Name: an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion
Uploaded: 2022-03-31T12:30:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion at JoVE.com

Författarna erkänner medlemmarna i Centre in Regenerative Medicine vid QUT, i synnerhet Antonia Horst och Pawel Mieszczanek för deras användbara förslag och feedback. Detta arbete stöddes av QUT: s Postgraduate Research Award för SE och av Australian Research Council (ARC) enligt bidragsavtal IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). NB stöddes av ett nationellt hälso- och sjukvårdsforskningsråd (NHMRC) Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734).

CM och DWH är grundare och aktieägare i Gelomics Pty Ltd. CM är också direktör för Gelomics Pty Ltd. Författarna förklarar ingen intressekonflikt som är relevant för ämnet för denna artikel. Författarna har inga andra relevanta anknytningar eller ekonomiskt engagemang med någon organisation eller enhet med ett ekonomiskt intresse i eller ekonomisk konflikt med ämnet eller materialet som diskuteras i artikeln förutom de som avslöjas.

Pipettering av trögflytande material, särskilt hydrogeler för biomedicinska tillämpningar19,20,21,33,47, är rutinuppgifter i många forskningslaboratorier för att förbereda en användardefinierad koncentration eller en utspädningsserie med varierande koncentrationer. Även om det är repetitivt och körningen är ganska enkel, utförs den mestadels manuellt med lågt provgenomströmning18. Denna handledning introducerar driften av en öppen källkod arbetsstation, som har utformats speciellt för trögflytande material, för att möjliggöra automatiserad blandning av trögflytande material för reproducerbar generering av önskade koncentrationer. Denna arbetsstation är optimerad för pipettering av hydrogeler för att möjliggöra automatiserad och mycket tillförlitlig hantering genom integrering av temperaturdockor för termoresponsiva material, positiva deplacementpipetter för trögflytande material och en valfri spetskontaktdocka för att avlägsna överflödigt material från spetsen. Pipetteringsmodulen har optimerats specifikt för att möjliggöra bearbetning av trögflytande material på ett standardiserat och automatiserat sätt. I jämförelse med luftkuddepipetter (figur 5a) doserar röretter med positiv deplacement (figur 5b) viskösa material utan att lämna kvar restmaterial kvar i spetsen, vilket resulterar i exakta aspirerings- och dispenseringsvolymer. Den valfria spetsbortdockan tar bort överflödigt provmaterial från spetsen (figur 5c,d), vilket är användbart för klibbiga material (t.ex. 4% (w/v) alginat).
Protokolldesignerns ansökan har programmerats speciellt för hydrogeler och möjliggör utspädning av upp till fyra reagenser med olika koncentrationer och upp till två spädningsvätska. Risken för fel vid beräkningen av slutliga utspädningar förhindras i denna applikation, eftersom användarna endast väljer önskad koncentration eller de seriella utspädningsstegen. Nödvändiga asspiraterings- och dispenseringsvolymer beräknas automatiskt, sparas i en separat dokumentationstextfil och fylls sedan i protokollskriptet. Denna protokolldesignapplikation ger användaren full kontroll över alla experimentella parametrar (t.ex. pipetteringshastighet) och säkerställer intern dokumentation av de viktiga parametrarna. Protokolldesignappen tar hänsyn till behållarens fyllningsnivå (t.ex. brunn) och varierar inandnings-/dispenseringshöjden för att förhindra onödig doppning i de trögflytande materialen. Denna integrerade funktion undviker materialackumulering på spetsens yttervägg och säkerställer därmed tillförlitliga aspirerings- och dispenseringsuppgifter i hela protokollet. Även om protokolldesignerapplikationen har utvecklats för hydrogelutspädning steg, kan den också användas för utspädning av nonviscous vätskor, såsom Orange G färgämnen. Protokolldesignerapplikationen, som är tillgänglig via databasen under "/examples/publication-JoVE", är den version som förklaras i protokollavsnittet och markeras i videon. Den här versionen kommer inte att uppdateras. En uppdaterad version av protokolldesignprogrammet är dock tillgänglig via huvudarkivsidan. Kalibreringsterminalen utvecklades ursprungligen av Sanderson48 och har optimerats för kalibrering av röretter med positiv deplacement.
Som beskrivs i protokollavsnitt 4 skall pipetter och behållare kalibreras inledningsvis. Denna kalibreringsprocess är avgörande för att definiera och spara de positioner som sedan används för att beräkna rörelsestegen. Därför förlitar sig framgångsrik protokollkörning på väldefinierade kalibreringspositioner, eftersom felaktiga kalibreringspunkter kan leda till att spetsen kraschar i en behållare. Eftersom pipetternas kolvlägen måste kalibreras manuellt beror pipetternoggrannheten och precisionen i hög grad på den utförda kalibreringen. Dessa kalibreringsprocedurer beror i hög grad på användarupplevelsen med pipetteringsmodulen, och därför rekommenderas utbildning med erfaren personal i början för att säkerställa korrekta kalibreringsförfaranden. Förutom den manuella kalibreringen på pipetteringsmodulen måste själva pipetten kalibreras för att säkerställa korrekt pipettering. Det rekommenderas att pipetten kalibreras minst var tolfte månad för att uppfylla acceptanskriterierna enligt ISO 8655. För att utvärdera pipettkalibreringen internt finns validering och verifiering tillgänglig enligt Stangegaard et al.16.
För att skapa en tillförlitlig datauppsättning är det viktigt att börja med reagenser av hög kvalitet. Detta är särskilt viktigt för hydrogelbearbetningsuppgifter, eftersom batch-till-batch-variationer kan påverka de genererade resultaten i det här protokollet. Förutom variationer från parti till parti kan subtila förändringar i beredningen av små volymer också bidra till skillnader i egenskaper. För att förhindra detta rekommenderas förberedelse av större volymer, som kan användas för hela experimenten.
Validerings- och verifieringsförfarandena bygger på användningen av ett färgämne för att identifiera tillförlitliga blandningar. Det presenterade protokollet beskriver tillämpningen av Orange G, men det allmänna protokollet och analysarbetsflödet kan också anpassas till fluorescerande färgämnen49,50. Användningen av Orange G minskar de tekniska kraven för spektrofotometern och eliminerar försiktighetsåtgärder som vidtas för att förhindra blekning av fluorescerande färgämnen efter exponering för ljus. Problem i upplösande beteende eller klusterbildning av färgämnet har inte observerats med de presenterade materialen under experiment men kan förekomma med andra material. Potentiell klusterbildning och därmed interaktionen mellan färgämne och material kan lätt detekteras med ett mikroskop.
Procedurerna och teknikerna som presenteras i den här självstudien lägger till automatiseringskapacitet till nuvarande arbetsflöden för trögflytande material för att uppnå mycket tillförlitliga uppgifter med minimalt mänskligt arbete. Den angivna felsökningstabellen (tabell 2) innehåller identifierade problem och presenterar möjliga orsaker samt lösningar för att lösa problemen. Den presenterade arbetsstationen har framgångsrikt tillämpats på naturliga (gelatin, gellan tuggummi, matrigel) och syntetiska (t.ex. poly (etylenglykol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) polymera material för automatiserade pipettering uppgifter. I synnerhet kommer kombinationen av en arbetsstation med öppen källkod och en öppen källkodsprotokolldesignapplikation utformad för trögflytande material att vara mycket användbar för forskare som arbetar inom biomedicinsk teknik, materialvetenskap och mikrobiologi.

