Name: streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica
Uploaded: 2020-06-16T15:00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica at JoVE.com

We zijn Garth Ilsley dankbaar voor zijn steun bij het opzetten van het cultuursysteem. We erkennen de bijdragen van Ritsuko Suyama en Sylvain Guillot aan vroege inspanningen op het nemen van monsters en soortenidentificatie. Speciale dank is te danken aan Hiroki Nishida, Takeshi Onuma, en Tatsuya Omotezako voor hun genereuze steun en begeleiding in de hele, met inbegrip van de eerste oprichting van de lokale kweeksysteem en het delen van dieren en microalgal cultuur. We danken ook Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Cañestro en Alfonso Ferrández-Roldán voor het delen van hun expertise op het gebied van sampling en culturing. Jai Denton, Charles Plessy en Jeffrey Jolly gaven waardevolle feedback over het manuscript. Charlotte West formuleerde een algemene vergelijking voor algenberekening. Tot slot danken we OIST voor de financiering, Mary Collins en het OIST Fieldwork Safety Committee voor advies over veilige bemonsteringsprocedures, het personeel van OIST-machinewinkel voor de bouw van kweek- en bemonsteringsapparatuur, en Koichi Toda voor het leveren van zeewater.

De auteur heeft niets te verklaren.

Om de flexibiliteit bij de vestiging van de O. dioicacultuur te vergemakkelijken, is het belangrijk om de natuurlijke habitat van de dieren te begrijpen. Seizoensgegevens geven informatie over het bereik van fysieke parameters, die kunnen worden gebruikt om laboratoriumcultusomstandigheden te begeleiden. Het helpt ook bij het begrijpen van seizoensgebonden schommelingen in de overvloed aan dieren. In Okinawa, O. dioica is het meest betrouwbaar gevonden van juni tot oktober. Echter, in De baai van Tokio, bevolking piek in februari en41oktober . Hoewel het kweken van O. dioica vaak wordt gemeld bij 20 °C of lager27,28,29, toont Okinawan O. dioica een betere overleving bij temperaturen boven de 20 °C; dit kan worden verklaard door het feit dat de minimumtemperatuur aan zeewater in Okinawa ~20 °C is (figuur 6). De overvloed aan O. dioica kan ook worden beïnvloed door fytoplanktonbloei42 en roofdierovervloed43,44. Ongeacht waar O. dioica worden verzameld, het begrijpen van de seizoensgebondenheid van de lokale bevolking maximaliseert de kans op bemonstering en het kweken van succes.
Gezien het juiste seizoen en de juiste locatie, netto bemonstering is een effectieve manier om grote aantallen Oikopleura te verzamelen met minimale inspanning. Planktonnetten met een kleinere maaswijdte (60-70 μm) kunnen ook worden gebruikt om alle stadia van de dieren te verzamelen. Volledig volwassen dieren worden zelden in het net aangetroffen, misschien vanwege hun kwetsbaarheid aan het einde van de levenscyclus. Daarom wordt de identificatie van soorten gevolgd door bemonstering bereikt door microscopische observatie van subchordalcellen. Volwassen individuen verschijnen meestal een of twee dagen na de bemonstering als dieren blijven groeien in het laboratorium. Hoewel de nettobemonstering efficiënt is, kunnen in verschillende omstandigheden alternatieve bemonsteringsmethoden nodig zijn. Bijvoorbeeld, netto bemonstering in de buurt van stedelijke gebieden kan verzamelen grote aantallen fytoplankton, waardoor het moeilijk is om Oikopleurate isoleren . In dergelijke gevallen wordt aanbevolen om eenvoudige emmerbemonstering te verzamelen om oppervlaktezeewater of bootbemonstering te verzamelen uit gebieden buiten de haven. De