Name: streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica
Uploaded: 2020-06-16T15:00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica at JoVE.com

ونحن ممتنون لغارث إلسلي لدعمه في إنشاء النظام الثقافي. ونحن نعترف مساهمات ريتسوكو سوياما وسيلفان غيلوت في جهود أخذ العينات المبكرة وتحديد الأنواع. ومن المقرر شكر خاص لهيروكي نيشيدا، اكيشي أوناما، وتاتسويا أوموتزاكو لدعمهم وتوجيههم السخي في جميع أنحاء، بما في ذلك إنشاء أولي لنظام الاستزراع المحلي وتقاسم الحيوانات والثقافة الصغيرة. كما نشكر دانيال شوروت، وجان ماري بوكيه، وآن أسيوورد، وكريستيان كانيسترو، وألفونسو فيرناديز - رولدان لتقاسم خبراتهم في أخذ العينات والاستزراع. قدم جاي دينتون وتشارلز بلازي وجيفري جولي تعليقات لا تقدر بثمن على المخطوطة. وضعت شارلوت ويست معادلة معممة لحساب الطحالب. وأخيراً، نشكر OIST على التمويل، وماري كولينز ولجنة سلامة العمل الميداني التابعة لمنظمة "أوست" للحصول على المشورة بشأن إجراءات أخذ العينات الآمنة، وموظفي متجر آلات OIST لبناء معدات الزراعة وأخذ العينات، وكويتشي تودا لتسليم مياه البحر.

ليس لدى صاحب البلاغ ما يعلنه.