Reproducerbarhet och reproducerbarhet är av största vikt i vetenskapligt arbete1,2,3,4. Nya rön har dock belyst betydande utmaningar när det gäller att upprepa biomedicinska studier med hög effekt inom grundläggande vetenskap samt translationell forskning4,5,6,7. Faktorer som bidrar till irreproduktible resultat är komplexa och många, såsom dålig eller partisk studiedesign6,8, otillräcklig statistisk kraft3,9, saknad överensstämmelse med rapporteringsstandarder7,10,11, tryck att publicera6 eller otillgängliga metoder eller programvarukod6,9 . Bland dem har subtila förändringar i protokollet och mänskliga fel i utförandet av experiment identifierats som ytterligare faktorer som står för irreproduktivitet4. Till exempel medför manuella pipetteringsuppgifter in- och interpersonlig imprecision12,13 och ökar sannolikheten för mänskliga fel14. Medan kommersiella vätskehanteringsrobotar kan övervinna dessa nackdelar och har visat ökad tillförlitlighet för vätskor15,16,17, är automatiserad hantering av material med betydande trögflytande egenskaper fortfarande utmanande.
Kommersiella vätskehanteringsrobotar använder ofta luftkuddepipetter, även kända som luftkolv eller luftförskjutningsrör. Reagenset och kolven separeras av en luftkudde som krymper under dispenseringsstegen och expanderar under inandningssteg. Med hjälp av luftkuddepipetter "flödar" trögflytade material endast långsamt in i och ut ur spetsen, och ett tidigt tillbakadragande av pipetten från behållaren kan leda till att luftbubblorna aspirerar. Under dispenseringsuppgifter lämnar det trögflytande materialet en film på den inre spetsväggen som "bara flyter" långsamt eller inte alls när det tvingas med luft. För att övervinna dessa problem introducerades positiva deplacementpipetter kommersiellt för att aktivt extrudera det trögflytade materialet ur spetsen med hjälp av en solid kolv. Även om dessa pipetter med positiv deplacement möjliggör korrekt och tillförlitlig hantering av trögflytande material, är automatiserade lösningar med pipetter med positiv deplacement fortfarande för dyra för akademiska laboratoriemiljöer, och därför förlitar sig de flesta arbetsflöden med trögflytande material enbart på manuella pipetteringsuppgifter18.
I allmänhet definieras viskositet som en vätskas motståndskraft mot flöde, och trögflytande material definieras vidare som material med större viskositet av vatten (0,89 mPa·s vid 25 °C). Inom biomedicinska tillämpningar innehåller experimentella inställningar ofta flera material med större viskositet än vatten, såsom dimetylsulfoxid (DMSO; 1,99 mPa·s vid 25 °C), glycerol (208,1 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s vid 25 °C för 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa 20. Hydrogeler är hydrofila polymernätverk arrangerade i ett fysiskt eller/och kemiskt läge som används för olika tillämpningar, inklusive cellinkapsling, läkemedelsleverans och mjuka ställdon19,20,21,22. Hydrogelernas viskositet beror på polymerkoncentrationen och molekylvikten19. Rutinmässigt använda hydrogeler för biomedicinska tillämpningar uppvisar viskositetsvärden mellan 1 och 1000 mPa·s, medan specifika hydrogelsystem har rapporterats med värden på upp till 6 x 107 mPa·s19,23,24. Viskositetsmätningar av hydrogeler är dock inte standardiserade när det gäller mätprotokoll och provberedning, och därför är viskositetsvärden mellan olika studier svåra att jämföra.
Eftersom kommersiellt tillgängliga automatiserade lösningar som är speciellt utformade för hydrogeler antingen saknas eller är för dyra, är nuvarande arbetsflöden för hydrogel beroende av manuell hantering18. För att förstå begränsningarna i det nuvarande manuella arbetsflödet för pipettering av hydrogeler är det viktigt att förstå viktiga hanteringsuppgifter18. Till exempel, när ett nytt hydrogelmaterial har synthetiserats, genereras en önskad koncentration eller en utspädningsserie med varierande koncentrationer för att identifiera tillförlitliga syntesprotokoll och tvärbindningsegenskaper med efterföljande analys av de mekaniska egenskaperna25,26,27,28 . I allmänhet bereds eller köps en stamlösning och blandas därefter med ett spädningsmedel och/eller andra reagenser för att få en blandning. Blandningsuppgifterna utförs oftast inte direkt i en brunnsplatta (eller något utgångsformat), och utförs snarare i ett separat reaktionsrör, som vanligtvis kallas huvudblandning. Under dessa beredningsuppgifter krävs olika aspirations- och dispenseringssteg för att överföra det trögflytande materialet,blanda reagenserna och överföra blandningen till ett utgångsformat (t.ex. en 96-brunnsplatta). Dessa uppgifter kräver en hög mängd mänskligt arbete18, långa experimentella timmar och ökar sannolikheten för mänskliga fel som potentiellt kan manifesteras som felaktiga resultat. Dessutom förhindrar manuell hantering effektiv förberedelse av höga provnummer för att screena olika parameterkombinationer för detaljerad karakterisering. Den manuella bearbetningen hindrar också användningen av hydrogeler för screeningtillämpningar med hög genomströmning, såsom identifiering av lovande föreningar under läkemedelsutveckling. De nuvarande manuella förberedelsestegen är inte genomförbara för att screena läkemedelsbibliotek som består av tusentals droger. Av dessa skäl krävs automatiserade lösningar för att tillhandahålla en effektiv utvecklingsprocess och möjliggöra en framgångsrik översättning av hydrogeler för ansökningar om läkemedelsscreening.
För att gå från manuella arbetsflöden till automatiserade processer har vi optimerat en kommersiell rördil för öppen källkod för hantering av trögflytande material genom integrering av temperaturdockor för termoresponsiva material, användning av positiva deplacementrör med kapillärkolvspetsar och en valfri spetskontaktdocka för rengöring av pipettspetsar. Denna pipetteringsrobot har integrerats ytterligare som rörledningsmodul i en nyutvecklad arbetsstation med öppen källkod, som består av färdiga och anpassningsbara moduler18,29. Detaljerade monteringsanvisningar för den utvecklade arbetsstationen, inklusive maskin- och programvarufiler, är fritt tillgängliga från GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) och Zenodo-arkivet (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Förutom maskinvaruutvecklingen har ett program för design med öppen källkod programmerats och släppts för att vägleda användaren genom parametervalsprocessen och generera en färdig protokollkod (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Denna kod körs på den kommersiella rördyssroboten med öppen källkod samt på den utvecklade arbetsstationen med öppen källkod.
