Name: a high-throughput image-guided stereotactic neuronavigation and focused ultrasound system for blood-brain barrier opening in rodents
Uploaded: 2020-07-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents at JoVE.com

Este projeto foi financiado pelo KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrínsic Pontine Glioma and High-grade Glioma). Agradecemos a Ilya Skachkov e Charles Mougenot por sua contribuição no desenvolvimento do sistema.

Todos os experimentos in vivo foram aprovados pelo comitê de ética holandês (número de licenças AVD114002017841) e pelo Corpo de Bem-Estar Animal da Vrije Universiteit Amsterdam, nos Países Baixos. Os investigadores foram treinados no básico do sistema de FUS, a fim de minimizar o desconforto dos animais.
1. Sistema de ultrassom focado
NOTA: A configuração descrita é um sistema de disrupção BBB construído em casa com base em componentes disponíveis comer...

Neste estudo, desenvolvemos um sistema de FUS baseado em imagem econômico para interrupção transitória do BBB para o aumento da entrega de medicamentos no parênquim cerebral. O sistema foi construído em grande parte com componentes comercialmente disponíveis e em conjunto com raio-X e BLI. A modularidade do projeto proposto permite o uso de diversas modalidades de imagem para planejamento e avaliação em fluxos de trabalho de alto rendimento. O sistema pode ser combinado com modalidades de imagem 3D de alta resol...