resultaten toonden aan dat de geleidelijke verandering in het zoutgehalte als gevolg van opeenvolgende regendagen geen invloed had op de overvloed aan O. dioica; echter, kust bemonstering onmiddellijk na extreme weersomstandigheden zoals tropische cyclonen moeten worden vermeden. Deze gebeurtenissen veroorzaken plotselinge en drastische biogeochemische veranderingen in een beschut waterlichaam45,46. De afvoer van hemelwater kan verontreinigende stoffen, sedimenten en overtollige voedingsstoffen vervoeren, die troebelheid en lagere waterkwaliteit verhogen47. Filtervoedend plankton, zoals Oikopleura,kan bijzonder gevoelig zijn voor deze veranderingen als gevolg van hun wijze van voeding en beperkte mobiliteit. In een dergelijke omstandigheid raden we aan de bemonstering een paar dagen uit te stellen totdat de lokale omstandigheden weer normaal zijn.
De invoering van een multi-step filtersysteem is essentieel voor het behoud van kleine, filter-voedende organismen zoals O. dioica. Met behulp van slecht gefilterd zeewater (bijvoorbeeld een 25 μm mesh in het vorige cultuursysteem) was de cultuur vaak instabiel, vooral in de zomer, mogelijk door de hogere overvloed aan fytoplankton. Hoewel sommige fytoplankton gunstig zijn voor o. dioica groei, produceren anderen biotoxines die abnormale ontwikkeling van O. dioica embryo's kunnen veroorzaken48. Bovendien is een hoge concentratie diatomeeën zoals Chaetoceros spp. potentieel schadelijk voor o. dioica groei als ze kunnen beschikken over lange setae die het huis kan verstoppen en te voorkomen dat efficiënte voeding49. We zagen vaak huizen van kleine dieren verstopt door C. calcitrans setae; daarom voeren we C. calcitrans nu alleen aan dieren op dag 2 en ouder(tabel 3).
Hoewel het hier geen probleem was, kan kleinschalige langdurige culturing van O. dioica plotselinge dalingen in bevolkingsomvang ervaren als gevolg van een genetisch knelpunt; in dergelijke gevallen, Martí-Solans et al.29 raden het toevoegen van nieuwe wilde individuen aan de cultuur om de 20 generaties.
Het Oikopleura cultuursysteem is flexibel. Binnen een week kan een stabiele cultuur tot stand komen. Lange termijn culturing van O. dioica is mogelijk op een bescheiden budget met niet-gespecialiseerde apparatuur. De dagelijkse inspanning die nodig is voor het onderhoud van 5-10 bekers van Oikopleura is over het algemeen minder dan 2 uur met 2 personen. O. dioica kan ook worden gehandhaafd in kunstmatig zeewater, wat gunstig is voor mensen zonder toegang tot natuurlijk zeewater28. Langdurige opslag van algenvoedsel is mogelijk met behulp van vaste cultuur en cryopreservatie29. Bovendien kan O. dioica sperma worden cryopreserved, en levensvatbaar blijven voor meer dan een jaar50. Al deze factoren betekenen dat culturen gemakkelijk kunnen worden hersteld. Tot slot, verleden ervaring met toevallige culturing van Pleurobrachia sp. kan suggereren dat het voor Oikopleura ontwikkelde kweeksysteem mogelijk kan worden uitgebreid tot een bredere gemeenschap van kwetsbare pelagische organismen.
O. dioica blijft krachtige inzichten bieden in verschillende biologische gebieden. Een goed begrip van lokale seizoensgebondenheid, een nauwgezet cultuursysteem en een paar toegewijde individuen maken het mogelijk om effectieve cultuur met weinig inspanning tot stand te brengen. Oikopleura cultuursysteem biedt de basismiddelen om een breed scala van biologische gebieden met betrekking tot ecologie, ontwikkeling, genomica, en de evolutie van deze unieke mariene chordaat te onderzoeken.