Häri tillhandahålls en omfattande handledning om driften av arbetsstationen med öppen källkod för att automatisera blandningsuppgifter för trögflytande material (figur 1). De handledningsspecifika protokollstegen kan utföras med den utvecklade arbetsstationen med öppen källkod samt den kommersiella rördränningsroboten med öppen källkod. Med stöd av en egenutvecklad öppen källkod protokoll design ansökan, automatiserad blandning och beredning av erforderliga koncentrationer för glycerol, gelatin metakryloyl (GelMA) och alginat visas. Glycerol har valts i denna handledning, eftersom det är väl karakteriserat30,31, Det är billigt och lättillgängligt, och därför används det ofta som trögflytande referensmaterial för automatiserade pipettering uppgifter. Som exempel på hydrogeler som används i biomedicinska tillämpningar har GelMA och alginathydrogelprekursorlösningar tillämpats för automatiserade blandningsexperiment. GelMA presenterar en av de vanligaste hydrogelerna för cellkapslingsstudier32,33, och alginat valdes i denna studie för att visa förmågan att tillverka dubbelnät hydrogeler34,35. Med Orange G som färgämne genomfördes ett snabbt och billigt förfarande för att validera och verifiera blandningsresultaten med en spektrofotometer16.
En kommersiell rördyssrobot med öppen källkod har integrerats som rörledningsmodul i den utvecklade arbetsstationen med öppen källkod (figur 2a), och därför används namnet "pipetteringsmodul" ytterligare för att beskriva pipetterroboten. En detaljerad beskrivning av den installerade maskinvaran ligger utanför protokollets tillämpningsområde och är tillgänglig via de medföljande databaserna som också innehåller steg-för-steg-instruktioner för den öppna källkodsplattformens generalförsamling. Pipettermodulen kan utrustas med två pipetter (en- eller 8-kanals pipett) som är installerade på axel A (höger) och axel B (vänster) (bild 2b). Pipetteringsmodulen erbjuder en 10-däckskapacitet enligt American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS) standarder, och följande platspositioner definieras på däcket: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (figur 2c). För att initiera fotoinducerad polymerisation av hydrogellösningar krävs en separat tvärlänkmodul och har lagts till på arbetsstationen. Tvärbindningsmodulen är utrustad med lysdioder med en våglängd på 400 nm och därför kan ämnen som exciterar vid en synlig ljusvåglängd användas med de nuvarande systemen, såsom litiumfenyl-2,4,6 trimethylbenzoylfosphinate (LAP)36,37. Intensiteten (i mW/cm2) av lysdioderna kan adresseras av användaren i protokolldesignprogrammet för att studera korslänkningsbeteendet38. Arbetsstationen innehåller även en lagringsmodul för att möjliggöra ökade genomströmningsstudier; Denna modul används dock inte inom denna studie och beskrivs därför inte ytterligare. I allmänhet rekommenderas att pipetteringsmodulen används i ett biologiskt säkerhetsskåp för att undvika provkontaminering. Huvudströmkretsen för att driva pipetteringsmodulen är en 12 V-krets, vilket anses vara en lågspänningsapplikation i de flesta länder. Alla elektriska komponenter är baserade i en särskild kontrollbox som hindrar användare från att komma i kontakt med källan till en elektrisk fara.
Genom att följa dessa standardiserade blandningsprotokoll kan forskare uppnå tillförlitliga blandningar för trögflytande såväl som icke-trögflytande material på ett automatiserat sätt. Metoden med öppen källkod gör det möjligt för användare att optimera blandningssekvenser och dela nyutvecklade protokoll med communityn. I slutändan kommer detta tillvägagångssätt att underlätta screeningen av flera parameterkombinationer för att undersöka det ömsesidiga beroendet mellan olika faktorer och därigenom påskynda tillförlitlig tillämpning och utveckling av trögflytande material för biomedicinska tillämpningar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:260px;">5 mL tubes</td>
			<td style="width:301px;">Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SCT-5ML</td>
			<td style="width:301px;">size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-432-22</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;70% w/w Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">LabChem, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">aja726-5Lpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">96-well plate</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Alginate</td>
			<td style="width:301px;">NovaMatrix</td>
			<td align="right" style="width:203px;">4200001</td>
			<td>https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Demineralized or ultrapure (MilliQ) water</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:260px;">Gelatin methacryloyl (GelMA)</td>
			<td style="width:301px;">Synthetized in-house</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:301px;">detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich, Inc. (USA)</td>
			<td align="right" style="width:203px;">900889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M4 and M5 Allen key</td>
			<td style="width:301px;">OpenBuilds, inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">179, 190</td>
			<td>also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">OrangeG</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific (USA)</td>
			<td style="width:203px;">O267-25</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14190-144</td>
			<td style="width:301px;">alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Equipment</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Aluminium blocks for temperature dock</td>
			<td style="width:301px;">Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SB16</td>
			<td>blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;Analytical balance</td>
			<td style="width:301px;">Sartorius AG (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">ED224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Open source liquid handling robot: commercial product</td>
			<td style="width:301px;">Opentrons Laboratories, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">OT-One S Pro</td>
			<td>https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td>Open source liquid handling robot: open source hardware</td>
			<td>Assembled in-house following an open source approach</td>
			<td></td>
			<td>hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Positive displacement pipette: MicromanE</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">FD10006</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">BMG LABTECH GmbH (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">CLARIOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips: capillary pistons</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">F148180</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion

Nuvarande blandningssteg av trögflytande material förlitar sig på repetitiva och tidskrävande uppgifter som huvudsakligen utförs manuellt i ett lågt genomströmningsläge. Dessa problem representerar nackdelar i arbetsflöden som i slutändan kan leda till irreproduktivt av forskningsresultat. Manuella arbetsflöden begränsar ytterligare utvecklingen och den utbredda användningen av trögflytande material, till exempel hydrogeler som används för biomedicinska tillämpningar. Dessa utmaningar kan övervinnas genom att använda automatiserade arbetsflöden med standardiserade blandningsprocesser för att öka reproducerbarheten. I den här studien presenterar vi steg-för-steg-instruktioner för att använda en protokolldesigner med öppen källkod, för att driva en arbetsstation med öppen källkod och för att identifiera reproducerbara blandningar. Specifikt vägleder protokolldesignern med öppen källkod användaren genom det experimentella parametervalet och genererar en färdig protokollkod för att använda arbetsstationen. Denna arbetsstation är optimerad för pipettering av trögflytande material för att möjliggöra automatiserad och mycket tillförlitlig hantering genom integrering av temperaturdockor för termoresponsiva material, positiva deplacementpipetter för trögflytande material och en valfri spetskontaktdocka för att avlägsna överflödigt material från pipettspetsen. Validering och verifiering av blandningar utförs genom en snabb och billig absorbansmätning av Orange G. Detta protokoll presenterar resultat för att erhålla 80% (v/v) glycerol blandningar, en utspädning serie för gelatin metakryloyl (GelMA) och dubbla nätverk hydrogeler av 5% (w/v) GelMA och 2% (w/v) alginat. En felsökningsguide ingår för att stödja användare med protokollimplementering. Det beskrivna arbetsflödet kan i stor utsträckning tillämpas på ett antal trögflytande material för att generera användardefinierade koncentrationer på ett automatiserat sätt.

