Name: a high-throughput image-guided stereotactic neuronavigation and focused ultrasound system for blood-brain barrier opening in rodents
Uploaded: 2020-07-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents at JoVE.com

Dette prosjektet ble finansiert av KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma and High-grade Glioma). Vi takker Ilya Skachkov og Charles Mougenot for deres innspill i utviklingen av systemet.

Alle in vivo-eksperimenter ble godkjent av den nederlandske etiske komiteen (lisenstillatelsesnummer AVD114002017841) og Dyrevelferdsorganet til Vrije Universiteit Amsterdam, Nederland. Etterforskerne ble opplært i det grunnleggende i FUS-systemet for å minimere ubehaget til dyrene.
1. Fokusert ultralydsystem
MERK: Det beskrevne oppsettet er et innebygd BBB-avbruddssystem basert på kommersielt tilgjengelige komponenter og inkluderer en 3D-trykt skreddersydd kjegle ...

I denne studien utviklet vi et kostnadseffektivt bildestyrt basert FUS-system for forbigående BBB-forstyrrelser for økt legemiddellevering i hjerneparenchyma. Systemet ble i stor grad bygget med kommersielt tilgjengelige komponenter og i forbindelse med røntgen og BLI. Modulariteten til den foreslåtte utformingen tillater bruk av flere bildemodaliteter for planlegging og vurdering i arbeidsflyter med høy gjennomstrømning. Systemet kan kombineres med mer omfattende høyoppløselige 3D-avbildningsmodaliteter, for eks...

