Name: applying a three-dimensional uniaxial mechanical stimulation bioreactor system to induce tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells
Uploaded: 2020-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells at JoVE.com

Forskningen genomfördes medan författaren var i mottagandet av "en University of Western Australia International Fee Scholarship och en University Postgraduate Award vid University of Western Australia". Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (81802214).

De metoder som beskrivs godkändes och utfördes i enlighet med riktlinjerna och föreskrifterna från University of Western Australia Animal Ethics Committee.
1. Isolering av möss TDSC
<ol><li>Avliva 6-8 veckor gamla C57BL/6 möss genom livmoderhalscancer störningen.</li>
	<li>Harvest patellar senor24 och Hälsenor25.</li>
	<li>Digest senor från en med 6 ml typ I collagenase (3 mg/mL) för 3 h. OBS: Eftersom storleken på senan i musen ?...

Senan är en mekanosensitive fibrös bindväv. Enligt tidigare forskning, överskott mekanisk belastning kan leda till osteogenic differentiering av senstamceller, medan otillräcklig belastning skulle leda till störd kollagen fiberstruktur under sendifferentiering21.
En vanlig uppfattning är att nyckeln till en idealisk bioreaktor är förmågan att simulera in vitro-cellulär mikromiljö som cellerna in vivo genomgår. Därför, härma in vivo normal stress miljö i...

Tendinopati är en av de vanligaste idrottsskador. Det manifesteras främst av smärta, lokal svullnad, minskad muskelspänning i det drabbade området och dysfunktion. Förekomsten av tendinopati är hög. Förekomsten av Achilles tendinopati är vanligast för medel- och långdistanslöpare (upp till 29%), medan förekomsten av patellar tendinopati är också hög hos idrottare i volleyboll (45%), basket (32%), friidrott (23%), handboll (15%), och fotboll (13%)1,2,3,,4,5. Men på grund av den begränsade självläkande förmåga senan, och bristen på effektiva behandlingar, tendinopati påverkar fortfarande patienternas liv negativt6,7. Dessutom är patogenesen vid tendinopati fortfarande oklart. Det har gjorts många undersökningar om dess patogenes, främst inklusive "inflammation teori", "degeneration teori", "överanvändning teori", och så vidare8. För närvarande trodde många forskare att tendinopati berodde på den misslyckade självreparation till mikro-skador som orsakas av överdriven mekanisk belastning senan erfarenheter9,10.
Senhärledda stamceller (TDSC), som primära prekursorceller av senceller, spelar en viktig roll i både utvecklingen av tendinopati och funktionell och strukturell restaurering efter tendinopati11,12,13. Det rapporterades att mekanisk stressstimulering kan orsaka spridning och differentiering av osteocyter, osteoblater, glatta muskelceller, fibroblaster, mesenkymala stamceller och andra kraftkänsliga celler14,15,16,17,18. Därför kan TDSC, som en av de mekansokänsliga och multipotenta celler, på samma sätt stimuleras att skilja genom mekanisk belastning19,20.
Olika mekaniska lastningsparametrar (lastningsstyrka, lastningsfrekvens, lastningstyp och lastningsperiod) kan dock leda till att TDSC-enheter differentieras till olika celler21. Således är en effektiv och giltig mekanisk lastning regim mycket betydande för tenogenesis. Dessutom finns det olika typer av bioreaktorer som stimuleringssystem som för närvarande används för att tillhandahålla mekanisk belastning till TDSC. Principerna för varje typ av bioreaktor är olika, så de mekaniska belastningsparametrarna som motsvarar olika bioreaktorer är också olika. Därför är ett enkelt, ekonomiskt och reproducerbart stimuleringsprotokoll efterfrågat, inklusive typ av bioreaktor, motsvarande stimuleringsmedium och den mekaniska belastningsregimen.
Denna artikel beskriver en metod baserad på en tredimensionell (3D) enaxial stretching system för att stimulera TDSCs att differentiera till senliknande vävnad. Det finns sju stadier av protokollet: isolering av möss TDSCs, kultur och expansion av möss TDSCs, beredning av stimulering odlingsmedium för cell arkbildning, cell ark bildas genom odling i stimulering medium, beredning av 3D senstamcell konstruktion, montering av uniaxial-stretching mekanisk stimulering komplex, och utvärdering av den mekaniska stimuleras in vitro senor-liknande vävnad. Hela proceduren tar mindre än 3 veckor att få 3D-cellkonstruktion, vilket är mycket mindre än vissa befintliga metoder22,23. Det nuvarande protokollet har visat sig kunna inducera TDSCs att differentiera till senvävnad, och det är mer tillförlitligt än den nuvarande vanligen använda tvådimensionella (2D) stretching system21. Effektiviteten visades av histologi. Kort sagt, det nuvarande protokollet är enkelt, ekonomiskt, reproducerbart och giltigt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="860">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="156">
			<td height="156" style="height:156px;width:240px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:213px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PHR1008-2G</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:130px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco&#228; by Life Technologies</td>
			<td align="right">1908361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Histology processor</td>
			<td style="width:213px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">TP 1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)</td>
			<td>Gibco&#228; by Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2003802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:240px;">Mouse Tendon Derived Stem Cell</td>
			<td style="width:213px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;">Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:213px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">441244</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin and penicillin mixture</td>
			<td>Gibco&#228; by Life Technologies</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:240px;">Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System</td>
			<td style="width:213px;">Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;">Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495&#8211;1507. doi:10.1002/bit.24809</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco&#228; by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">1858331</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying a three-dimensional uniaxial mechanical stimulation bioreactor system to induce tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells

Tendinopati är en vanlig kronisk sena sjukdom som rör inflammation och degeneration i ett ortopediskt område. Med hög sjuklighet, begränsad självreparerande kapacitet och, viktigast av allt, inga definitiva behandlingar, påverkar tendinopati fortfarande patienternas livskvalitet negativt. Sena stamceller (TDSC), som primära prekursorceller av senceller, spelar en viktig roll i både utvecklingen av tendinopati och funktionell och strukturell restaurering efter tendinopati. En metod som kan in vitro efterlikna in vivo-differentiering av TDSC till senceller skulle därför vara användbar. Här beskriver det nuvarande protokollet en metod baserad på en tredimensionell (3D) enaxial stretching system för att stimulera TDSCs att differentiera till sena-liknande vävnader. Det finns sju stadier av det nuvarande protokollet: isolering av möss TDSCs, kultur och expansion av möss TDSCs, beredning av stimulering odling medium för cell arkbildning, cell ark bildas genom odling i stimulering medium, beredning av 3D senstamcell konstruktion, montering av uniaxial-stretching mekanisk stimulering komplex och utvärdering av den mekaniska stimuleras in vitro senor-liknande vävnad. Effektiviteten visades av histologi. Hela proceduren tar mindre än 3 veckor. För att främja extracellulära matris nedfall, 4.4 mg/mL askorbinsyra användes i stimulering odling mediet. En separerad kammare med linjär motor ger exakt mekanisk belastning och är bärbar och lättjusterad, som appliceras för bioreaktorn. Lastning regimen i det nuvarande protokollet var 6% stam, 0,25 Hz, 8 h, följt av 16 h vila i 6 dagar. Detta protokoll kan efterlikna cell differentiering i senan, vilket är till hjälp för undersökningen av den patologiska processen för tendinopati. Dessutom är senliknande vävnad potentiellt används för att främja sena läkning i sena skada som en konstruerad autolog graft. Sammanfattningsvis är det nuvarande protokollet enkelt, ekonomiskt, reproducerbart och giltigt.

Före mekanisk stimulering odlades TDSC till 100% sammanflödet i komplett medium och visade en oorganiserad ultrastrukturell morfologi (figur 2A). Efter 6 dagar av enaxlig stretching mekanisk belastning, extracellulär matris (ECM) och cell justeringar var väl orienterade (figur 2B). Cellerna var väl befolkade och väl insvept i ECM efter mekanisk belastning. Cellmorfologi presenterades för att vara långsträckt och var mer lik normal sencell jämfört med den utan stretching (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells at JoVE.com

Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells

Ett tredimensionellt enaxligt bioreaktorsystem för enaxlig mekanisk stimulering är ett idealiskt bioreaktor för tenogen-specifik differentiering av senhärledda stamceller och neo-senbildning.

Tillämpa ett tredimensionellt enaxiskt enaxligt bioreaktorsystem för mekanisk stimulering för att inducera tenogen differentiering av sena stamceller

Tendinopathy is a common chronic tendon disease relating to inflammation and degeneration in an orthopaedic area. With high morbidity, limited ...