A barreira hematoencefálica (BBB) é um grande obstáculo para a entrega de drogas no cérebro. A maioria das drogas terapêuticas desenvolvidas não atravessam o BBB devido aos seus parâmetros físico-químicos (por exemplo, lipoficidade, peso molecular, aceitadores de vínculos de hidrogênio e doadores) ou não são retidos devido à sua afinidade com transportadores efflux no cérebro1,2. O pequeno grupo de drogas que podem atravessar o BBB são tipicamente pequenas moléculas lipofílicas, que só são eficazes em um número limitado de doenças cerebrais1,2. Como consequência, para a maioria das doenças cerebrais, as opções de tratamento farmacológico são limitadas e novas estratégias de entrega de medicamentos são necessárias3,4.
O ultrassom terapêutico é uma técnica emergente que pode ser usada para diferentes aplicações neurológicas, como ruptura BBB (BBBD), neuromodulação e ablação4,5,6,7. Para conseguir uma abertura BBB com um emissor de ultrassom extracorpórea através do crânio, o ultrassom focado (FUS) é combinado com microbolhas. O MEC mediado por microconstrução resulta no aumento da biodisponibilidade de drogas no cérebro parenchyma5,8,9. Na presença de ondas sonoras, os microbolhas começam a oscilar iniciando a transcitose e a interrupção das junções apertadas entre as células endoteliais do BBB, permitindo o transporte paracelular de moléculas maiores10. Estudos anteriores confirmaram a correlação entre a intensidade da emissão acústica e o impacto biológico na abertura do BBB11,12,13,14. O FUS em combinação com microbolhas já tem sido utilizado em ensaios clínicos para o tratamento de glioblastoma usando temozolomide ou doxorubicina liposômica como agente quimioterápico, ou para terapia da doença de Alzheimer e esclerose lateral amiotrófica5,9,15,16.
Uma vez que a abertura do BBB mediado pelo ultrassom resulta em possibilidades totalmente novas para farmacoterapia, é necessária pesquisa pré-clínica para tradução clínica para avaliar a resposta terapêutica de candidatos a medicamentos selecionados. Isso normalmente requer um fluxo de trabalho de alto rendimento com precisão espacial elevada e, preferencialmente, uma detecção integrada de cavitação para monitoramento da abertura do BBB com uma alta reprodutibilidade. Se possível, esses sistemas precisam ser econômicos tanto no investimento inicial quanto nos custos de execução, para serem escaláveis de acordo com o tamanho do estudo. A maioria dos sistemas de FUS pré-clínicos são combinados com ressonância magnética para orientação de imagem e planejamento de tratamento15,17,18,19. Embora a ressonância magnética dê informações detalhadas sobre a anatomia e o volume do tumor, é uma técnica cara, que geralmente é realizada por operadores treinados/qualificados. Além disso, a ressonância magnética de alta resolução pode nem sempre estar disponível para pesquisadores em instalações pré-clínicas e requer longos tempos de varredura por animal, tornando-o menos adequado para estudos farmacológicos de alto rendimento. Destaca-se que, para pesquisas pré-clínicas no campo da neuro-oncologia, em especial modelos de tumores infiltrados, a possibilidade de visualizar e atingir o tumor é essencial para o sucesso do tratamento20. Atualmente, essa exigência só é cumprida por ressonância magnética ou por tumores transduzidos com fotoproteína, possibilitando visualização com bioluminescência de imagem (BLI) em combinação com a administração do substrato de fotoproteína.
Os sistemas de FUS guiados por ressonância magnética frequentemente usam um banho de água para garantir a propagação de ondas de ultrassom para aplicações transcranianas, em que a cabeça do animal está parcialmente submersa na água, os chamados sistemas ''bottom-up''15,17,18. Embora esses projetos funcionem geralmente bem em estudos em animais menores, eles são um compromisso entre os tempos de preparação animal, portabilidade e padrões higiênicos realisticamente mantidos durante o uso. Como alternativa à ressonância magnética, outros métodos de orientação para navegação estereotática abrangem o uso de um atlas anatômico de roedores21,22,23, ponteiro laser assistido ao avistamento visual24, dispositivo de varredura mecânica assistido por pinhole25, ou BLI26. A maioria desses desenhos são sistemas "de cima para baixo" em que o transdutor é colocado em cima da cabeça do animal, com o animal em uma posição natural. O fluxo de trabalho ''top-down'' consiste em um banho de água22,25,26 ou um cone cheio de água21,24. O benefício de usar um transdutor dentro de um cone fechado é a pegada mais compacta, menor tempo de configuração e possibilidades de descontaminação direta simplificando todo o fluxo de trabalho.
A interação do campo acústico com os microbolhas é dependente da pressão e varia de oscilações de baixa amplitude (chamada de cavitação estável) ao colapso transitório da bolha (referido como cavitação inercial)27,28. Há um consenso estabelecido de que o ultrassom-BBBD requer uma pressão acústica bem acima do limiar de cavitação estável para alcançar o sucesso do BBBD, mas abaixo do limiar de cavitação inercial, que geralmente está associado a danos vasculares/neuronais29. A forma mais comum de monitoramento e controle é a análise do (back-)sinal acústico disperso utilizando detecção passiva de cavitação (PCD), conforme sugerido por McDannold et al.12. O PCD baseia-se na análise dos espectros fourier de sinais de emissão de microbolhas, nos quais a força e o aparecimento de marcas de cavitação estáveis (harmônicas, subharmônicas e ultraharmônicas) e marcadores de cavitação inercial (resposta de banda larga) podem ser medidos em tempo real.
Uma análise de PCD "de um tamanho" para controle preciso de pressão é complicada devido à polidispersidade da formulação de microbolhas (a amplitude de oscilação depende fortemente do diâmetro da bolha), as diferenças nas propriedades da casca de bolha entre as marcas e a oscilação acústica, que depende fortemente da frequência e da pressão30,31,32. Como consequência, muitos protocolos diferentes de detecção de PCD foram sugeridos, que foram adaptados a combinações particulares de todos esses parâmetros e têm sido usados em vários cenários de aplicação (que vão desde experimentações in vitro sobre pequenos protocolos animais até PCD para uso clínico robusto) para detecção robusta de cavitação e até mesmo para controle retroativo de feedback da pressão11,14,30,31,32,33,34,35. O protocolo PCD empregado no escopo deste estudo é derivado diretamente de McDannold et al.12 e monitora a emissão harmônica para a presença de cavitação estável e ruído de banda larga para detecção inercial de cavitação.
Desenvolvemos um sistema de ME FUS de neuronavigção guiado por imagem para abertura transitória do BBB para aumentar a entrega de drogas no parênquim cerebral. O sistema é baseado em componentes disponíveis comercialmente e pode ser facilmente adaptado a diversas modalidades de imagem diferentes, dependendo das técnicas de imagem disponíveis na instalação animal. Como exigimos um fluxo de trabalho de alto rendimento, optamos por usar raio-X e BLI para orientação de imagem e planejamento de tratamento. As células tumorais transduzidas com uma fotoproteína (por exemplo, luciferase) são adequadas para a imagemBLI 20. Após a administração do substrato de fotoproteína, as células tumorais podem ser monitoradas in vivo e o crescimento e localização do tumor podem ser determinados20,36. A BLI é uma modalidade de imagem de baixo custo, permite acompanhar o crescimento do tumor ao longo do tempo, tem tempos de varredura rápidos e se correlaciona bem com o crescimento do tumor medido com ressonância magnética36,37. Optamos por substituir o banho de água por um cone cheio de água ligado ao transdutor para permitir flexibilidade para mover livremente a plataforma em que o roedor é montado8,24. O design é baseado em uma plataforma destacável equipada com integração de (I) marcadores fiduciais de plataforma estereustática (II) de pequena animal com máscara de compatibilidade de imagem x e óptica (III) de alta destastésia rápida e (IV) sistema de aquecimento animal regulado pela temperatura integrada. Após a indução inicial da anestesia, o animal é montado em uma posição precisa na plataforma onde permanece durante todo o procedimento. Consequentemente, toda a plataforma passa por todas as estações do fluxo de trabalho de toda a intervenção, mantendo um posicionamento preciso e reprodutível e anestesia sustentada. O software de controle permite a detecção automática dos marcadores fiduciais e registra automaticamente todos os tipos de imagens e modalidades de imagem (ou seja, micro-CT, raio-X, BLI e imagem de fluorescência) no quadro de referência da plataforma estereotática. Com a ajuda de um procedimento de calibração automática, a distância focal do transdutor de ultrassom é precisamente conhecida dentro, o que permite a fusão automática do planejamento intervencionista, entrega acústica e análise de imagem de acompanhamento. Como mostrado na Figura 1 e Figura 2,esta configuração fornece um alto grau de flexibilidade para projetar fluxos de trabalho experimentais dedicados e permite o manuseio intercalado do animal em diferentes estações, o que, por sua vez, facilita experimentos de alto rendimento. Usamos esta técnica para a entrega bem sucedida de drogas em xenoenxertos de rato de glioma de alto grau, como glioma midline difuso.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL luer-lock syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309628</td>
			<td>Plastipak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>Terumo Agani</td>
			<td>8AN1938R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Terumo Agani</td>
			<td>8AN2316R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Transpore surgical tape</td>
			<td>Science applied to life</td>
			<td>7000032707</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary waveform generator</td>
			<td>Siglent</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated stereotact</td>
			<td>in-house built</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Stereotact with all elements were in-house built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker In-Vivo Xtreme</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Includes software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered NaCl solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG</td>
			<td>220/12257974/110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK limitd</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>0.324 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage enrichment: paper-pulp smart home</td>
			<td>Bio services</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon filter</td>
			<td>Bickford</td>
			<td>NC0111395</td>
			<td>Omnicon f/air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic spoon</td>
			<td>n.a</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, potassium salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VUmc pharmacy</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresenius NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>NaCl 0.9 %, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>Braun Surgical</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Histoacryl 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>324825/324826</td>
			<td>0.5 mL and 0.3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>TEVA Pharmachemie BV</td>
			<td>8711218013196</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>10 %, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2918-11416M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoflon catheter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>391349</td>
			<td>26 GA 0.6 x 19 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Keysight technologies</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>InfiniiVision DSOX024A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation Ltd</td>
			<td>210L</td>
			<td>Model 210L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preamplifier DC Coupler</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n..</td>
			<td>Serial number: DCPS94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sedazine</td>
			<td>AST Farma</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SonoVue microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>8 &#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>various syringes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Indivior UK limitd</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>0.3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>1 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>01-02</td>
			<td>Aquasonic 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic gel</td>
			<td>Bausch + Lomb</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput image-guided stereotactic neuronavigation and focused ultrasound system for blood-brain barrier opening in rodents