لتسهيل المرونة في تأسيس ثقافة O. دييكا، من المهم فهم الموائل الطبيعية للحيوانات. توفر البيانات الموسمية معلومات حول نطاقات المعلمات الفيزيائية، والتي يمكن استخدامها لتوجيه ظروف الزراعة المختبرية. كما أنه يساعد في فهم التقلبات الموسمية في وفرة الحيوانات. في أوكيناوا، تم العثور على أكثر موثوقية من يونيو إلى أكتوبر. ومع ذلك ، في خليج طوكيو ، يبلغ عدد السكان ذروته في فبراير و41أكتوبر . على الرغم من أن زراعة O. dioica غالبا ما يقال في 20 درجة مئوية أو أقل27,28,29, أوكيناوا O. dioica يظهر أفضل البقاء على قيد الحياة في درجات حرارة فوق 20 °C;. ويمكن تفسير ذلك من حقيقة أن درجة حرارة مياه البحر السطحية الدنيا في أوكيناوا هي 20 درجة مئوية(الشكل 6). قد تتأثر وفرة O. ديويكا أيضا من قبل تزهر العوالق النباتية42 و وفرة المفترس43,44. بغض النظر عن المكان الذي يتم فيه جمع O. dioica ، فإن فهم موسمية السكان المحليين يزيد من فرصة أخذ العينات ونجاح الاستزراع.
ونظرا للموسم المناسب والموقع، صافي أخذ العينات هو وسيلة فعالة لجمع أعداد كبيرة من Oikopleura مع الحد الأدنى من الجهد. ويمكن أيضا استخدام الشباك ذات الألواح ذات حجم الشبكة الأصغر (60-70 ميكرومتر) لجمع جميع مراحل الحيوانات. ونادرا ما توجد الحيوانات الناضجة تماما في الشبكة، وربما بسبب هشاشتها في نهاية دورة الحياة. ولذلك، يتم تحقيق تحديد الأنواع تليها أخذ العينات عن طريق المراقبة المجهرية للخلايا دون الحمراء. عادة ما يظهر الأفراد الناضجون بعد يوم أو يومين من أخذ العينات مع استمرار نمو الحيوانات في المختبر. وعلى الرغم من أن أخذ العينات الصافية يتسم بالكفاءة، فقد يكون من الضروري اتباع أساليب بديلة لأخذ العينات في ظروف مختلفة. على سبيل المثال، يمكن أخذ العينات الصافية بالقرب من المناطق الحضرية جمع أعداد كبيرة من العوالق النباتية، مما يجعل من الصعب عزل أوكوبلو مورا. في مثل هذه الحالات، يوصى بأخذ عينات بسيطة من الجرافة لجمع مياه البحر السطحية أو أخذ عينات من القوارب من مناطق خارج الميناء. وأظهرت النتائج أن التغير التدريجي في الملوحة بسبب أيام المطر المتتالية لم يؤثر على وفرة أو دييكا. ومع ذلك، ينبغي تجنب أخذ عينات الشاطئ مباشرة بعد الظواهر الجوية المتطرفة مثل الأعاصير المدارية. هذه الأحداث تسبب تغييرات كيميائية حيوية مفاجئة وجذرية في الجسم المحمي من الماء45,46. قد تحمل جريان مياه الأمطار الملوثات والرواسب والمواد المغذية الزائدة، والتي تزيد من العكر وانخفاض نوعية المياه47. قد تكون العوالق المغذية للتصفية، مثل Oikopleura،عرضة بشكل خاص لهذه التغييرات بسبب طريقة التغذية ومحدودية الحركة. في مثل هذه الظروف، نوصي بتأجيل أخذ العينات لبضعة أيام حتى تعود الظروف المحلية إلى طبيعتها.
إدخال نظام تصفية متعدد الخطوات أمر ضروري للحفاظ على الكائنات الصغيرة، والكائنات المغذية للتصفية مثل O. dioica. وباستخدام مياه البحر التي تمت تصفيتها بشكل سيئ (على سبيل المثال، شبكة 25 ميكرومتر في نظام الثقافة السابق)، كانت الثقافة غير مستقرة في كثير من الأحيان خاصة خلال فصل الصيف، مما قد يرجع إلى ارتفاع وفرة العوالق النباتية. على الرغم من أن بعض العوالق النباتية مفيدة لنمو O. ديويكا، والبعض الآخر إنتاج السموم البيومين التي يمكن أن تسبب تطورا غير طبيعي من أجنة O. ديويكا 48. وبالإضافة إلى ذلك، تركيز عالية من الدياتوم مثل Chaetoceros SPP. يحتمل أن تكون ضارة لنمو O. dioica لأنها يمكن أن تمتلك setae طويلة التي يمكن أن تسد المنزل ومنع التغذية الفعالة49. لاحظنا في كثير من الأحيان منازل الحيوانات الصغيرة التي انسداد من قبل C. calcitrans setae; لذلك، نحن الآن تغذية C. calcitrans فقط للحيوانات في اليوم 2 وما فوق(الجدول 3).
على الرغم من أنها لم تكن مشكلة هنا, على نطاق صغير على المدى الطويل زراعة O. دييكا يمكن أن تشهد انخفاض مفاجئ في حجم السكان بسبب اختناق وراثي; في مثل هذه الحالات، يوصي Martí-Solans وآخرون29 بإضافة أفراد جدد من البرية إلى الثقافة كل 20 جيلًا.
نظام ثقافة Oikopleura مرن. ويمكن تأسيس ثقافة مستقرة في غضون أسبوع. من الممكن زراعة أو دييكا على المدى الطويل على ميزانية متواضعة مع معدات غير متخصصة. الجهد اليومي اللازم للحفاظ على 5-10 قارور من أوكوبلوبورا هو عادة أقل من 2 ساعة مع 2 الناس. O. يمكن الحفاظ على ديويكا أيضا في مياه البحر الاصطناعية، وهو أمر مفيد لأولئك الذين لا يستطيعون الوصول إلى مياه البحر الطبيعية28. التخزين طويل الأجل من المواد الغذائية الطحالب ممكن باستخدام ثقافة صلبة و التبريد29. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون o. الحيوانات المنوية دييكا cryopreserved، وتبقى قابلة للحياة لأكثر من عام50. وكل هذه العوامل تعني أنه يمكن إعادة الثقافات بسهولة. وأخيرا ، تجربة الماضي مع زراعة عرضي من Pleurobrachia sp. قد تشير إلى أن نظام زراعة التي وضعت لأوكبلورا يمكن أن تمتد إلى مجتمع أوسع من الكائنات العضوية البحرية الهشة.
O. دييكا تواصل تقديم رؤى قوية في مختلف المجالات البيولوجية. إن فهم الموسمية المحلية، ونظام الثقافة الدقيق، وعدد قليل من الأفراد المتفانين يسمح بنشأة ثقافة فعالة مع القليل من الجهد. يوفر نظام أوكوببورا للثقافة الموارد الأساسية لدراسة مجموعة واسعة من المجالات البيولوجية المتعلقة بالبيئة والتنمية وعلم الجينوم وتطور هذه الوترات البحرية الفريدة.

