Name: imaging and analysis of oil red o-stained whole aorta lesions in an aneurysm hyperlipidemia mouse model
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00
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Ce travail a été soutenu, en partie, par une microsubvention du Consortium conjoint de biologie fournie dans le cadre de la subvention des NIH P30AR070253 (P.-Y.C.) et HL135582 (M.S.). Nous sommes reconnaissants à R. Webber et L. Coon d’avoir maintenu les souris utilisées dans cette étude.

Les souris mT/mG (n° de stock 007676) et Apoe-/- (n° de stock 002052) ont été achetées au Jackson Laboratory. Les souris Myh11-CreERT2 étaient un cadeau de Stefan Offermanns (disponible auprès du Jackson Laboratory sous le numéro de stock 019079). Les souris Tgfbr2fl/fl ont été obtenues auprès de Harold L. Moses (Université Vanderbilt). Toutes les procédures animales ont été effectuées à l’aide de protocoles approuvés par le comité institutionnel de soins et ...

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	<li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-241 (2000).</li><li>Emini Veseli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li><li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells.">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71, 343-353 (1992).</li><li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E.">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258, 468-471 (1992).</li><li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery.">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).</li><li>Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE-deficient+mice+develop+lesions+of+all+phases+of+atherosclerosis+throughout+the+arterial+tree.">ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree.</a> Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).</li><li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+cell+reprogramming+in+aortic+aneurysms.">Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms.</a> Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).</li><li>Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+Red+O+and+Hematoxylin+and+Eosin+Staining+for+Quantification+of+Atherosclerosis+Burden+in+Mouse+Aorta+and+Aortic+Root.">Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).</li><li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TGF-beta+signalling+drives+vascular+inflammation+and+atherosclerosis.">Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).</li><li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease.">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).</li><li>Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compromised+mechanical+homeostasis+in+arterial+aging+and+associated+cardiovascular+consequences.">Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences.</a> Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).</li></ol>

Les souris déficientes en apolipoprotéines E (Apoe) et en récepteurs de lipoprotéines de basse densité (Ldlr) sont utiles pour étudier le développement et le traitement de l’athérosclérose. Les chercheurs peuvent évaluer l’impact de la génétique et des manipulations thérapeutiques sur l’initiation, la progression et la régression des maladies liées à l’athérosclérose en utilisant la coloration à l’huile rouge O de l’ensemble de l’aorte9. La colora...

La maladie coronarienne, l’une des principales causes de mortalité aux États-Unis, est généralement causée par l’athérosclérose, un processus qui conduit à l’accumulation de plaque à l’intérieur des parois artérielles1. Les souris déficientes en Apoe et en Ldlr sujettes à l’hyperlipidémie sont au cœur des investigations sur l’athérosclérose et ses complications et le développement de thérapies2,3,4,5. La quantification des lésions athérosclérotiques d’une aorte en face est une analyse de critère importante pour évaluer l’impact de la manipulation génétique dans différents types de cellules. Il aide également à étudier de nouvelles thérapies conçues pour affecter l’initiation, la progression et la régression de la maladie athéroscléreuse. Des lésions athérosclérotiques peuvent se former n’importe où dans l’aorte et ses branches (c.-à-d. les artères brachiocéphales, carotides et sous-clavières dans la poitrine, ainsi que les artères rénales, iliaques et fémorales communes sous le diaphragme)6. Une évaluation complète du fardeau de l’athérosclérose et un traitement approprié nécessitent une évaluation du fardeau de la maladie dans différents endroits, un défi qui est souvent négligé.
Ce protocole décrit comment effectuer une analyse complète des lésions athérosclérotiques, en commençant par une aorte entière non ouverte et en procédant à la préparation du visage, chez une seule souris. La coloration à l’huile d’aorte rouge rouge non ouverte permet une évaluation qualitative rapide des plaques chargées de lipides dans l’ensemble de l’aorte et de ses branches, tandis que la préparation du visage fournit une évaluation quantitative de la distribution des lésions athérosclérotiques dans l’aorte de la souris.
La technique utilise des souris âgées de 8 semaines avec une délétion TGFβR2 spécifique aux cellules musculaires lisses sur le fond hyperlipidémique Apoe-/- (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; ci-après dénommées souris TGFβR2iSMC-Apoe) et témoins Apoe-/- de litière (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; ci-après dénommées souris Apoe-/- ). Les animaux sont gardés pendant 16 semaines dans un régime riche en cholestérol et en graisses (HCHFD) comme matériel d’étude7. À la fin de l’étude, les aortes entières non ouvertes sont colorées et imagées (y compris toutes les branches principales) avec de l’O rouge huileux pour une évaluation qualitative des plaques chargées de lipides. Les aortes sont ouvertes par préparation du visage et toutes les lésions athérosclérotiques sont imagées et quantifiées. Ce protocole peut être utilisé pour étudier le développement de lésions athérosclérotiques dans des modèles de souris hyperlipidémiques Apoe-/- ou Ldlr-/- et étendu aux applications générales de biologie vasculaire liées à l’aorte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>DENVILLE</td>
			<td>C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RC2546.70-5</td>
			<td>To clean the dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black dissection wax</td>
			<td>CR Scientific</td>
			<td>C3541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>Solvent for Tamoxifen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69506</td>
			<td>To isolate DNA from mouse ear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td>To cut the mouse skin and open the ribcage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High cholesterol high fat diet</td>
			<td>Research Diets</td>
			<td>D12108</td>
			<td>To induce atherosclerosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Image J</td>
			<td>Aortic lesion quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9079-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td>To clean the glass microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5602</td>
			<td>To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP Controller</td>
			<td>For aorta imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-25G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NonWoven Sponge</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>94442000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O-0625</td>
			<td>To stain the atherosclerosis lesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28143-312</td>
			<td>To filter working Oil Red O solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15021-15</td>
			<td>To dissect and clean the aorta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td>For aorta dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>For aorta imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>To induce Cre-loxP recombination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Style 4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0302-4-PO</td>
			<td>To cut the mouse skin and open the ribcage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Style 5</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0302-5-PO</td>
			<td>To dissect and clean the aorta</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and analysis of oil red o-stained whole aorta lesions in an aneurysm hyperlipidemia mouse model