A barreira hemencefálica (BBB) tem sido um grande obstáculo para o tratamento de várias doenças cerebrais. As células endoteliais, conectadas por junções apertadas, formam uma barreira fisiológica impedindo que grandes moléculas (>500 Da) entrem no tecido cerebral. O ultrassom focado (FUS) mediado por microbolhas pode ser usado para induzir uma abertura de BBB local transitória, permitindo que drogas maiores entrem no parenchyma cerebral.
Além de dispositivos clínicos em larga escala para tradução clínica, a pesquisa pré-clínica para avaliação de resposta terapêutica de candidatos a medicamentos requer configurações dedicadas de ultrassom animal para abertura de BBB direcionada. De preferência, esses sistemas permitem fluxos de trabalho de alto rendimento com alta precisão espacial, bem como monitoramento integrado de cavitação, enquanto ainda são econômicos tanto no investimento inicial quanto nos custos de execução.
Aqui, apresentamos um sistema de FUS ANIMAL de pequeno animal bioluminescência e raios-X guiado que se baseia em componentes disponíveis comercialmente e preenche os requisitos acima mencionados. Uma ênfase particular foi colocada em um alto grau de automação facilitando os desafios tipicamente encontrados em estudos de avaliação de medicamentos pré-clínicos de alto volume. Exemplos desses desafios são a necessidade de padronização para garantir a reprodutibilidade de dados, reduzir a variabilidade intra-grupo, reduzir o tamanho da amostra e, assim, cumprir com os requisitos éticos e diminuir a carga de trabalho desnecessária. O sistema BBB proposto foi validado no âmbito da abertura do BBB facilitou testes de entrega de medicamentos em modelos de xenoenxerto derivados do paciente de glioblastoma multiforme e glioma médio difuso.