وقد كانت الكائنات الحية النموذجية مفيدة في معالجة العديد من المسائل البيولوجية بما في ذلك تلك المتعلقة بالتنمية، وعلم الوراثة، وعلم وظائف الأعضاء. وعلاوة على ذلك، فإن الكائنات العضوية النموذجية الإضافية تسهل اكتشافات جديدة، وبالتالي فهي حاسمة لتحقيق فهم أكبر للطبيعة1،2. العوالق الحيوانية البحرية هي مجموعات متنوعة من الكائنات الحية التي تلعب دورا هاما في النظم الإيكولوجية للمحيطات3،4،5،6. على الرغم من وفرة وأهميتها الإيكولوجية، والكائنات الجيلاتية مثل tunicates planktonic غالبا ما تكون ممثلة تمثيلا ناقصا في دراسات التنوع البيولوجي العوالق لأن شفافيتها وهشاشتها جعل جمع الحقل وتحديد التحدي7،8. تقنيات أخذ العينات وتكييفها و الزراعة المختبرية تسمح لمراقبة أوثق من الحيوانات في المختبر، والتي زادت المعرفة في بيولوجيا planktonic tunicates9،10،11،12.
اليرقات (Appendicularians) هي فئة من التونيكات البحرية السباحة الحرة التي تضم حوالي 70 نوعا وصفت في جميع أنحاء العالم8،13. كما أنها واحدة من المجموعات الأكثر وفرة داخل المجتمعات العوالق الحيوانية14,15,16,17, تمثل اليرقات مصدر الغذاء الأساسي للكائنات الكبيرة العوالق مثل يرقات الأسماك18,19. على عكس ascidians-الريسيل tunicates-larvaceans الاحتفاظ مورفولوجيا مثل الشرغوف وتبقى planktonic طوال حياتهم20. يعيش كل داخل بنية تغذية مرشحية معقدة مبنية ذاتياً تعرف باسم المنزل. يتراكمون الجسيمات في بيوتهم عن طريق خلق تيارات المياه من خلال حركة متموجة من ذيولها21. يتم التخلص من المنازل المسدودة على مدار اليوم ، وبعضها يشكل مجاميع الكربون والمصارف في نهاية المطاف إلى قاع البحر22؛ وهكذا، تلعب اليرقات دوراً رئيسياً في تدفق الكربون العالمي23. وتفيد التقارير بأن معظم الأنواع تعيش في المنطقة البحرية الواقعة في حدود 100 متر من عمود الماء13؛ ومع ذلك، من المعروف أن اليرقات العملاقة Bathochordaeus أن يسكن أعماق 300 م24. وكشفت دراسة أجريت على باثوتشورديوس في خليج مونتيري، كاليفورنيا أن الحيوانات هي أيضا بمثابة ناقل بيولوجي للبلاستيك الدقيق، مما يشير إلى أهمية محتملة في فهم دور الزوائد في النقل الرأسي وتوزيع البلاستيك الدقيق في المحيطات25.
Oikopleura دييكا، وهو نوع من اليرقات ، وقد اجتذب الانتباه في السنوات الأخيرة ككائن حي نموذجي بسبب العديد من الخصائص الرائعة. ويشيع الإبلاغ عنه في جميع أنحاء محيطات العالم. هو خصوصا وافرة في المياه الساحلية26، والذي يسمح أخذ العينات سهلة من الشاطئ. على المدى الطويل، و الاستزراع مستقرة هو ممكن مع كل من مياه البحر الطبيعية والاصطناعية27،28،29. أوقات توليد درجة الحرارة تعتمد قصيرة مثل 4-9 أيام في ظروف المختبر. لديها براز عالية مع كل أنثى قادرة على إنتاج > 300 بيضة على مدار السنة. كما سترة، فإنه يحتل موضعاً مهمًا فيلوجينتيك لفهم تطور chordate30،31. في 70 ميغابايت، O. دييكا لديه أصغر الجينوم المحدد بين جميع chordates32. بين اليرقات، O. دييكا هو الأنواع غير الموصوفة فقط غير هيرامبورديتيك حتى الآن33.
أول نجاح O. dioica الثقافة مع المختبر نمت الطحالب الدقيقة وذكرت Paffenhöfer34. تم تطوير بروتوكول الثقافة الأصلي باستخدام المحركات والمجاذيف المتزامنة من قبل فينو وغورسكي35 واعتمدته في وقت لاحق من قبل مختبرات متعددة. وفي الآونة الأخيرة، أبلغ "فوجيوآخرون" (Fujii et al. 36) عن زراعة أو ديوكا في مياه البحر الاصطناعية، ونظام ثقافة قوي ومجموعة ميدانية وصفها بوكيه وآخرون27، وأبلغ مارتي-سولانس وآخرون29عن بروتوكول أمثل لنظام مبسط ومعقول التكلفة. وبصرف النظر عن النظام الثقافي التقليدي Oikopleura، تصميم ذكرت حديثا مع خزان تربية أنبوب مزدوج لديه أيضا القدرة على ثقافة Oikopleura sp. 37-
نقدم بروتوكول مفصل لبدء O. dioica أحادية الثقافة على أساس مجموعة من البروتوكولات التي وضعتها مجموعات البحوث الرئيسية Oikopleura في المركز الدولي للسارس للبيولوجيا الجزيئية البحرية27، جامعة برشلونة29، جامعة أوساكا28، وملاحظاتنا الخاصة. في بروتوكولات الثقافة المنشورة سابقا، تم وصف المعلومات التفصيلية المتعلقة بتكوين وسائل الإعلام الطحالب، وتقنيات أخذ العينات الشاطئية، وتحديد أوكبلورا تقريبا فقط، مما ترك الكثير من الغموض. هنا، مع مساعدة المعلومات المرئية في بروتوكول الفيديو، قمنا بتجميع جميع المعلومات الهامة اللازمة لإنشاء ثقافة أو دييكا من الألف إلى إلى المدى الأعلى بطريقة مباشرة، خطوة بخطوة. نحن وصف كيفية التمييز O. دييكا من الأنواع الأخرى التي يشيع ذكرها, O. longicauda, التي هي واحدة من الخطوات الأكثر تحديا. على الرغم من أن النظم الثقافية الحالية قابلة للتطبيق لزراعة O. dioica في جميع أنحاء العالم، فإننا نسلط الضوء على أهمية تعديل البروتوكول على أساس الظروف البيئية المحلية. وتجمع المعلومات المقدمة بين البيانات المنشورة على نطاق واسع، فضلا عن المعارف المكتسبة من خلال الخبرة. البروتوكول الحالي مناسب بشكل مثالي للباحثين المهتمين بتأسيس ثقافة من الصفر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2764-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alluminum pulley</td>
			<td>Rainbow Products</td>
			<td>10604-10607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalamin (B12)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-03682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>039-04412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium edetate hydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon wrench</td>
			<td>Anex</td>
			<td>No.6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>091-00872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jebao programmable auto dosing pump</td>
			<td>Jebao</td>
			<td>DP-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet pump</td>
			<td>REI-SEA</td>
			<td>RMD-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>134-15302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene wound cartridge filter</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>TCW-10N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-5N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-1N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwless terminal block</td>
			<td>SATO PARTS</td>
			<td>SL4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple plankton net</td>
			<td>RIGO, Japan</td>
			<td>5512-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metasilicate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>307815-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-02545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchronous electric motor</td>
			<td>Servo</td>
			<td>D5N6Z15M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamin hydrochloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV sterilizer</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>UVF-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194858</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica

Oikopleura dioica هو chordate planktonic مع قدرة استثنائية للتغذية الفلتر ، وقت التوليد السريع ، والتنمية المبكرة المحفوظة ، وميينوم مدمج. ولهذه الأسباب، يعتبر كائناً نموذجياً مفيداً للدراسات الإيكولوجية البحرية، والبيولوجيا التطورية، وعلم الجينوم. وبما أن البحوث تتطلب في كثير من الأحيان إمدادات ثابتة من الموارد الحيوانية، فمن المفيد إنشاء نظام ثقافة موثوق به ومنخفض الصيانة. هنا نحن وصف طريقة خطوة بخطوة لإنشاء ثقافة O. دييكا. ونصف كيفية اختيار مواقع المعاينة المحتملة، وطرق جمعها، وتحديد هوية الحيوانات المستهدفة، وإعداد نظام الاستزراع. نحن نقدم المشورة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها بناءً على تجاربنا الخاصة. كما نسلط الضوء على العوامل الحاسمة التي تساعد على الحفاظ على نظام ثقافة قوي. على الرغم من أن بروتوكول الثقافة المقدمة هنا هو الأمثل ل O. dioica، ونأمل لدينا تقنية أخذ العينات والإعداد الثقافة سوف تلهم أفكارا جديدة للحفاظ على اللافقاريات البحرية الهشة الأخرى.

