Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SB16</td>
			<td>blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;Analytical balance</td>
			<td style="width:301px;">Sartorius AG (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">ED224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Open source liquid handling robot: commercial product</td>
			<td style="width:301px;">Opentrons Laboratories, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">OT-One S Pro</td>
			<td>https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td>Open source liquid handling robot: open source hardware</td>
			<td>Assembled in-house following an open source approach</td>
			<td></td>
			<td>hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Positive displacement pipette: MicromanE</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">FD10006</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">BMG LABTECH GmbH (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">CLARIOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips: capillary pistons</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">F148180</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion

Los pasos de mezcla actuales de materiales viscosos se basan en tareas repetitivas y lentas que se realizan principalmente manualmente en un modo de bajo rendimiento. Estos problemas representan inconvenientes en los flujos de trabajo que, en última instancia, pueden resultar en la irreproducibilidad de los hallazgos de la investigación. Los flujos de trabajo manuales están limitando aún más el avance y la adopción generalizada de materiales viscosos, como los hidrogeles utilizados para aplicaciones biomédicas. Estos desafíos se pueden superar mediante el uso de flujos de trabajo automatizados con procesos de mezcla estandarizados para aumentar la reproducibilidad. En este estudio, presentamos instrucciones paso a paso para usar un diseñador de protocolos de código abierto, para operar una estación de trabajo de código abierto e identificar mezclas reproducibles. Específicamente, el diseñador de protocolos de código abierto guía al usuario a través de la selección de parámetros experimentales y genera un código de protocolo listo para usar para operar la estación de trabajo. Esta estación de trabajo está optimizada para pipetear materiales viscosos para permitir un manejo automatizado y altamente confiable mediante la integración de muelles de temperatura para materiales termosensibles, pipetas de desplazamiento positivo para materiales viscosos y un muelle táctil de punta opcional para eliminar el exceso de material de la punta de la pipeta. La validación y verificación de mezclas se realiza mediante una medición de absorbancia rápida y económica de Orange G. Este protocolo presenta resultados para obtener mezclas de glicerol al 80% (v/v), una serie de dilución para gelatina metacriloil (GelMA), e hidrogeles de doble red de 5% (p/v) gelMA y 2% (p/v) de alginato. Se incluye una guía de solución de problemas para ayudar a los usuarios con la adopción de protocolos. El flujo de trabajo descrito se puede aplicar ampliamente a una serie de materiales viscosos para generar concentraciones definidas por el usuario de manera automatizada.

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An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Este protocolo sirve como un tutorial completo para la mezcla estandarizada y reproducible de materiales viscosos con una novedosa tecnología de automatización de código abierto. Se proporcionan instrucciones detalladas sobre el funcionamiento de una estación de trabajo de código abierto recientemente desarrollada, el uso de un diseñador de protocolos de código abierto y la validación y verificación para identificar mezclas reproducibles.

Una plataforma tecnológica de código abierto para fabricar modelos de cultivo 3D basados en hidrogel de manera automatizada y estandarizada