Blod-hjernebarrieren (BBB) er et stort hinder for legemiddellevering i hjernen parenchyma. De fleste terapeutiske legemidler som er utviklet, krysser ikke BBB på grunn av deres fysisk-kjemiske parametere (f.eks. lipofilitet, molekylvekt, hydrogenbindings akseptorer og donorer) eller beholdes ikke på grunn av deres affinitet for eflukstransportører i hjernen1,2. Den lille gruppen medikamenter som kan krysse BBB er vanligvis små lipofile molekyler, som bare er effektive i et begrenset antall hjernesykdommer1,2. Som en konsekvens, for de fleste hjernesykdommer, er farmakologiske behandlingsalternativer begrenset og nye legemiddelleveringsstrategier er nødvendige3,4.
Terapeutisk ultralyd er en ny teknikk som kan brukes til forskjellige nevrologiske applikasjoner som BBB-forstyrrelse (BBBD), nevromodulering og ablasjon4,5,6,7. For å oppnå en BBB-åpning med en ekstrakorporeal ultralydemitter gjennom kraniet, kombineres fokusert ultralyd (FUS) med mikrobobler. Mikrobubble-mediert FUS resulterer i økt biotilgjengelighet av legemidler i hjernen parenchyma5,8,9. I nærvær av lydbølger begynner mikrobobler å svinge initiere transcytose og forstyrrelse av de tette kryssene mellom endotelcellene i BBB, noe som muliggjør paracellulær transport av større molekyler10. Tidligere studier bekreftet sammenhengen mellom intensiteten av det akustiske utslippet og den biologiske effekten på BBB-åpningen11,12,13,14. FUS i kombinasjon med mikrobobler har allerede blitt brukt i kliniske studier for behandling av glioblastom ved bruk av temozolomid eller liposomal doksorubicin som kjemoterapeutisk middel, eller til behandling av Alzheimers sykdom og amyotrofisk lateral sklerose5,9,15,16.
Siden ultralydmediert BBB-åpning resulterer i helt nye muligheter for farmakoterapi, er preklinisk forskning for klinisk oversettelse nødvendig for å vurdere behandlingsresponsen til utvalgte legemiddelkandidater. Dette krever vanligvis en arbeidsflyt med høy gjennomstrømning med både høy romlig presisjon og helst en integrert kavitasjonsdeteksjon for overvåking av målrettet BBB-åpning med høy reproduserbarhet. Hvis det er mulig, må disse systemene være kostnadseffektive i både innledende investeringer og driftskostnader for å kunne skaleres i henhold til studiestørrelsen. De fleste prekliniske FUS-systemer kombineres med MR for image-veiledning og behandlingsplanlegging15,17,18,19. Selv om MR gir detaljert informasjon om tumoranatomien og volumet, er det en dyr teknikk, som vanligvis utføres av trente / dyktige operatører. I tillegg kan høyoppløselig MR ikke alltid være tilgjengelig for forskere i prekliniske anlegg og krever lange skannetider per dyr, noe som gjør den mindre egnet for farmakologiske studier med høy gjennomstrømning. Bemerkelsesverdig er at for preklinisk forskning innen nevro-onkologi, spesielt infiltrative tumormodeller, er muligheten til å visualisere og målrette svulsten avgjørende for behandlingssuksess20. For tiden er dette kravet bare oppfylt av MR eller av svulster transdusert med et fotoprotein, noe som muliggjør visualisering med bioluminescensavbildning (BLI) i kombinasjon med administrering av fotoproteinunderlaget.
MR-styrte FUS-systemer bruker ofte et vannbad for å sikre ultralydbølgeutbredelse for transkranielle applikasjoner, hvorved dyrets hode er delvis nedsenket i vannet, de såkalte ''bottom-up'' systemene15,17,18. Selv om disse designene generelt fungerer godt i mindre dyrestudier, er de et kompromiss mellom dyreforberedelsestider, bærbarhet og realistisk vedlikeholdbare hygieniske standarder under bruk. Som et alternativ til MR omfatter andre veiledningsmetoder for stereotaktisk navigasjon bruk av et anatomisk gnageratlas21,22,23, laserpekerassistert visuell observasjon24, pinhole-assistert mekanisk skanneenhet25eller BLI26. De fleste av disse designene er "ovenfra og ned" -systemer der svingeren er plassert på toppen av dyrets hode, med dyret i en naturlig posisjon. Arbeidsflyten ''ovenfra og ned' består av enten et vannbad22,25,26 eller en vannfylt kjegle21,24. Fordelen med å bruke en svinger i en lukket kjegle er det mer kompakte fotavtrykket, kortere oppsettstid og rett frem dekontamineringsmuligheter som forenkler hele arbeidsflyten.
Samspillet mellom det akustiske feltet med mikroboblene er trykkavhengig og spenner fra lav-amplitude oscillasjoner (referert til som stabil kavitasjon) til forbigående boblekollaps (referert til som inertiell kavitasjon)27,28. Det er en etablert konsensus om at ultralyd-BBBD krever et akustisk trykk godt over den stabile kavitasjonsterskelen for å oppnå vellykket BBBD, men under den inertiske kavitasjonsterskelen, som generelt er forbundet med vaskulær / nevronskade29. Den vanligste formen for overvåking og kontroll er analysen av det (bak)spredte akustiske signalet ved hjelp av passiv kavitasjonsdeteksjon (PCD), som foreslått av McDannold et al.12. PCD er avhengig av analysen av Fourier-spektraet av mikrobubble utslippssignaler, der styrken og utseendet til stabile kavitasjonsmerker (harmonikk, subharmonikk og ultraharmonikk) og inertial kavitasjonsmarkører (bredbåndsrespons) kan måles i sanntid.
En "one size fits all" PCD-analyse for presis trykkkontroll er komplisert på grunn av mikrobubbleformuleringens polydispersitet (oscillasjonsamplituden avhenger sterkt av boblediameteren), forskjellene i bobleskallegenskaper mellom merker og akustisk oscillasjon, som avhenger sterkt av frekvens og trykk30,31,32. Som en konsekvens er det foreslått mange forskjellige PCD-deteksjonsprotokoller, som er tilpasset bestemte kombinasjoner av alle disse parametrene og har blitt brukt i ulike applikasjonsscenarier (alt fra in vitro-eksperimentering over små dyreprotokoller til PCD for klinisk bruk) for robust kavitasjonsdeteksjon og til og med for tilbakevirkende tilbakemeldingskontroll av trykket11,14,30,31,32,33,34,35. PCD-protokollen som brukes i omfanget av denne studien er avledet direkte fra McDannold et al.12 og overvåker det harmoniske utslippet for tilstedeværelse av stabil kavitasjon og bredbåndsstøy for inertiell kavitasjonsdeteksjon.
Vi har utviklet et bildestyrt neuronavigation FUS-system for forbigående åpning av BBB for å øke legemiddeltilførselen til hjerneparenchyma. Systemet er basert på kommersielt tilgjengelige komponenter og kan enkelt tilpasses flere forskjellige bildemodaliteter, avhengig av tilgjengelige bildeteknikker i dyreanlegget. Siden vi trenger en arbeidsflyt med høy gjennomstrømning, har vi valgt å bruke røntgen og BLI til bildeveiledning og behandlingsplanlegging. Tumorceller transdusert med fotoprotein (f.eks. luciferase) er egnet for BLI-avbildning20. Etter administrering av fotoprotein substratet kan tumorceller overvåkes in vivo og tumorvekst og plassering kan bestemmes20,36. BLI er en rimelig bildebehandlingsmodalitet, det gjør det mulig å følge svulstveksten over tid, den har raske skannetider og det korrelerer godt med tumorvekst målt med MR36,37. Vi har valgt å erstatte vannbadet med en vannfylt kjegle festet til svingeren for å muliggjøre fleksibilitet til fritt å flytte plattformen som gnageren er montertpå 8,24. Designet er basert på en avtakbar plattform utstyrt med integrasjon av (I) smådyr stereotaktiske plattform (II) fiducial markører med både røntgen- og optisk bildekompatibilitet (III) hurtigavtakbar anestesimaske, og (IV) integrert temperaturregulert dyreoppvarmingssystem. Etter den første induksjonen av anestesi, er dyret montert i en presis posisjon på plattformen der den forblir under hele prosedyren. Følgelig passerer hele plattformen alle stasjoner i arbeidsflyten for hele intervensjonen, samtidig som den opprettholder en nøyaktig og reproduserbar posisjonering og vedvarende anestesi. Kontrollprogramvaren tillater automatisk deteksjon av fiducial markører og registrerer automatisk alle typer bilder og bildemodaliteter (dvs. mikro-CT, røntgen, BLI og fluorescensavbildning) i referanserammen til den stereotaktiske plattformen. Ved hjelp av en automatisk kalibreringsprosedyre er fokuslengden på ultralydtransduseren nettopp kjent innen, noe som muliggjør automatisk fusjon av intervensjonsplanlegging, akustisk levering og oppfølgingsavbildningsanalyse. Som vist i figur 1 og figur 2, gir dette oppsettet en høy grad av fleksibilitet til å designe dedikerte eksperimentelle arbeidsflyter og tillater sammenflettet håndtering av dyret på forskjellige stasjoner, noe som igjen letter eksperimenter med høy gjennomstrømning. Vi har brukt denne teknikken for vellykket legemiddellevering i mus xenografts av høyverdig glioma som diffus midline glioma.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL luer-lock syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309628</td>
			<td>Plastipak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>Terumo Agani</td>
			<td>8AN1938R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Terumo Agani</td>
			<td>8AN2316R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Transpore surgical tape</td>
			<td>Science applied to life</td>
			<td>7000032707</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary waveform generator</td>
			<td>Siglent</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated stereotact</td>
			<td>in-house built</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Stereotact with all elements were in-house built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker In-Vivo Xtreme</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Includes software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered NaCl solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG</td>
			<td>220/12257974/110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK limitd</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>0.324 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage enrichment: paper-pulp smart home</td>
			<td>Bio services</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon filter</td>
			<td>Bickford</td>
			<td>NC0111395</td>
			<td>Omnicon f/air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic spoon</td>
			<td>n.a</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, potassium salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VUmc pharmacy</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresenius NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>NaCl 0.9 %, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>Braun Surgical</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Histoacryl 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>324825/324826</td>
			<td>0.5 mL and 0.3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>TEVA Pharmachemie BV</td>
			<td>8711218013196</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>10 %, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2918-11416M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoflon catheter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>391349</td>
			<td>26 GA 0.6 x 19 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Keysight technologies</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>InfiniiVision DSOX024A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation Ltd</td>
			<td>210L</td>
			<td>Model 210L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preamplifier DC Coupler</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n..</td>
			<td>Serial number: DCPS94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sedazine</td>
			<td>AST Farma</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SonoVue microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>8 &#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>various syringes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Indivior UK limitd</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>0.3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>1 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>01-02</td>
			<td>Aquasonic 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic gel</td>
			<td>Bausch + Lomb</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput image-guided stereotactic neuronavigation and focused ultrasound system for blood-brain barrier opening in rodents