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica at JoVE.com

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica هو كائن حي نموذجي في مختلف مجالات البيولوجيا. نحن نصف أساليب أخذ العينات، وتحديد الأنواع، وإعداد زراعة، وبروتوكولات زراعة للحيوانات وعلف الطحالب. ونسلط الضوء على العوامل الرئيسية التي ساعدت على تعزيز النظام الثقافي ومناقشة المشاكل والقرارات المحتملة.

تبسيط أخذ العينات وزراعة اليرقات العالمية الأوقيانوسية، أوكوبيورا دييكا

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

هذا البروتوكول يوضح بصريا كيفية إنشاء طويلة الأجل، ونظام ثقافة موثوق بها للثنية البحرية أويكولبورا ديويكا. يوفر نظام ثقافة Oikopleura الموارد الأساسية لدراسة مجموعة واسعة من المجالات البيولوجية المتعلقة بالبيئة والتنمية وعلم الجينوم والتطور. هذا النوع لديه دورة حياة قصيرة، وبراز عالية، ويمكن جمعها بسهولة من الشاطئ، مما يجعلها كائن حي نموذج ممتاز.على الرغم من أن هذا البروتوكول هو الأمثل ل O.dioica، ونحن نأمل أن يمكن تطبيقه على الكائنات الحية planktonic أخرى. للبدء، بدء الغذاء الطحالب للحفاظ على ثقافة Oikopleura، بدءا من autoclaving مياه البحر المصفاة. لبدء ثقافة الأسهم من Chaetoceros calcitrans ، تم استكمال 60 مل من مياه البحر ذات التكفا مع ما يلي : 30 ميكرولتر من الفيتامينات ، 30 ميكرولترات من الحل A ، 15 ميكرولترات من سيليكات الصوديوم ، و 60 ميكرولتر من الستريبتومايسين.وأخيرا، تمت إضافة 30 ميكرولترات من C.calcitrans من ثقافة الأسهم السابقة باعتبارها تلقيح. راجع الجدول الثاني في المخطوطة المتعلق بمجلات المكملات واللقح للأنواع الطحالب الأخرى وأنواع الاستزراع. بعد التطعيم ، يتم الحفاظ على الأسهم والثقافات الفرعية في حاضنة عند 17 درجة مئوية مع إضاءة مستمرة.بعد ما يقرب من 10 يوما، يتم تأكيد نمو الطحالب من قبل القارورة تصبح ملونة. عندما يحدث ذلك، نقل الثقافات الأسهم إلى التخزين على المدى الطويل في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد مع الحفاظ على ثقافة فرعية في الحاضنة نفسها. لخلق ثقافة العمل، إضافة المكملات الغذائية اللازمة إلى 400 مل من مياه البحر أوتكاوندفيد وتلقين مع 100 مل من الثقافة الفرعية السابقة.ختم القارورة مع غطاء مطاطي، وإدراج ماصة واحدة mil، المتاح، ونقلها إلى محطة الطحالب والحفاظ عليها في درجة حرارة الغرفة مع photoperiod لمدة ثماني ساعات والتهيّم المستمر. دوّامة الطحالب يدوياً مرتين في اليوم لمنع التجميع في الجزء السفلي من القارورة. وبمجرد تأسيس الثقافات الطحالب، قم بجمع عينات ميدانية في موقع محلي.يلقي شبكة من الدول، والسماح لنهاية سمك القد لإغراق متر إلى مترين تحت السطح. سحب الشبكة بسرعة حوالي 5 إلى متر واحد في الثانية. استمر في السحب ذهاباً وإياباً لمدة تتراوح بين دقيقتين وخمس دقائق.وينبغي تعديل وقت القطر وفقا لوفرة الدول في الموقع. بعد السحب، ورفع بعناية خارج الشبكة ونقل ببطء محتويات نهاية سمك القد إلى 500 ميل، زجاجة. ملء زجاجة إلى حافة لتجنب فقاعات الهواء التي يمكن أن تسبب الإجهاد للحيوانات أثناء النقل.في هذه المرحلة، يمكن تأكيد وجود أوكوبلورا عن طريق عرض زجاجات العينة على خلفية داكنة. ومع ذلك، فإن المراقبة المجهرية مطلوبة لتحديد مستوى الأنواع. كرر هذه العملية حتى تم جمع ثلاث زجاجات 500 ميل.