Olika mekaniska lastningsparametrar skulle kunna inducera senor-härledda STAMCELLER differentieras till olika celler. Vi införa detaljerad process för att tillämpa denna tredimensionella uniaxial mekanisk stimulering bioreaktor system för att inducera tenogenic differentiering av senan-härledda STEM-celler. Tendinopati är en av de vanliga idrottsskador i ortopediska avdelningen.Förekomsten av Achilles tendinopati är vanligast med upp till 29%för medel-och långdistanslöpare, medan förekomsten av patella tendinopati är också hög i idrottare av volleyboll, basket, friidrott, handboll, och fotboll. Men på grund av den begränsade självläkningsförmågan hos senan och bristen på effektiv behandling har tendinopati fortfarande betydande negativ effekt på patienternas livskvalitet. Senan härledda stamceller, känd som TDSCs som de viktiga föregångare celler av senor celler, spelar en viktig roll i utvecklingen av tendinopati, liksom deras funktionella och strukturella restaurering efter tendinopati.Men skiljer sig från mekaniska lastning parametrar, såsom lastning stress, lastning frekvens, lastning typ, och lastning period kan inducera TDCs differentiera till olika celler. Således är en effektiv och giltig mekanisk lastning regim mycket betydande för senan uppkomsten. Det finns sju steg i det nuvarande protokollet, inklusive isolering av möss TDSCs, kultur och expansion av möss TDC, beredning av stimulering kultur medium för cell sheet formation, cell sheet formation by culturing in stimulation medium, beredning av 3D senan STEM cell konstruera, montering av de uniaxial cellerna sträcker mekanisk stimulering komplex, och utvärdering av den mekaniska stimuleras in vitro senan-liknande vävnad.Isolering av möss TDSCs. Används i möss som är sex till åtta veckor gamla möss av livmoderhalscancer störning. Skörda patella senor och hälsenor.Digest senan med sex milliliter Typ 1 kollagenas i tre timmar. Samla in cellerna och odla den i komplett alfa MEM som innehåller 10%av FBS och 1%av streptomycin och penicillin blandning i sju dagar. identifiera TDC:er med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering efter flödescytometri, uttryck för cellytmarkörer, inklusive CD44, CD90 och Sca-1.Brista av uttryckt av CD34 och CD45. Passage och frysa celler. Passaged celler kommer att användas för ytterligare steg.Kultur och expansion av möss TDC: er. Ta de uppvärmda mössen senstamceller. Tillsätt långsamt extra fyra till fem milliliter av komplett alfa MEM.Överför blandningen till ett centrifugrör på 15 milliliter med en pipett. Fylla på med medium till totalt åtta milliliter av en pipett. Placera röret i centrifug en väl balans.Centrifugceller vid 347 g i fem minuter. Ta fram ett rör från centrifugen. Kontrollera pelleten i botten.Dekantera det fria mediet. Åter upphäva celler försiktigt i en till två milliliter komplett medium. Undvika att göra för många bubblor.Överför åter upphängda celler till en T75-kolv med en pipett. Använd en pipett för att lägga till komplett alfa MEM-medium till kolven för att nå en total volym på 10 milliliter med den slutliga koncentrationen av 13, 000 celler per kvadratcentimeter. Placera kolven i inkubatorn och odla den i 37 grader med 5 %koldioxid.Byt medium var tredje dag. Observera och övervaka cellerna under ett mikroskop när du byter medium tills cellerna odlades till 100%sammanflöde. Beredning av stimuleringskulturmedium för cellplåtsbildning.Häll 15 milliliter komplett alfa MEM medium i en 15 milliliter sterilt rör. Tillsätt sex mikroliterskorbinsyra i 15 milliliter medium till den slutliga koncentrationen av 4,4 mikrogram per milliliter. Blanda försiktigt genom att invertera upp och ner.Cellarkbildande genom att kultförklaras i stimuleringsmedium. Kassera icke-normala komplett alfa MEM medium noggrant. Undvik att vidröra de celler som sitter vid botten av kolven.Tillsätt 10 milliliters stimulering medium långsamt. Undvik att orsaka störningar i de helt sammanflytande cellerna. Odla cellerna i stimuleringsmedium i nio dagar och ändra mediet var tredje dag för att tillräckligt generera cellark vid 37 grader med 5% av koldioxid.Beredning av 3D senan STEM-cell konstruera. Ta ut kolven ur inkubatorn. Kassera av stimuleringsmediet helt.Tvätta monolayercellsbladet med PBS genom att virvla kolven. Kassering av PBS helt. Använd en pipett för att lägga till en milliliter, 0,25%trypsin i hörnet av kolven.Tryck på hörnet av kolven för att lossa monolayer cell arket tills hörnet av cellen arket tvättar bort botten av kolven. Omedelbart lägga till nio milliliter komplett alfa MEM medium för att stoppa reaktionen av trypsinization. Fortsätt att virvla kolven för att helt skala bort monolayercellsplåten.Häll ut den totala för att fästa cellarket i Petri-skålen med medium. Använd en steril pincett för att plocka upp ett hörn av cellarket och rotera i medurs riktning i 15 gånger. Plocka upp en annan ände av cellen arket och rotera i en moturs riktning i 10 gånger för att formulera en sena-liknande in vitro-konstruktion.Montering av det uniaxial-stretching mekaniska stimuleringskomplexet i unik utformad bioreaktor. Anslut krokarna genom att kontakten, sedan justera till två centimeter