Blod-hjernebarrieren (BBB) har vært et stort hinder for behandling av ulike hjernesykdommer. Endotelceller, forbundet med tette veikryss, danner en fysiologisk barriere som hindrer store molekyler (>500 Da) i å komme inn i hjernevevet. Mikrobubble-mediert fokusert ultralyd (FUS) kan brukes til å indusere en forbigående lokal BBB-åpning, slik at større stoffer kan komme inn i hjernen parenchyma.
I tillegg til store kliniske enheter for klinisk oversettelse, krever preklinisk forskning for terapiresponsvurdering av legemiddelkandidater dedikerte små dyre ultralydoppsett for målrettet BBB-åpning. Fortrinnsvis tillater disse systemene arbeidsflyter med høy gjennomstrømning med både høy romlig presisjon og integrert kavitasjonsovervåking, samtidig som de er kostnadseffektive i både innledende investeringer og driftskostnader.
Her presenterer vi et bioluminescens- og røntgenstyrt stereotaktisk fus-system for små dyr som er basert på kommersielt tilgjengelige komponenter og oppfyller de nevnte kravene. Det er lagt særlig vekt på en høy grad av automatisering som letter utfordringene som typisk oppstår i prekliniske evalueringsstudier med høyt volum. Eksempler på disse utfordringene er behovet for standardisering for å sikre datareduserbarhet, redusere variasjon i intragruppen, redusere utvalgsstørrelsen og dermed overholde etiske krav og redusere unødvendig arbeidsbelastning. Det foreslåtte BBB-systemet er validert i omfanget av BBB-åpningen tilrettelagte legemiddelleveringsforsøk på pasientavledede xenograftmodeller av glioblastom multiforme og diffuse midline glioma.