Les souris hyperlipidémiques déficientes en apolipoprotéines E (Apoe) ou en récepteurs de lipoprotéines de basse densité (Ldlr) sont les deux modèles les plus couramment utilisés pour la recherche sur l’athérosclérose. Ils sont utilisés pour étudier l’impact de divers facteurs génétiques et de différents types de cellules sur la formation de lésions athérosclérotiques et pour tester le développement de nouvelles thérapies. L’isolement, l’excision de l’aorte entière et la quantification des lésions athérosclérotiques colorées en O rouge huile sont des méthodes morphométriques de base utilisées pour évaluer la charge athéroscléreuse. L’objectif de ce protocole est de décrire une méthode chirurgicale optimisée, étape par étape, pour disséquer, perfuser-fixer, isoler, colorier, imager et analyser les lésions athérosclérotiques dans les aortes de souris avec de l’huile rouge O. Parce que les lésions athérosclérotiques peuvent se former n’importe où dans tout l’arbre aortique, toute cette méthode de coloration à l’huile d’aorte Red O a l’avantage d’évaluer les plaques chargées de lipides dans toute l’aorte et toutes les branches d’une seule souris. En plus de la coloration Oil Red O, des aortes entières isolées fraîches peuvent être utilisées pour une variété d’expériences in vitro et in vivo et d’isolements cellulaires.

Dans ce protocole, les lésions athérosclérotiques chez des souris TGFβR2iSMC-Apoe ont été analysées après 4 mois de régime HCHF7. En plus de l’athérosclérose étendue, ces souris ont développé des anévrismes de l’aorte thoracique et abdominale, comme indiqué précédemment. Par rapport aux souris Apoe-/-, les parois aortiques des souris TGFβR2iSMC-Apoe présentaient une athérosclérose sévère, ce qui rendait difficile la dissection des lésions (<strong...

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Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour analyser la charge athéroscléreuse chez la souris. Les chercheurs peuvent utiliser ce protocole pour comparer l’abondance, l’emplacement et la taille des lésions athérosclérotiques chez différents animaux.

Imagerie et analyse de lésions de l’aorte entière o-colorée à l’huile dans un modèle murin d’hyperlipidémie d’anévrisme

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for ...