Denna handledning presenterar resultat för experiment med glycerol (figur 3) och GelMA med LAP och alginat (figur 4).
Genereringen av en 80% (v/v) glycerollösning undersöktes antingen utan temperaturkontroll (rumstemperatur, 22 °C) och utan spetstouch (definierad som inställning 1), med temperaturkontroll (40 °C) och utan spetstouch (inställning 2), eller med temperaturkontroll (40 °C) och med spetstouch (inställning 3) (bild 3a-i). Dessa två temperaturinställningar valdes för att utvärdera hanteringsskillnaden, eftersom glycerolens viskositet minskar nästan med en faktor 3 när den värms upp från 22 °C (139,5 mPa·s) till 40 °C (46,6 mPa·s)30. En 85% (v/v) lagerlösning av glycerol späddes ut till en slutlig koncentration på 80% och jämnt fördelades i en 96 brunnsplatta (n = 96 per inställning). Försökstiden, som inkluderar dispensering av varje material i blandningsröret, respektive blandningsuppgifter och provfördelningen till en 96-brunnsplatta, var 30 min 42 s. För att identifiera skillnader mellan utspädningsblandningar framställdes ultrapure vatten- som spädningsvätska för glycerol – med 1 mg/ml Orange G. Absorbansavläsningarna belyser att integreringen av temperaturkontrollen och spets beröringen avsevärt påverkar blandningarna (s < 0,0001). Utöver den utförda tvåvägsanalysen av variansen (ANOVA) beräknades CV-värdena för att utvärdera den relativa standardavvikelsen. Variationskoefficienten beskriver en standardiserad indikator för att identifiera graden av avvikelse i förhållande till medelvärdet och uttrycks i procent. Om provmedlen inte är särskilt intressanta, utan variabiliteten inom mätningarna, ger variationskoefficienten ytterligare insikter för att identifiera reproducerbara blandningar46. I det här experimentet med tre olika inställningar visade absorbansvärdena minskande CV-värden från 5,6%, 4,2%, till 2,0% för inställning 1, inställning 2 och inställning 3, vilket visar den betydande påverkan av temperaturdockan och tipstouchfunktionen på att producera tillförlitliga resultat (figur 3a-ii). Plottning av provabsorberingsvärden för inställning 3 (provnummer #1 till #96 i en 96-brunnsplatta) ger inga ökande eller minskande värden under hela försöket och indikerar därför ingen inverkan av provpositionen på absorbansvärdena (figur 3a-iii). Visualisering av data för varje uppmätt brunnsplatta med värmekartor ger ytterligare insikter för att identifiera heterogeniteter för en viss rad eller kolumn, eller varierande absorbansvärden under hela dispenseringsuppgifterna. De visualiserade värmekartorna för de tre installationerna visar minskade heterogeniteter över hela brunnsplattorna från inställning 1 till inställning 3 (bild 3b). Slutligen utvärderades reproducerbiliteten av den genomförda blandningen inom åtta oberoende körningar (figur 3c-i,ii), där varje körning tog 6 min 57 s. Enskilda blandningskörningar visade låga CV-värden mellan 1,1% och 2,6%, vilket indikerar mycket tillförlitliga blandnings- och dispenseringsuppgifter för de enskilda körningarna. Absorbansvärden för alla åtta körningar gav ett CV-värde på 3,3% och visade reproducerbarheten hos det etablerade blandningsprotokollet.
GelMA utspädningsserier framställdes genom utspädning av en 20% (w/v) stamlösning med PBS till 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 och 0% (w/v) och lägga till LAP till en konstant koncentration av 0,15% (w/v) (figur 4a-i), som tog totalt 55 min 12 s. Som anges i det experimentella protokollskriptet var hydrogelen korslänkning för 30 s med en intensitet på 2,0 mW/cm2 vid 400 nm. För att utvärdera skillnaderna mellan blandningarna framställdes PBS- eftersom spädningsmedlet för GelMA och alginat – med 1 mg/ml Orange G. Därför identifieras absorbansskillnaden mellan proverna inom en blandning och mellan de seriella utspädningarna med en spektrofotometer. Uppmätta absorbansvärden för varje koncentrationssteg är signifikant olika (p < 0,0001) och har mycket låga CV-värden mellan 1,2% och 3,4% under koncentrationsstegen (n = 12 per koncentrationssteg). Linjär regression visade hög passform med ett R²-värde på 0,9869 (figur 4a-ii) och en värmekarta bekräftade den homogena fördelningen för varje koncentration och skillnaden mellan koncentrationerna (figur 4a-iii). Automatiserad blandning av fyra reagenser utfördes för generering av 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginat, 0,15% (w/v) LAP och PBS som spädningslösning utan (inställning 2) och med (inställning 3) beröringsspets (n = 96 för varje inställning) med samma korslänkningsparametrar (30 s, 2,0 mW/cm2). Dispensering av de fyra materialen, blandning och distribution till en 96 brunnsplatta tog 32 min 22 s. Alla experiment med GelMA och alginat utfördes vid 37 °C för att förhindra termisk gelering som förhindrar pipettering av GelMA. Med alternativet tip touch sänktes CV-värdet från 5,2% till 3,4% och särskilt avvikande värden i den nedre regionen förhindrades genom att ta bort överflödigt material från spetsen (figur 4b-i). Även om medelvärdet 1,927 och 1,944 för inställning 2 och inställning 3 är mycket nära, belyser variationskoefficienten den minskande avvikelsen i förhållande till medelvärdet. Enstaka rader på 96-brunnsplattan kan jämföras med varandra med hjälp av en värmemappsvisualisering för att upptäcka rad- och/eller kolumnskillnader (bild 4b-ii).