Det beskrevne FUS-systemet (figur 1 og figur 2) og den tilhørende arbeidsflyten har blitt brukt i over 100 dyr og produsert reproduserbare data om både friske og tumorbærende mus. Basert på den registrerte kavitasjonen og spektraltettheten ved harmonikken i det største øyeblikket av mikrobubble bolusinjeksjonen, kan spektralkraften til hver frekvens beregnes ved hjelp av Fourier-analysen som forklart i trinn 4 i protokollen. Basert på den akustiske protok...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents at JoVE.com

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Blod-hjernebarrieren (BBB) kan midlertidig forstyrres med mikrobubble-mediert fokusert ultralyd (FUS). Her beskriver vi en trinnvis protokoll for høy gjennomstrømning BBB-åpning in vivo ved hjelp av et modulært FUS-system tilgjengelig for ikke-ultralydeksperter.

Et høygjennomstrømningsbildestyrt stereotaktisk nevronavigering og fokusert ultralydsystem for blod-hjernebarriereåpning hos gnagere

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Anvendelse av automatisert bildestyrt patchklemme for studiet av nevroner i hjernesnitt

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Vurdering av blod - hjerne barrieren permeabilitet av intravenøs infusjon av FITC-merket Albumin i en musemodell av nevrodegenerative sykdommer

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

I Vivo blod - hjerne barrieren permeabilitet analysen mus med Fluorescently merket Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Bedømme i Vivo blod - hjerne barrieren avbrudd i en rotte modell av iskemiske hjerneslag

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

En benchtop tilnærming til plasseringen spesifikke blod hjernebarriere åpning ved hjelp av fokusert ultralyd i en rotte modell

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Målrettet nevronal skade for ikke-invasiv frakobling av hjernekretser

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Fokusert ultralydindusert blod-hjernebarriereåpning for å målrette hjernestrukturer og evaluere kjemogenetisk nevromodulering

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Registrering av barrierefunksjonell integritet på bEnd.3 Vaskulære endotelceller via deteksjon av transendotelial elektrisk motstand

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Rekonstruksjon av blod-hjernebarrieren in vitro for å modellere og terapeutisk målrette nevrologisk sykdom

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...