Name: imaging and analysis of oil red o-stained whole aorta lesions in an aneurysm hyperlipidemia mouse model
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato, in parte, da un Joint Biology Consortium Microgrant fornito nell'ambito della sovvenzione NIH P30AR070253 (P.-Y.C.) e HL135582 (MS). Siamo grati a R. Webber e L. Coon per aver mantenuto i topi utilizzati in questo studio.

I topi mT / mG (stock n. 007676) e Apoe-/- (stock n. 002052) sono stati acquistati dal Jackson Laboratory. I topi Myh11-CreERT2 sono stati un regalo di Stefan Offermanns (disponibile presso il Jackson Laboratory come stock n. 019079). I topi Tgfbr2fl/fl sono stati ottenuti da Harold L. Moses (Vanderbilt University). Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite utilizzando protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di...

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	<li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-241 (2000).</li><li>Emini Veseli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atherosclerosis.">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li><li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells.">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71, 343-353 (1992).</li><li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E.">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258, 468-471 (1992).</li><li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery.">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).</li><li>Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE-deficient+mice+develop+lesions+of+all+phases+of+atherosclerosis+throughout+the+arterial+tree.">ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree.</a> Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).</li><li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+cell+reprogramming+in+aortic+aneurysms.">Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms.</a> Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).</li><li>Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+Red+O+and+Hematoxylin+and+Eosin+Staining+for+Quantification+of+Atherosclerosis+Burden+in+Mouse+Aorta+and+Aortic+Root.">Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).</li><li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TGF-beta+signalling+drives+vascular+inflammation+and+atherosclerosis.">Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).</li><li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease.">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).</li><li>Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compromised+mechanical+homeostasis+in+arterial+aging+and+associated+cardiovascular+consequences.">Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences.</a> Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).</li></ol>

I topi carenti di apolipoproteina E (Apoe) e recettore delle lipoproteine a bassa densità (Ldlr) sono utili per studiare lo sviluppo e il trattamento dell'aterosclerosi. I ricercatori possono valutare l'impatto della genetica e delle manipolazioni terapeutiche sull'inizio, la progressione e la regressione delle malattie correlate all'aterosclerosi utilizzando la colorazione Oil Red O dell'intera aorta9. La colorazione Red O dell'olio di aorta e la quantificazione della lesione s...

La malattia coronarica, una delle principali cause di mortalità negli Stati Uniti, è solitamente causata dall'aterosclerosi, un processo che porta all'accumulo di placca all'interno delle pareti arteriose1. I topi con deficit di Apoe e Ldlr soggetti a iperlipidemia sono fondamentali per le indagini sull'aterosclerosi e le sue complicanze e lo sviluppo di terapie2,3,4,5. La quantificazione delle lesioni aterosclerotiche da un'aorta en face è un'importante analisi finale per valutare l'impatto della manipolazione genetica in diversi tipi di cellule. Aiuta anche a studiare nuove terapie progettate per influenzare l'inizio, la progressione e la regressione della malattia aterosclerotica. Le lesioni aterosclerotiche possono formarsi ovunque nell'aorta e nei suoi rami (cioè arterie brachiocefale, carotidi e succlavia nel torace, nonché arterie renali, iliache e femorali comuni sotto il diaframma)6. Una valutazione completa del carico di aterosclerosi e una terapia appropriata richiedono una valutazione del carico di malattia in diverse località, una sfida che viene spesso trascurata.
Questo protocollo descrive come eseguire un'analisi completa delle lesioni aterosclerotiche, iniziando con un'aorta intera non aperta e procedendo alla preparazione del viso, in un singolo topo. La colorazione Red O dell'olio di aorta intera non aperta consente una valutazione rapida e qualitativa delle placche cariche di lipidi nell'intera aorta e nei suoi rami, mentre la preparazione del viso fornisce una valutazione quantitativa della distribuzione della lesione aterosclerotica nell'aorta del topo.
La tecnica utilizza topi di 8 settimane con una delezione TGFβR2 specifica per le cellule muscolari lisce sullo sfondo iperlipidemico Apoe-/- (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; di seguito denominati topi TGFβR2iSMC-Apoe) e controlli Apoe-/- littermate (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; di seguito denominati Apoe-/- topi). Gli animali sono tenuti per 16 settimane con una dieta ricca di colesterolo alto contenuto di grassi (HCHFD) come materiali di studio7. Al termine dello studio, le aorte intere non aperte vengono macchiate e fotografate (compresi tutti i rami principali) con Oil Red O per la valutazione qualitativa delle placche cariche di lipidi. Le aorte vengono aperte attraverso la preparazione del viso e tutte le lesioni aterosclerotiche vengono visualizzate e quantificate. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare lo sviluppo della lesione aterosclerotica in modelli di topi iperlipidemia Apoe-/- o Ldlr-/- ed esteso ad applicazioni di biologia vascolare generale correlate all'aorta.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>DENVILLE</td>
			<td>C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18814-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RC2546.70-5</td>
			<td>To clean the dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black dissection wax</td>
			<td>CR Scientific</td>
			<td>C3541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>Solvent for Tamoxifen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69506</td>
			<td>To isolate DNA from mouse ear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td>To cut the mouse skin and open the ribcage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High cholesterol high fat diet</td>
			<td>Research Diets</td>
			<td>D12108</td>
			<td>To induce atherosclerosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Image J</td>
			<td>Aortic lesion quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9079-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td>To clean the glass microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5602</td>
			<td>To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP Controller</td>
			<td>For aorta imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-25G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NonWoven Sponge</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>94442000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O-0625</td>
			<td>To stain the atherosclerosis lesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28143-312</td>
			<td>To filter working Oil Red O solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15021-15</td>
			<td>To dissect and clean the aorta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Statical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td>For aorta dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>For aorta imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>To induce Cre-loxP recombination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Style 4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0302-4-PO</td>
			<td>To cut the mouse skin and open the ribcage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer Style 5</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0302-5-PO</td>
			<td>To dissect and clean the aorta</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and analysis of oil red o-stained whole aorta lesions in an aneurysm hyperlipidemia mouse model