جمع مياه البحر السطحية لتسجيل الملوحة ودرجة الحرارة وتركيز الكلوروفير مع محلل CTD. بالإضافة إلى ذلك، جمع 10 إلى 15 لترا من مياه البحر في الموقع للمساعدة في التأقلم الحيوانات لظروف المختبر. ولتكميم الحيوانات، قم بإعداد نسبة مياه البحر السطحية من موقع العينة إلى واحد، ومياه البحر التي تمت تصفيتها في المختبر.يجب تعديل الحجم النهائي إلى ما بين خمسة إلى 10 لترات ، اعتمادًا على تركيز عينة الألواح. قم بإضافة عينة 500 ميل بعناية إلى القارض المعد. باستخدام مجداف تعلق على محرك متزامن الدورية في 15 دورة في الدقيقة، والحفاظ على الدول المعلقة في الليل.في صباح اليوم التالي، تحقق من وجود أوكوبلو مورا بالعين. نقل الحيوانات إلى طبق بيتري، ومراقبة تحت مجهر حقل الظلام تعيين إلى ما بين التكبير 20 إلى 40 مرة لتحديد إيجابية. تتميز Oikopleura بأنها على شكل شرغوف متموجة في ذيولها داخل منزل شفاف.لتأكيد O.dioica، ابحث عن الذكور ناضجة تماما مع السناد الأصفر أو الإناث مع البيض. إذا كانت الحيوانات غير ناضجة ، ابحث عن وجود خليتين دون كل منهما في نصف الذيل. هذه موجودة في كل من الحيوانات الناضجة وغير الناضجة.بمجرد تأكيد الأنواع ، قم بنقلها إلى طبق بيتري جديد. كرر هذه العملية حتى تم تأكيد 10 إلى 20 فردًا على مستوى الأنواع. إذا لم يتم العثور على O.dioica، والحفاظ على الإثارة منقار ليوم أو يومين.سوف O.dioica الصغيرة التي لم تكن في البداية يمكن ملاحظتها تستمر في النمو وتصبح أسهل في الرؤية. إذا لم يظهر أي منها بعد أسبوع واحد، فتجاهل العينة وحاول أخذ العينات مرة أخرى. من أجل إنشاء زراعة أحادية، عزل 120 O.dioica من عينة حقل في خمسة لترات من مياه البحر المصفاة.في صباح اليوم التالي، ابحث عن الذكور الناضجين تمامًا الذين تم تحديدهم بواسطة السناد الأصفر وللإناث مع البيض الذي يظهر على أنه متلألئ، والمجالات الذهبية. إعداد منقار التفريخ عن طريق نقل بلطف 15 من الذكور و 30 أنثى مع خمسة مل، حادة الهادصة إلى منقار يحتوي على 2.5 لتر من مياه البحر المصفاة. لتقليل الضغط الجسدي أثناء النقل اليدوي، قم بإطلاق سراح الحيوانات ببطء تحت سطح مياه البحر الجديدة.السماح للبالغين المعزولين بالتفريخ بشكل طبيعي. بعد التفريخ، يمكن تأكيد الإخصاب الناجح عن طريق استخراج خمسة إلى 10 مل من مياه البحر من قاع منقار التفريخ وتحديد البيض مع انشقاقات تحت المجهر. في صباح اليوم الأول بعد التفريخ، اليوم الأول، يجب أن يظهر جيل جديد من الحيوانات الصغيرة ذات المنازل المضخمة في القارق.استخدمي منقار محمولاً بـ500 ميل لنقل الحيوانات بلطف إلى منبر جديد يحتوي على 7.5 لتر من مياه البحر العذبة المصفاة. صب المحتوى ببطء على السطح لتقليل الاضطرابات وقوا القص. في اليوم الثاني بعد التفريخ، اليوم الثاني، نقل 150 حيوانا يدويا إلى قارب جديد يحتوي على خمسة لترات من مياه البحر العذبة المصفاة.في الصباح الثالث بعد التفريخ، اليوم الثالث، نقل يدويا 120 حيوانا إلى بقار جديد مع خمسة لترات من مياه البحر الطازجة، المصفاة. بحلول اليوم الرابع ، ناضجة جنسيا ، وينبغي أن تكون الحيوانات البالغة موجودة. جمع 15 من الذكور و 30 أنثى لقارح تفريخ جديد مع 2.5 لتر من مياه البحر المصفاة لبدء الجيل القادم.