mellan två krokar. Linda försiktigt 3D TDSCs konstruera på demokroken för tre gånger på varje krok.Säkra krokarna med cellkonstruktion på bioreaktorns kammare genom att dra åt skruvarna på två ändar. Fyll upp kammaren med det kompletta alfa-MEM-mediet. Anslut gaspedalen till kulturkammaren med kabel.Skär krokarna'connector genom steril pincett. Slå på ström- och kanalstyrenheten för att starta en mekanisk stimulering. Sätt locket på kammaren, spåra indikatorlamporna, och försäkra bioreaktorn kan fungera korrekt.Sätt bioreaktorn i inkubatorn och utsätt 3D-cellkonstruktionen för mekanisk sträckning. Lastningsregimen är 6%-stam, 0,25 Hertz-frekvens, åtta timmar följt av 16 timmars vila i sex dagar. Utvärdering av den mekaniska stimulerade in vitro-senan-liknande vävnaden.lossa skruvarna med en skruvmejsel och ta av monteringen försiktigt. Sätt senan-liknande vävnad i 4%PFA för fixering i 15 minuter, Placera den fasta senan-liknande vävnaden i en biopsi kassett med biopsi från husdjur. Bearbeta för att torka ut ett prov.Och slutligen, utvärdera genom HS histologisk stående. Upprepa hela protokollet och extrahera RNA från den senliknande vävnaden för utvärdering av uttrycket av tenogena markörer genom qPCR. Innan mekanisk stimulering, TDSCs kommer att växa till 100%sammanflödet i komplett medium och visa en oorganiserad utåt strukturella morfologi.Efter sex dagar du nästa såg stretching, mekanisk lastning, extra cellulära matris, och cellen anpassningar var väl orienterade. Celler var väl befolkade och väl omslöt i ECM efter mekanisk lastning. Cell morfologi presenterades för att vara belägen och var mer liknar normala senan celler jämfört med den med utan stretching.Celltätheten i cellkonstruktion med inläsning var högre än den utan att laddas. qPCR resultat visade att de nuvarande frågorna ökade uttrycket av tenogenic markörer, inklusive scleraxis, Mohawk, tenomodulin och typ 1 kollagen jämfört med de som behandlas av angivna kultur. När det gäller mekanisk stimulering bioreaktor system, separerade kammare med linjär motor användes i vårt nuvarande protokoll.Eftersom det kan ge exakt mekanisk lastning och det är portabel och lätt att justeras jämfört med hur de traditionella 2D-celler ark och biaxial stretch, 3D-cell konstruera är mer liknar den verkliga formen av senan. Och den uniaxiala stretch är mer lik de styrkor egenskaper senan celler. Detta ger en teoretisk grund för att använda 3D uniaxial sträckt system för att stimulera differentiering av TDC.Således var 2D-cell ark slutligen dirigeras in i en 3D-cell konstruera och genomgick uniaxial i det nuvarande protokollet. Enligt vårt bioreaktorsystem är vår lastningsregim 6%-stam, 0,25 Hertz-frekvens, åtta timmar följt av 16 timmars vila i sex dagar. Slutligen var effektiviteten av protokollet framgår av morfologi och uttrycksnivån av tenogenic markörer.Hela driftsprocessen är enkel, men operatören måste vara uppmärksam för att hålla miljön i TDSC steriliserad hela tiden. Det finns många tillämpningar av vårt protokoll. Processen för att stimulera TDC att efterlikna differentiering in vivo är till hjälp för undersökning av patologiska process av tendinopati.Förutom, detta protokoll ger en reproducerbar metod för riktad differentiering av TDSCs i senan-liknande vävnad. Så det kan användas enkelt och effektivt för potentiella konstruerad sena kultur. Sammanfattningsvis är tillämpa en 3D uniaxial mekanisk stimulering bioreaktor system enkel, ekonomisk, reproducerbar, och en giltig metod för att inducera tenogenic differentiering av TDC.Vårt protokoll ger hela processen i detaljer.

Research

JoVE Journal

Medicine

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Använda transkraniell magnetisk stimulering för att studera mänskliga neuromuskulära systemet

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolering, karakterisering och jämförande differentiering av mänskliga Dental celler Pulp Stem Härstammar från permanenta tänder med hjälp av två olika metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Utilizing Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to Improve Language Function in Stroke Patients with Chronic Non-fluent Aphasia

Använda Upprepande transkraniell magnetisk stimulering för att förbättra språk-funktion hos strokepatienter med kroniska icke-flytande afasi

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

En Tredimensionell Tissue Culture modell för att studera Primary humana benmärg och dess Maligniteter

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Tredimensionell kulturer: Ett verktyg för att studera Normal Acinar arkitektur kontra malignt Omformning av bröstceller

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

Kvantifiering av bröstcancer Cell Invasivt hjälp av en tredimensionell (3D) Modell

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tredimensionell (3D) Tumör Spheroid invasionsanalys

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Tredimensionell alginat-pärla Culture of Human hypofysadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

En enkel mekanisk procedur för att skapa limbus Stem Cell Brist på mus

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...