I topi iperlipidemici carenti di apolipoproteina E (Apoe) o recettore delle lipoproteine a bassa densità (Ldlr) sono i due modelli più comunemente usati per la ricerca sull'aterosclerosi. Sono utilizzati per studiare l'impatto di vari fattori genetici e diversi tipi di cellule sulla formazione di lesioni aterosclerotiche e per testare lo sviluppo di nuove terapie. L'isolamento, l'escissione dell'intera aorta e la quantificazione delle lesioni aterosclerotiche colorate di Oil Red O sono metodi morfometrici di base utilizzati per valutare il carico aterosclerotico. L'obiettivo di questo protocollo è descrivere un metodo chirurgico ottimizzato e passo-passo per sezionare, perfuse-fix, isolare, macchiare, immaginare e analizzare le lesioni aterosclerotiche nelle aorte di topo con Oil Red O. Poiché le lesioni aterosclerotiche possono formarsi ovunque nell'intero albero aortico, questo intero metodo di colorazione Red O dell'olio di aorta ha il vantaggio di valutare le placche cariche di lipidi nell'intera aorta e in tutti i rami in un singolo topo. Oltre alla colorazione Oil Red O, le aorte intere isolate fresche possono essere utilizzate per una varietà di esperimenti in vitro e in vivo e isolamenti cellulari.

In questo protocollo, le lesioni aterosclerotiche nei topi TGFβR2iSMC-Apoe sono state analizzate dopo 4 mesi con una dieta HCHF7. Oltre all'aterosclerosi estesa, questi topi hanno sviluppato aneurismi dell'aorta toracica e addominale, come precedentemente riportato. Rispetto ai topi Apoe-/-, le pareti aortiche dei topi TGFβR2iSMC-Apoe hanno mostrato una grave aterosclerosi, rendendo difficile sezionare le lesioni (Figura 2C, D, E</stron...

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Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Questo protocollo fornisce una procedura passo-passo per analizzare il carico aterosclerotico nei topi. I ricercatori possono utilizzare questo protocollo per confrontare l'abbondanza, la posizione e le dimensioni delle lesioni aterosclerotiche in diversi animali.

Imaging e analisi delle lesioni dell'aorta intera O-macchiata di olio rosso in un modello murino di iperlipidemia da aneurisma

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for ...