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig1.jpg"> Bild 1: Protokollarbetsflöde med enskilda uppgifter. Det beskrivna arbetsflödet är indelat i sju aktiviteter som är uppdelade i inställningar, förberedelse, körning och analys. I början måste programvaran (uppgift 1) samt maskinvaran (uppgift 2) ställas in. Efter beredningen av materialen (uppgift 3) och genereringen av protokollskriptet (uppgift 4) kalibreras pipettermodulen genom att definiera pipetten och behållarens positioner (uppgift 5). Därefter körs protokollskriptet på arbetsstationen (uppgift 6) och validering och verifiering (uppgift 7) av blandningar utförs för att utvärdera blandningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig2.jpg"> Bild 2: Arbetsstation med öppen källkod och däckinställning för pipetteringsmodulen. a) Den utvecklade arbetsstationen är inspirerad av en monteringslinjemetod, där prover transporteras genom olika moduler, och består av följande moduler: pipettering, tvärlänk, lagring, transport och beräkningsmodul. b) Pipettermodulens däck är inställt beroende på försökslayouten (t.ex. brunnsplåtstyp, rörvolym osv.). Den visade däckinställningen användes för de presenterade experimenten och består av positiva deplacementpipetter med ett intervall från 10−100 μL (M100E) och 100−1000 μL (M1000E), spetsställen med kapillärkolvar (CP) för 100 μL (CP1000) och 1 000 μL (CP1000), en soptunna. c) De tillgängliga däckspositionerna definieras med de visade siffrorna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig3.jpg"> Figur 3: Resultat för automatiserad pipettering av glycerolblandningar. a) Den flexibla arbetsstationsdesignen gör det möjligt att utvärdera tre olika inställningar (i) för att identifiera optimala parametrar för reproducerbara resultat. ii) Tillsats av en spetstouch och uppvärmning av materialet resulterade i en minskad varianskoefficient (CV) och mycket reproducerbara blandningar för inställning 3. Varje experiment utfördes med 96 prover. iii) Plottning av enskilda provvärden visade ingen inverkan på pipetteringssekvensen. b) Experimentella resultat av varje inställning visualiserades med värmekartor för att identifiera påverkan på råa/kolumn skillnader, kanter eller huvudblandning. c) Reproducerbarheten för inställning 3 analyserades inom åtta oberoende körningar med hjälp av (i) median, standardavvikelse, CV-värde och (ii) värmekartor. Data i panelerna a-ii (n = 96) och b-i (n = 12) presenteras med medel och enskilda datapunkter. Statistisk signifikans definierades som ****p < 0,0001 med hjälp av tvåvägsanalys av varians (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig4.jpg"> Figur 4: Resultat för blandning av uppgifter med hydrogeler. a) Från en gelatinmetacryloyl (GelMA) 20% (w/v) stamlösning genererades en seriell utspädning på 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 och 0% (w/v) inom en experimentell körning med en 96 brunnsplatta (n = 12 per koncentration). i) Varianskoefficienten (CV) varierade mellan 1,2 % och 3,4 % under de beredda koncentrationerna, och ii) linjär regression visade en hög passform med ett R²-värde på 0,9869. iii) Homogena utspädningar bekräftades visuellt med den genererade värmekartan. b) Dubbelnät hydrogeler genererades med 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginat och 0,15% (w/v) LAP (i) med och utan spetstouch (n = 96 för varje inställning) och korsade i 30 s med en intensitet av 2,0 mW/cm2 vid 400 nm. Integreringen av tip touch resulterade i minskade CV-värden från 5,2% till 3,4%. ii,iii) Värmekartor bekräftar färre avvikelser vid användning av spetstouch för att avlägsna överflödigt material från spetsen. Data i panelerna a-i och b-i presenteras med medel och enskilda datapunkter. Statistisk signifikans definierades som *p < 0,05, ***p < 0,001 och ****p < 0,0001 med hjälp av envägsanalys av varians (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig5.jpg"> Figur 5: Sammanfattning av pipetttypsskillnaden och problem med trögflytade biomaterial. a) Reagenset och kolven separeras av en luftkudde som krymper under dispenseringsstegen och expanderar under inandningssteg. Vid inandning och dispensering av trögflytande material introducerar det långsamma "flödet" problem som luftbubblor och oregelbundet pipetteringsbeteende. b) Röretter med positiv deplacement möjliggör tillförlitlig inandning och dispensering av viskös material genom användning av en kolv inuti spetsen. c) Pipettering av mycket trögflytande material (t.ex. 4 % (w/v) alginat) kan leda till ackumulering av överflödigt material på spetsen, vilket leder till felaktigheter under försöken. d) Genomförandet av en enkel spetspekbricka gör det möjligt att avlägsna överflödigt material på spetsen och resulterar i exakta aspirerings- och dispenseringsvolymer. Detta realiseras genom att använda insidan av brunnsplattans lock som placeras på en spetsställbehållare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:font-size="9px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Material #1 (lagerkoncentration)</td>
			<td>Slutlig koncentration av material #1</td>
			<td>Material #2 (lagerkoncentration)</td>
			<td>Slutlig koncentration av material #2</td>
			<td>Material #3 (lagerkoncentration)</td>
			<td>Slutlig koncentration av material #3</td>
			<td>Spädd (Orange G arbetslösning)</td>
			<td>Slutlig Orange G-koncentration i blandning</td>
			<td>Visas i figur</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol (85% (v))</td>