يتم تكرار هذه العملية والحفاظ عليها لحياة الثقافة. من أجل الحفاظ على ثقافة أحادية من O.dioica، يتم إعداد الطعام الطحالب يوميا من الثقافات العاملة. يتم إطعام الحيوانات ثلاث مرات في اليوم.إعداد الغذاء اليومي عن طريق قياس امتصاص ثقافة العمل باستخدام مقياس الطيفي تعيين في 660 نانومتر. يتم وضع قيم الامتصاص ، وحدات التخزين المستهدفة في O.dioica culture ، ونضج الحيوان في جدول بيانات معد بناءً على منحنى نمو الطحالب المحدد مسبقًا لحساب الحجم الدقيق للطحالب المطلوبة لتغذية اليوم. Pipette وحدات التخزين المحسوبة في أنابيب 50 مليون، والطرد المركزي في 5، 000g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.صب ببطء قبالة مُتطّر، وماصة بعناية صعودا وهبوطاً لإعادة تعليق الطحالب الوُكية. إعادة ملء الأنابيب إلى حجمها الأصلي مع مياه البحر الطازجة، وتصفية. استنادًا إلى مخطط التغذية الطحالبي اليومي من جدول البيانات، قم بتغذية المبلغ المحدد لكل من القارق في الساعة 9 .m.12 ص.m و5 .m. يمكن تعيين مضخة الزُنَة الآليّة لإطعام الحيوانات في 5 .m.في عطلة نهاية الأسبوع دون وجود الموظفين زراعة. بعد كل تغذية، والحفاظ على الغذاء الطحالب المعدة في أربع درجات مئوية حتى جاهزة لاستخدامها في الأعلاف المقبل. O.dioica يمكن جمعها من ميناء عن طريق سحب لطيف من صافي العوالق المعدلة مزودة شبكة 100 ميكرون ونهاية سمك القد غير مرشح.أظهرت العينات بين عامي 2015 و 19 اختلافًا موسميًا في وجود O.dioica في موانئ أوكيناوا. ويبدو أن درجة حرارة مياه البحر السطحية تؤثر على وجود الحيوانات. سيطر O.dioica عندما كانت درجة حرارة مياه البحر السطحية 28 درجة أو أعلى.تعايشت O.dioica مع Oikopleura longicauda في درجات حرارة تتراوح بين 24 إلى 27 درجة. ومع ذلك، هيمنت أو لونغيكاودا في درجات حرارة أقل من 23 درجة. ولم ترتبط التغيرات في الملوحة بوفرة أو دييكا.أهم ثلاثة عوامل لإنشاء أنظمة ثقافة O.dioica مستقرة هي الحفاظ على جودة المياه العالية مع نظام ترشيح متعدد الخطوات ، وتحديد نظام التغذية الأمثل ، ويفضل عن طريق إنشاء منحنيات قياسية الطحالب ، وإعداد مناقور التفريخ مع أعداد كافية من الذكور والإناث. بعد البروتوكول المقدمة، دورة حياة O.dioica أربعة أيام في 23 درجة. لقد أنشأنا بشكل موثوق ستة سكان مستقلين من أودييكا، والتي استمرت جميعها أكثر من 20 جيلا.في الختام، يمكن إنشاء ثقافة مستقرة من O.dioica يتم بسرعة وفعالية من حيث التكلفة. مع الإعداد المناسب، يمكن تحقيق ثقافة مستقرة في غضون أسبوع واحد. بالتزامن مع الجينوم الصغير و دورة الحياة السريعة ، وهذا يجعل O.dioica أنواع نموذج قوي.يمكن الحفاظ على O.dioica في كل من مياه البحر الاصطناعية والطبيعية. التخزين على المدى الطويل من المواد الغذائية الطحالب ممكن باستخدام ثقافة صلبة و التبريد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضًا أن يتم تقديم الحيوانات المنوية من O.dioica في حالة اِلَتَمْدٍ والبقاء صالحة لأكثر من عام.O.dioica تواصل تقديم رؤى قوية في مختلف المجالات البيولوجية. إن فهم الموسمية المحلية، ونظام الثقافة الدقيق، وعدد قليل من الأفراد المتفانين يسمح بنشأة ثقافة فعالة مع القليل من الجهد.