La quantificazione delle lesioni aterosclerotiche nelle apoE e in altri tipi di topi iperlipidemici è fondamentale per la valutazione di vari fattori genetici e nuove terapie. Il nostro protocollo fornisce istruzioni passo-passo per l'analisi del carico aterosclerotico in modo qualitativo e quantitativo in un singolo topo. 16 settimane dopo aver indotto l'aterosclerosi, prima di perfondere il cuore, caricare una siringa da 10 millilitri con 10 millilitri di DPBS e attaccare un ago da 25 gauge.Sollevare la pelle addominale del topo sperimentale con una pinzetta e utilizzare forbici sottili per tagliare la pelle dalla base dell'addome alla parte superiore del collo. Aprire la parete addominale sotto la gabbia toracica e utilizzare le pinzette per sollevare lo sterno per accedere al diaframma. Tagliare il diaframma e tagliare via la cassa toracica per esporre la cavità toracica.Quindi, fare una piccola incisione nell'atrio destro del cuore e iniettare lentamente l'intero volume di DPBS nella puntura ventricolare sinistra apicale. Il fegato e il rene diventeranno di colore marrone chiaro. Quando tutta la soluzione salina è stata perfusa, utilizzare una spugna non tessuta per pulire la cavità toracica da sangue e liquidi estranei.Dopo che la cavità toracica è stata pulita, rimuovere gli organi non sperimentali e tagliare la clavicola con una pinzetta e forbici fini. Posizionare il mouse sotto uno stereomicroscopio e utilizzare le pinzette e le forbici a molla per sezionare l'aorta. Quando l'aorta è stata isolata, coprire il tessuto con una spugna non tessuta imbevuta di soluzione salina e sezionare i rami aortici tra cui le arterie brachiocefale, carotidi, succlavia, renali, iliache comuni e femorali.Quando tutte le arterie che si ramificano dall'aorta sono state isolate, utilizzare pinzette e forbici a molla per sezionare e rimuovere con cura il tessuto adiposo e connettivo avventiziale intorno ai rami dell'aorta e dell'aorta. Un isolamento riuscito dell'aorta e dei rami aortici richiede pratica e pazienza. Per fissare l'albero vascolare, caricare prima una siringa da 10 millilitri con il 4% di formaldeide in 1X DPBS e attaccare un ago da 25 gauge.Ricordati di preparare sempre il 4% di formaldeide all'interno di una cappa aspirante. Inserire l'ago nella puntura ventricolare sinistra apicale e iniettare lentamente l'intero volume di fissativo. Pulire la cavità toracica di eventuali fluidi estranei con una spugna non tessuta come dimostrato e utilizzare pinzette e forbici a molla di microsestrazione per separare il cuore dall'aorta.Quando i tessuti sono stati separati, isolare e asportare l'aorta e il suo vaso principale da un millimetro sopra l'arteria carotide fino alla fine dell'arteria femorale e posizionare il vaso in un contenitore di DPBS. Per la colorazione Oil Red O dell'aorta intera non aperta, utilizzare i perni Minutien per fissare il recipiente su una capsula di Petri di cera e risciacquare il recipiente con DPBS fresco. Versare 25 millilitri di soluzione fresca di Oil Red O filtrata con pori da 0,45 micrometri nel piatto per una macchia di 60 minuti a temperatura ambiente.Immergere il tessuto con il 60% di isopropanolo per un lavaggio di 20 minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, sciacquare il recipiente tre volte con acqua distillata fresca per cinque minuti per lavaggio e posizionare il piatto sotto il microscopio di dissezione. Utilizzare pinzette e forbici a molla per pulire delicatamente tutto il tessuto adiposo perivascolare intorno all'aorta per evitare qualsiasi macchia di olio rosso O a falso fondo e trasferire la nave su un vetrino pulito per microscopio.Oil Red O etichetterà la placca ricca di lipidi in rosso, lasciando le aree non contenenti placca di colore pallido. Quindi acquisire micrografie digitali ad alta risoluzione con un microscopio ottico dotato di una fotocamera e salvare le immagini preferibilmente in formato di file immagine taggato. Per il montaggio frontale del campione di tessuto aortico, trasferire il recipiente in una capsula di Petri di cera e coprire il tessuto con DPBS fresco.Tagliare le arterie carotidi e succlavia dell'arco aortico e le arterie iliache nell'aorta addominale da uno a due millimetri dopo le biforcazioni. Tagliare le arterie renali. Quindi, utilizzare le forbici a molla di microsestrazione per aprire longitudinalmente la preparazione dell'aorta lungo la curvatura interna e le arterie iliache e tagliare i tre rami dell'arco aortico lungo la curvatura maggiore fino al livello di base della curvatura interna.Quindi utilizzare i perni Minutien per fissare l'aorta piatta contro il piatto senza allungarsi con il lato del lume rivolto verso l'alto e coprire il tessuto con DPBS fresco. Rispetto ai topi knockout apolipoproteina E, le pareti aortiche dei topi apolipoproteina E knockout a cellule muscolari lisce TGF-beta-R2 mostrano grave aterosclerosi, rendendo difficile sezionare le lesioni. Inoltre, gli aneurismi sono particolarmente estesi al di sotto dell'aorta soprarenale, ricordando molto gli aneurismi aortici umani avanzati.Qui, viene mostrata un'immagine rappresentativa di un'aorta non aperta da un topo Apolipoproteina E ad alto contenuto di grassi alimentato con dieta ricca di colesterolo ad alto contenuto di grassi e condita con olio rosso O. Il topo ha sviluppato sia un aneurisma aortico ascendente che uno addominale con formazione accelerata di lesioni aterosclerotiche osservata nelle arterie brachiocefala, carotidea, succlavia, iliaca, femorale e renale. Questa colorazione en face Oil Red O del tessuto di topo Apolipoproteina knockout E di TGF-beta-R2 rivela un grave allargamento aneurismatico e un marcato allungamento dell'intera aorta rispetto al gruppo di topi knockout apolipoproteina E.È importante essere in grado di distinguere le placche macchiate di Oil Red O dal falso sfondo dei tessuti adiposi perivascolari macchiati di Oil Red O. Le placche di aterosclerosi sono fenomeni tridimensionali. Dopo la quantificazione della lesione 2D aortica en face, si consiglia l'analisi del set di placche come le radici aortiche e l'arteria brachiocefalica.Questo protocollo può anche essere utilizzato per decidere se un particolare fattore genetico, intervento o trattamento influisce sulla progressione o sulla regressione dell'aterosclerosi in questi modelli.

Research

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