			<td>80% (v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>vatten (1 mg/ml Orange G)</td>
			<td>0,059 mg/mL</td>
			<td>Bild 3a−c</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>0% (v/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>Bild 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>2% (w/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,85 mg/ml</td>
			<td>Bild 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>4% (v/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,75 mg/ml</td>
			<td>Bild 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>6% (v/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,65 mg/ml</td>
			<td>Bild 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>8% (v/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,55 mg/ml</td>
			<td>Bild 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>10% (v/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,45 mg/ml</td>
			<td>Bild 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>12% (v/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,35 mg/ml</td>
			<td>Bild 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>14% (v/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,25 mg/ml</td>
			<td>Bild 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>5% (v/v)</td>
			<td>Alginat (4% (w/v))</td>
			<td>2% (w/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,2 mg/ml</td>
			<td>Bild 4b</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Parameteröversikt för de genomförda experimenten.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Protokollsteg</td>
			<td>Problem</td>
			<td>Möjlig orsak</td>
			<td>Lösning</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1</td>
			<td>Programvara kan inte installeras eller uppdateras</td>
			<td>Slut på diskutrymme på SD-kort</td>
			<td>Kontrollera diskutrymmet på SD-kortet. Om det behövs tar du bort onödiga artiklar, tömde lagerplats eller använder ett SD-kort av lämplig storlek</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>API kan inte installeras</td>
			<td>Användarnas installationsförmåga är begränsad (ingen root-användarbehörighet)</td>
			<td>Använd kommandot sudo framför angivna kommandon för att få administratörsrättigheter. I Linux kallas denna typ av åtkomst som superanvändaren.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3.1</td>
			<td>Problem med GelMA</td>
			<td>Funktionalisering, dialys eller frysning</td>
			<td>Detaljerad steg-för-steg-protokoll inklusive felsökningslista finns i Loessner et al.33.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.1 och 6.2</td>
			<td>Arbetsstationen reagerar inte på kommandon</td>
			<td>Anslutningsproblem</td>
			<td>Vänd på allt och stäng av datorn. Stäng av strömförsörjningen i 10 s. Strömdator och arbetsstation på igen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.1 och 6.2</td>
			<td>Arbetsstationen reagerar inte på kommandon</td>
			<td>Anslutningsproblem</td>
			<td>Kontrollera om datorn känner igen USB-anslutningen och USB-porten är korrekt definierad. Kontrollera att brandväggen inte hindrar anslutningsprocessen (se länken nedan tabell 2).</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.1 och 6.2</td>
			<td>Det går inte att öppna filen</td>
			<td>Fel katalog</td>
			<td>Kontrollera regissören (mappsökvägen) för att se till att rätt sökväg används. Om det inte går att hitta en fil (t.ex. interface.py) är det troligt att fel sökväg används.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Spetsen är inte korrekt fastsatt eller faller under rörelse</td>
			<td>Kalibreringsproblem</td>
			<td>Upprepa kalibreringsstegen för pipetten och se till att kapillärkolven är korrekt ansluten till pipetten.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Spetsen är inte korrekt fastsatt eller faller under rörelse</td>
			<td>Problem med bifogad fil</td>
			<td>Pipetten är inte korrekt ansluten till pipettens axel och rör sig under rörelsestegen. Dra åt skruvarna ordentligt för att förhindra detta.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Tips är att aspirera över material</td>
			<td>Kalibreringsproblem</td>
			<td>Upprepa kalibreringen av denna facktyp för att definiera höjden korrekt.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Tips är att aspirera över material</td>
			<td>Kalibreringsproblem</td>
			<td>Kontrollera volymen i röret och kontrollera att volymen är lika med den volym som definieras i protokolldesignerprogrammet.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Materialet doppar under rörelse</td>
			<td>För mycket överflödigt material på spetsen</td>
			<td>Lägg till alternativet pekdocka för tips; Alternativt kan även tiden för spetstouch ökas.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Materialet är fast eller för trögflytande för pipettering</td>
			<td>Termoresponsivt beteende hos material</td>
			<td>Kontrollera termoresponsiv materialkarakterisering och justera temperaturens värme-/kyltemperatur i enlighet därmed.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Felsökningstabell med identifierade problem, möjliga orsaker samt lösningar för att lösa problemen.
Kompletterande fil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/supplementary_template-analysis.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion at JoVE.com