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

La investigación biomédica se enfrenta a una crisis de reproducibilidad en la que los nuevos hallazgos de la investigación rara vez se traducen en aplicaciones terapéuticas. Este protocolo reduce el factor humano e introduce la automatización y la estandarización en la fabricación. Este método se centra específicamente en hidrogeles fotoreticulables para aplicaciones de cultivo celular 3D, ya que los hidrogeles se han convertido en la plataforma más utilizada en modelos de tejidos de cáncer y otras enfermedades en la última década.Hemos abordado con éxito las limitaciones actuales de hardware y software con el desarrollo de una plataforma tecnológica de código abierto. Esta plataforma ha sido diseñada específicamente para hidrogeles y permite flujos de trabajo de fabricación automatizados para la investigación de ingeniería de tejidos. Para instalar la API, abra la interfaz de línea de comandos.Para instalar la API de trabajo, escriba pip install openworkstation y pulse Intro. Para operar el módulo de biofabricación de pipeteo, ingrese el comando para instalar la API de opentrons. A continuación, utilice la línea de comandos para abrir un script de Python y comprobar si ambas API se han instalado correctamente.Para generar el código de protocolo, abra la aplicación de diseño de protocolo para generar un script de protocolo personalizado que será ejecutado por la plataforma. La interfaz se ejecuta en todos los navegadores de Internet de uso común. Escriba el nombre del protocolo en la página de configuración y haga clic en Continuar.En la configuración de la bandeja de entrada, seleccione el bloque calefactor de tres por cuatro para definir la bandeja de entrada. Para definir los materiales y las concentraciones de existencias, seleccione Gel 1 en el menú Definir entradas e introduzca GelMA como nombre. Establezca la concentración de existencias en 20% y el número de muestras en tres y haga clic en Agregar para guardar las entradas y rellenar la primera columna.Seleccione Gel 2 en el menú Definir entradas e introduzca Alginato como nombre. Establezca la concentración de existencias en 4% y el número de muestras en tres y haga clic en Agregar para guardar las entradas y rellenar la segunda columna. Después de configurar el fotoiniciador y los parámetros del diluyente como se muestra, seleccione la reticulación de la foto, establezca el tiempo en 30 segundos y la intensidad en dos y haga clic en Aceptar. A continuación, establezca el tipo de placa de pozo en placa de pozo 96 y haga clic en Grupo 1 para permitir que se especifiquen los parámetros para crear hidrogeles de doble red.A continuación, marque la casilla Aplicar protocolo de mezcla avanzado si es necesario, establezca el número de muestras en 96 y haga clic en Continuar. Para establecer el diseño de la cubierta, seleccione el tipo de bandeja adecuado para cada ranura. Cuando se hayan seleccionado todos los tipos de bandejas, haga clic en el cuadro izquierdo de la pipeta y seleccione desplazamiento positivo de 10 a 100 microlitros en el menú desplegable.Ajuste la velocidad de aspiración a 600 y la velocidad de dispensación a 800. A continuación, establezca los parámetros correctos de la pipeta de la misma manera. A continuación, haga clic en Generar protocolo para generar y guardar el script de protocolo.Antes de ejecutar el protocolo, rocíe los consumibles con etanol al 70% y colóquelos de acuerdo con la configuración definida en la configuración del usuario. Coloque los tubos de reacción con los materiales en el bloque de aluminio en los muelles de temperatura de acuerdo con la configuración seleccionada. A continuación, rocíe sus guantes con etanol al 70% y abra los tubos de reacción con cuidado sin tocar los tubos abiertos.Cuando las sustancias hayan alcanzado la temperatura experimental adecuada, ejecute el protocolo generado utilizando la interfaz de usuario. La estación de trabajo comenzará con el proceso de localización, seguido de obtener una placa de pozo vacía del módulo de almacenamiento. Después de quitar la tapa de la placa del pozo, la placa se transporta al siguiente módulo.El protocolo especifica el volumen que se canaliza de cada solución madre y cambia automáticamente las puntas después de cada material para evitar la contaminación cruzada. Para mezclar soluciones viscosas de manera reproducible, la estación de trabajo ejecuta un protocolo de mezcla específico que ha sido optimizado para hidrogeles viscosos. La aplicación de diseño de protocolo tiene en cuenta el nivel de llenado del depósito y adapta automáticamente la altura de mezcla para evitar la inmersión innecesaria en los materiales viscosos.Después de la generación automática de modelos 3D y placas de pozo, la estación de trabajo cierra la placa de pozo con la tapa nuevamente y almacena la placa de pozo en la posición programada en el módulo de almacenamiento. Una vez finalizado el protocolo, retire la placa del módulo de almacenamiento. Para la validación y verificación del protocolo realizado, cargue la placa en un espectrofotómetro y lea la absorbancia dos veces a 450 nanómetros.Después de guardar los valores de absorbancia, abra el archivo de hoja de cálculo de análisis que se proporciona como material complementario en la publicación y copie las lecturas de absorbancia en la tabla de la hoja de datos sin procesar. Luego haga clic en la hoja de análisis para ver los valores medios, la desviación estándar y los valores del coeficiente de varianza, que se calculan y muestran automáticamente para una distribución de muestra uniforme para filas específicas y para columnas específicas de una placa de 96 pocillos. Para encontrar la configuración que garantice una alta reproducibilidad para las soluciones de glicerol, se generaron protocolos sin control de temperatura y sin toque de punta, con control de temperatura y sin toque de punta, o con control de temperatura y con toque de punta.Los valores calculados del coeficiente de variación para las tres configuraciones revelaron una influencia significativa de la base de temperatura y la función táctil de punta, destacando la capacidad del protocolo para generar resultados altamente reproducibles cuando se utilizan ambas características. Utilizando la función de toque de punta con la base de temperatura, la desviación estándar se redujo significativamente en la configuración tres. El trazado de los valores de absorbancia de la muestra para la configuración tres no arrojó valores crecientes o decrecientes a lo largo del experimento y, por lo tanto, no indicó ninguna influencia de la posición de la muestra en los valores de absorbancia.A continuación, se preparó una serie de dilución de GelMA diluyendo una solución madre de GelMA al 20% y evaluando las diferencias entre las diferentes diluciones de GelMA. El valor de absorbancia medido en cada paso de concentración fue significativamente diferente y la regresión lineal demostró un ajuste alto que confirma la capacidad de generar distintos pasos de concentración. Además, se evaluó la influencia del toque de punta para hidrogeles de doble red con 5%GelMA, 2%alginato y 0,15% LAP, que se generaron automáticamente con la configuración.La integración del toque de punta da como resultado una disminución significativa de la desviación estándar que respalda la generación de un conjunto de datos reproducible. La visualización de los valores de absorbancia y los mapas de calor confirmaron la desviación reducida cuando se utiliza el toque de punta para eliminar el exceso de material de la punta. Nuestra tecnología permite la automatización de la fabricación de hidrogel para el cultivo celular 3D y la ingeniería de tejidos.Es una solución de bajo costo para aumentar el rendimiento y la reproducibilidad de flujos de trabajo técnicamente desafiantes. Al proporcionar un enfoque de código abierto personalizable, esta tecnología allana el camino para la adaptación generalizada de la automatización de procesos en la investigación de ingeniería de tejidos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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