Research

JoVE Journal

Environment

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Lysimetry متكاملة الميدانية وأخذ العينات Porewater لتقييم التنقل الكيميائية في التربة والغطاء النباتي تأسست

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

أخذ العينات التربة والنيماتودا الممرضة للحشرات عزل (Steinernematidae، Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

نظيفة أخذ العينات وتحليل نهر ومصبات الأنهار المياه للدراسات المعدنية تتبع

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

Modification and Application of a Leaf Blower-vac for Field Sampling of Arthropods

تعديل وتطبيق ورقة المنفاخ-VAC لأخذ العينات مجال المفصليات

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

بروتوكول للجزيئات البلاستيك الصغيرة أخذ العينات على سطح البحر وتحليل عينة

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

الأرض أخذ عينات التربة في بحوث غير متجانسة

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the ...

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

جديدة محمولة في المختبر تعرض كاسيت لأخذ العينات الهباء الجوي

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

زراعة الطحالب الخضراء في فقاعة العمود Photobioreactors وفحص للدهون محايدة

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri Uljanin 1884 for Experimental Studies

زراعة البحرية التونيكات دوليوليتا gegenbauri (Uljanin 1884) للدراسات التجريبية

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

Sampling for Estimating Frankliniella Species Flower Thrips and Orius Species Predators in Field Experiments

Sampling for Estimating Frankliniella Species Flower Thrips and Orius Species Predators in Field Experiments

أخذ العينات لتقدير أنواع فرانكلينيلا زهرة ثريبس والحيوانات المفترسة الأنواع أوريوس في التجارب الميدانية

The western flower thrips, Frankliniella occidentalis (Pergande), is a polyphagous pest that has been spread worldwide. The extensive use of insecticides ...