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Detta protokoll fungerar som en omfattande handledning för standardiserad och reproducerbar blandning av trögflytande material med en ny automatiseringsteknik med öppen källkod. Detaljerade instruktioner ges om driften av en nyutvecklad arbetsstation med öppen källkod, användningen av en protokolldesigner med öppen källkod och validering och verifiering för att identifiera reproducerbara blandningar.

En öppen källkodsteknikplattform för tillverkning av hydrogelbaserade 3D-kulturmodeller på ett automatiserat och standardiserat sätt

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Biomedicinsk forskning står inför en reproducerbarhetskris genom att nya forskningsresultat sällan omsätts i terapeutiska tillämpningar. Detta protokoll minskar den mänskliga faktorn och introducerar automatisering och standardisering i tillverkningen. Denna metod fokuserar specifikt på fotolänkbara hydrogeler för 3D-cellodlingsapplikationer eftersom hydrogeler har blivit den mest använda plattformen i cancer och andra sjukdomsvävnadsmodeller under det senaste decenniet.Vi har framgångsrikt tagit itu med de nuvarande hårdvaru- och programvarubegränsningarna med utvecklingen av en öppen källkodsteknikplattform. Denna plattform har utformats speciellt för hydrogeler och möjliggör automatiserade tillverkningsarbetsflöden för vävnadsteknikforskning. Om du vill installera API:et öppnar du kommandoradsgränssnittet.Om du vill installera arbets-API:et anger du öppna arbetsstationen för pipinstallation och trycker på Retur. Om du vill använda biotillverkningsmodulen för pipettering anger du kommandot för att installera opentrons-API:et. Använd sedan kommandoraden för att öppna ett Python-skript och kontrollera om båda API:erna har installerats.Om du vill generera protokollkoden öppnar du protokolldesignprogrammet för att generera ett anpassat protokollskript som ska köras av plattformen. Gränssnittet körs på alla vanliga webbläsare. Ange protokollnamnet på inställningssidan och klicka på Fortsätt.I inmatningsfackets inställningar väljer du tre gånger fyra värmeblock för att definiera ingångsfacket. Om du vill definiera material och lagerkoncentrationer väljer du Gel 1 på menyn definiera indata och anger GelMA som namn. Ställ in lagerkoncentrationen till 20 % och antalet exempel på tre och klicka på Lägg till för att spara transaktionerna och fylla i den första kolumnen.Välj Gel 2 på menyn definiera indata och ange Alginat som namn. Ställ in lagerkoncentrationen till 4 % och antalet exempel på tre och klicka på Lägg till för att spara transaktionerna och fylla i den andra kolumnen. När du har ställt in parametrarna för fotoinitiator och spädning som visas väljer du korslänkning av foto, ställer in tiden till 30 sekunder och intensiteten till två och klickar på OK. Ställ sedan in brunnsplattans typ på 96 brunnsplatta och klicka på Grupp 1 för att tillåta att parametrarna för att skapa dubbla nätverkshydrogeler specificeras.Markera sedan rutan använd avancerat blandningsprotokoll om det behövs, ange antalet exempel på 96 och klicka på Fortsätt. Om du vill ställa in däckslayouten väljer du lämplig facktyp för varje fackplats. När alla facktyper har valts klickar du på pipettens vänstra ruta och väljer 10 till 100 mikroliter positiv förskjutning på rullgardinsmenyn.Ställ in inandningshastigheten på 600 och dispenseringshastigheten till 800. Ställ sedan in pipettens rätt parametrar på samma sätt. Klicka sedan på Generera protokoll för att generera och spara protokollskriptet.Innan du kör protokollet, spraya förbrukningsvarorna med 70% etanol och placera dem enligt den inställning som definieras i användarinställningen. Placera reaktionsrören med materialen i aluminiumblocket på temperaturdockorna enligt den valda inställningen. Spraya sedan dina handskar med 70% etanol och öppna reaktionsrören försiktigt utan att röra vid öppnade rör.När ämnena har nått lämplig experimentell temperatur, kör det genererade protokollet med hjälp av användargränssnittet. Arbetsstationen börjar med 8-tiden, följt av att få en tom brunnsplatta från lagringsmodulen. Efter att locket tagits bort från brunnsplattan transporteras plattan till nästa modul.Protokollet anger volymen som pipetts från varje lagerlösning och ändrar automatiskt spetsarna efter varje material för att förhindra korskontaminering. För att blanda trögflytande lösningar på ett reproducerbart sätt utför arbetsstationen ett specifikt blandningsprotokoll som har optimerats för viskösa hydrogeler. Protokolldesignappen tar hänsyn till behållarens fyllningsnivå och anpassar automatiskt blandningshöjden för att förhindra onödig doppning i de trögflytande materialen.Efter automatisk generering av 3D-modeller och brunnsplattor stänger arbetsstationen brunnsplattan med locket igen och lagrar brunnsplattan i programmerad position i förvaringsmodulen. När protokollet är klart tar du bort plattan från lagringsmodulen. För validering och verifiering av det utförda protokollet, lasta plattan på en spektrofotometer och avläs absorbansen två gånger vid 450 nanometer.När du har sparat absorbansvärdena öppnar du analyskalkylarkfilen som tillhandahålls som kompletterande material i publikationen och kopierar absorbansavläsningarna i tabellen i råddatabladet. Klicka sedan på analysbladet för att visa medelvärdena, standardavvikelsen och varianskoefficienten, som automatiskt beräknas och visas för en enhetlig provfördelning för specifika rader och för specifika kolumner i en 96-brunnsplatta. För att hitta installationen som säkerställer en hög reproducerbarhet för glycerollösningar, skapades protokoll utan temperaturkontroll och utan spetstouch, med temperaturkontroll och utan spetstouch, eller med temperaturkontroll och med spetstouch.Den beräknade variationskoefficienten för de tre installationerna visade en betydande inverkan av temperaturdockan och tip touch-funktionen, vilket belyser protokollets förmåga att generera mycket reproducerbara resultat när de används båda funktionerna. Med hjälp av spetskontaktfunktionen med temperaturdockan minskades standardavvikelsen avsevärt i inställning tre. Plottning av provabsorberingsvärdena för inställning tre gav inga ökande eller minskande värden under hela försöket och indikerade därför ingen inverkan av provpositionen på absorbansvärdena.Därefter utarbetades en GelMA utspädningsserie genom utspädning av en 20% GelMA-stamlösning och bedömning av skillnaderna mellan olika GelMA-utspädningar. Absorbansvärdet mätt vid varje koncentrationssteg var signifikant olika och linjär regression visade en hög passform som bekräftar förmågan hos distinkta koncentrationssteg att genereras. Dessutom utvärderades påverkan av tip touch för dubbla nätverkshydrogeler med 5%GelMA, 2% alginat och 0,15%LAP, som automatiskt genererades med installationen.Integreringen av tip touch resulterar i en betydande minskning av standardavvikelsen som stöder generering av en reproducerbar datauppsättning. Visualisering av absorbansvärden och värmekartor bekräftade den minskade avvikelsen vid användning av spetstouch för att ta bort överflödigt material från spetsen. Vår teknik möjliggör automatisering av hydrogeltillverkning för 3D-cellkultur och vävnadsteknik.Det är en billig lösning för att öka data flödet och reproducerbarheten för tekniskt utmanande arbetsflöden. Genom att tillhandahålla en anpassningsbar öppen källkodsmetod banar denna teknik väg för en utbredd anpassning av processautomation inom vävnadsteknikforskning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: en automatiserad plattform för biomassa Enzyme Discovery och Cocktail optimering

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Utveckling av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Ögon plattformen Testa Kontaktlinser

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

En additiv tillverkning teknik för lättköpt och snabb tillverkning av Hydrogel-baserade Micromachines med magnetiskt lyhörd komponenter

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En ultrahög kapacitet mikroflödessystem plattform för Single-cell Genomsekvensering

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En ny kirurgisk teknik som en grund för In Vivo delvis lever Engineering i råtta

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Design av en öppen källkod, billiga Bioink och Mat Melt Extrusion 3D-skrivare

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Applikationer för öppen källkod Microplate-kompatibla belysnings paneler

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening och identifiering av små peptider riktade fibroblast tillväxtfaktor Receptor2 använda en phage display peptid bibliotek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoll för 3D Bioprinning av gelatin Methacryloyl hydrogel baserade Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...