O sistema fus descrito (Figura 1 e Figura 2) e o fluxo de trabalho associado têm sido usados em mais de 100 animais e produziram dados reprodutíveis em camundongos saudáveis e tumores. Com base na cavitação registrada e na densidade espectral nos harmônicos no momento de pico da injeção de bolus de microbolhas, o poder espectral de cada frequência pode ser calculado utilizando-se a análise de Fourier, conforme explicado na etapa 4 do Protocolo. Com bas...

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A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

A barreira hemencefálica (BBB) pode ser temporariamente interrompida com ultrassom focado (ME) mediado por microbolhas. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para abertura BBB de alto rendimento in vivo usando um sistema de FUS modular acessível para especialistas em não-ultrassom.

Um sistema de neuronação estereática guiada por imagem de alta produtividade e sistema de ultrassom focado para abertura de barreira hemencefálica em roedores

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Neurociência

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Avaliação da permeabilidade da barreira hemato - encefálica por infusão intravenosa de albumina FITC-etiquetadas em um modelo do rato da doença neurodegenerativa

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Uma abordagem benchtop para a abertura da barreira cerebral de sangue específica do local usando ultrassom focado em um modelo de rato

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Lesão Neuronal Direcionada para a Desconexão Não Invasiva do Circuito Cerebral

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Abertura da Barreira Hematoencefálica Induzida por Ultrassom Focalizado para Atingir Estruturas Cerebrais e Avaliar a Neuromodulação Quimiogenética

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

Applications of TEER Detection to Assess Cell Barrier Integrity (Video) | JoVE

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...