La quantification des lésions athérosclérotiques chez les souris apoE et d’autres types de souris hyperlipidémiques est essentielle à l’évaluation de divers facteurs génétiques et de nouvelles thérapies. Notre protocole fournit des instructions étape par étape pour l’analyse de la charge athéroscléreuse de manière qualitative et quantitative chez une seule souris. 16 semaines après avoir induit l’athérosclérose, avant de perfuser le cœur, chargez une seringue de 10 millilitres avec 10 millilitres de DPBS et fixez une aiguille de calibre 25.Soulevez la peau abdominale de la souris expérimentale avec une pince à épiler et utilisez des ciseaux fins pour couper la peau de la base de l’abdomen au sommet du cou. Ouvrez la paroi abdominale sous la cage thoracique et utilisez la pince à épiler pour soulever le sternum afin d’accéder au diaphragme. Coupez le diaphragme et coupez la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique.Ensuite, faites une petite incision dans l’oreillette droite du cœur et injectez lentement tout le volume de DPBS dans la ponction ventriculaire gauche apicale. Le foie et les reins deviendront brun clair. Lorsque toute la solution saline a été perfusée, utilisez une éponge non tissée pour nettoyer la cavité thoracique de tout sang et liquide étrangers.Une fois la cavité thoracique essuyée, retirez les organes non expérimentaux et coupez la clavicule avec une pince à épiler et des ciseaux fins. Placez la souris sous un stéréomicroscope et utilisez la pince à épiler et les ciseaux à ressort pour disséquer l’aorte. Lorsque l’aorte a été isolée, recouvrir le tissu d’une éponge non tissée imbibée de solution saline et disséquer les branches aortiques, y compris les artères brachiocéphale, carotide, sous-clavière, rénale, iliaque commune et fémorale.Lorsque toutes les artères qui se ramifient à partir de l’aorte ont été isolées, utilisez une pince à épiler et des ciseaux à ressort pour disséquer et enlever soigneusement l’adipeux adventice et le tissu conjonctif autour des branches de l’aorte et de l’aorte. Un isolement réussi de l’aorte et des branches aortiques nécessite de la pratique et de la patience. Pour fixer l’arbre vasculaire, chargez d’abord une seringue de 10 millilitres avec 4% de formaldéhyde dans 1X DPBS et fixez une aiguille de calibre 25.N’oubliez pas de toujours préparer 4% de formaldéhyde à l’intérieur d’une hotte. Insérez l’aiguille dans la ponction ventriculaire gauche apicale et injectez lentement tout le volume de fixateur. Nettoyez la cavité thoracique de tout liquide étranger avec une éponge non tissée comme démontré et utilisez une pince à épiler et des ciseaux à ressort à micro-dissection pour séparer le cœur de l’aorte.Lorsque les tissus ont été séparés, isolez et excisez l’aorte et son vaisseau principal d’un millimètre au-dessus de l’artère carotide jusqu’à l’extrémité de l’artère fémorale et placez le vaisseau dans un récipient de DPBS. Pour la coloration à l’huile rouge O de l’aorte entière non ouverte, utilisez des broches Minutien pour fixer le récipient sur une boîte de Petri en cire et rincez le récipient avec du DPBS frais. Versez 25 millilitres de solution fraîche d’huile rouge O filtrée par les pores de 0,45 micromètre dans le plat pour une coloration de 60 minutes à température ambiante.Immergez le tissu avec 60% d’isopropanol pour un lavage de 20 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, rincez le récipient trois fois avec de l’eau distillée fraîche pendant cinq minutes par lavage et placez le plat sous le microscope à dissection. Utilisez une pince à épiler et des ciseaux à ressort pour nettoyer doucement tout le tissu adipeux périvasculaire autour de l’aorte afin d’éviter toute coloration de faux fond Huile Rouge O et transférer le vaisseau sur une lame de microscope en verre propre.Oil Red O étiquetera la plaque riche en lipides en rouge, laissant les zones ne contenant pas de plaque de couleur pâle. Ensuite, acquérez des micrographies numériques haute résolution avec un microscope optique équipé d’une caméra et enregistrez les images de préférence au format de fichier image étiqueté. Pour le montage en face de l’échantillon de tissu aortique, transférez le récipient dans une boîte de Petri en cire et recouvrez le tissu de DPBS frais.Couper les artères carotides et sous-clavières de l’arc aortique et les artères iliaques de l’aorte abdominale un à deux millimètres après les bifurcations. Couper les artères rénales. Ensuite, utilisez des ciseaux à ressort à micro disséquence pour ouvrir longitudinalement la préparation de l’aorte le long de la courbure interne et des artères iliaques et couper les trois branches de l’arc aortique le long de la plus grande courbure jusqu’au niveau de base de la courbure interne.Ensuite, utilisez des broches Minutien pour fixer l’aorte à plat contre le plat sans étirer le côté lumineux vers le haut et couvrez le tissu avec du DPBS frais. Par rapport aux souris knockout de l’apolipoprotéine E, les parois aortiques des souris Apolipoprotéine E à cellules musculaires lisses TGF-beta-R2 présentent une athérosclérose sévère, ce qui rend difficile la dissection des lésions. De plus, les anévrismes sont particulièrement étendus sous l’aorte suprarénale, rappelant fortement les anévrismes de l’aorte humaine avancée.Ici, une image représentative d’une aorte non ouverte d’une souris TGF-bêta-R2 knockout apolipoprotéine E riche en cholestérol et riche en graisses colorée avec de l’huile Rouge O est montrée. La souris a développé à la fois un anévrisme ascendant et un anévrisme de l’aorte abdominale avec formation accélérée de lésions athérosclérotiques observées dans les artères brachiocéphale, carotide, sous-clavière, iliaque, fémorale et rénale. Cette coloration à l’huile rouge O du tissu de souris TGF-beta-R2 knockout apolipoprotein E révèle une hypertrophie anévrismale sévère et un allongement marqué de toute l’aorte par rapport au groupe de souris knockout apolipoprotéine E.Il est important de pouvoir distinguer les plaques colorées à l’huile Rouge O des faux arrière-plans des tissus adipeux périvasculaires colorés en Huile Rouge O. Les plaques d’athérosclérose sont des phénomènes tridimensionnels. Après la quantification des lésions aortiques 2D du visage, nous recommandons l’analyse de l’ensemble de plaques telles que les racines aortiques et l’artère brachiocéphale.Ce protocole peut également être utilisé pour décider si un facteur génétique, une intervention ou un traitement particulier affecte la progression ou la régression de l’athérosclérose dans ces modèles.

Research

JoVE Journal

Medicine

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