Modelorganismen hebben veel biologische vragen aangepakt, waaronder die met betrekking tot ontwikkeling, genetica en fysiologie. Bovendien vergemakkelijken aanvullende modelorganismen nieuwe ontdekkingen en zijn daarom van cruciaal belang om een beter begrip van de natuur te bereiken1,2. Marien zoöplankton zijn diverse groepen organismen die een belangrijke rol spelen in oceaanecosystemen3,4,5,6. Ondanks hun overvloed en ecologisch belang, gelatineachtige organismen zoals plankton manieten zijn vaak ondervertegenwoordigd in plankton biodiversiteit studies, omdat hun transparantie en kwetsbaarheid maken veld collectie en identificatie uitdagend7,8. Aangepaste bemonsteringstechnieken en laboratoriumculten maken een betere observatie van de dieren in vitro mogelijk, die de kennis in de biologie van planktonionische man enelegaten9,10,11,12heeft bevorderen .
Larvaceans (Appendicularians) zijn een klasse van vrij zwemmende mariene manudieren bestaande uit ongeveer 70 beschreven soorten wereldwijd8,13. Aangezien zij een van de meest voorkomende groepen binnen zoöplanktongemeenschappen14,15,16,17, larvaceans vormen een primaire voedselbron voor grotere planktonorganismen zoals vislarven18,19. In tegenstelling tot ascidians-de sessile manuici-larves behouden een kikkervis-achtige morfologie en blijven planktoniek gedurende hun hele leven20. Elk dier leeft in een zelfgebouwde, ingewikkelde filter-feeding structuur bekend als een huis. Ze accumuleren deeltjes in hun huizen door het creëren van waterstromen door de golvende beweging van hun staarten21. Verstopte huizen worden gedurende de dag weggegooid, waarvan sommige koolstofaggregaten vormen en uiteindelijk zinken naar de zeebodem22; larvaceans spelen dus een belangrijke rol in de wereldwijde koolstofflux23. De meeste soorten worden gemeld om in de pelagische streek binnen de hogere 100 m van de waterkolom13te leven; echter, de reus larvacean Bathochordaeus is bekend dat de diepten van 300 m24bewonen. Een studie over Bathochordaeus in Monterey Bay, Californië bleek dat de dieren ook dienen als een biologische vector van microplastics, wat wijst op een potentieel belang in het begrijpen van de rol van blinden in het verticale transport en de distributie van microplastics in de oceanen25.
Oikopleura dioica, een soort larvacïteïsche, heeft de afgelopen jaren de aandacht getrokken als modelorganisme vanwege een aantal opmerkelijke kenmerken. Het wordt vaak gemeld in de oceanen van de wereld. Het is vooral overvloedig in kustwateren26, waardoor gemakkelijk te proeven vanaf de kust. Langdurige, stabiele kweek is mogelijk met zowel natuurlijk als kunstmatig zeewater27,28,29. Temperatuur afhankelijke generatie tijden zijn zo kort als 4-9 dagen in laboratoriumomstandigheden. Het heeft een hoge haalbaarheid met elk vrouwtje in staat om te produceren >300 eieren het hele jaar door. Als een tunicate, het neemt een belangrijke fylogenetische positie voor het begrijpen van chordate evolutie30,31. Met 70 Mb heeft O. dioica het kleinste geïdentificeerde genoom onder alle chordates32. Onder larvaceans, O. dioica is de enige beschreven niet-hermafrodiet soorten tot nu toe33.
De eerste succesvolle O. dioica cultuur met laboratorium gekweekte microalgen werd gemeld door Paffenhöfer34. Het oorspronkelijke cultuurprotocol met synchrone motoren en peddels werd ontwikkeld door Fenaux en Gorsky35 en later overgenomen door meerdere laboratoria. Meer recent, Fujii et al.36 gemeld O. dioica culturing in kunstmatig zeewater, een robuuste cultuur systeem en veld collectie werden beschreven door Bouquet et al.27 en een geoptimaliseerd protocol voor een vereenvoudigd, betaalbaar systeem werd gemeld door Marti-Solans et al.29. Afgezien van de traditionele Oikopleura cultuur systeem, een nieuw gemeld ontwerp met een dubbele buis opfok tank heeft ook het potentieel om cultuur Oikopleura sp. 37.
We presenteren een gedetailleerd protocol voor het initiëren van een O. dioica monocultuur op basis van een combinatie van protocollen ontwikkeld door grote Oikopleura onderzoeksgroepen aan het Sars International Centre for Marine Molecular Biology27,de Universiteit van Barcelona29, Osaka University28, en onze eigen waarnemingen. In eerder gepubliceerde cultuurprotocollen werden gedetailleerde informatie over de samenstelling van algenmedia, kustbemonsteringstechnieken en Oikopleura-identificatie slechts ruwweg beschreven, waardoor er veel onduidelijkheid overblijft. Hier, met behulp van visuele informatie in het videoprotocol, hebben we alle kritieke informatie verzameld die nodig is om een O. dioica-cultuur van de grond af op een eenvoudige, stapsgewijze manier op te zetten. We beschrijven hoe je O. dioica onderscheidt van een andere vaak gerapporteerde soort, O. longicauda, wat een van de meest uitdagende stappen is. Hoewel de bestaande cultuursystemen wereldwijd van toepassing zijn op de teelt van O. dioica, benadrukken we het belang van protocolaanpassing op basis van lokale omgevingsomstandigheden. De gepresenteerde informatie combineert op grote schaal gepubliceerde gegevens en kennis opgedaan door ervaring. Het huidige protocol is bij uitstek geschikt voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het vestigen van een cultuur vanaf nul.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2764-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alluminum pulley</td>
			<td>Rainbow Products</td>
			<td>10604-10607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalamin (B12)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-03682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>039-04412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium edetate hydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon wrench</td>
			<td>Anex</td>
			<td>No.6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>091-00872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jebao programmable auto dosing pump</td>
			<td>Jebao</td>
			<td>DP-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet pump</td>
			<td>REI-SEA</td>
			<td>RMD-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>134-15302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene wound cartridge filter</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>TCW-10N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-5N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-1N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwless terminal block</td>
			<td>SATO PARTS</td>
			<td>SL4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple plankton net</td>
			<td>RIGO, Japan</td>
			<td>5512-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metasilicate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>307815-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-02545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchronous electric motor</td>
			<td>Servo</td>
			<td>D5N6Z15M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamin hydrochloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV sterilizer</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>UVF-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194858</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica

Oikopleura dioica is een planktonische chordate met uitzonderlijke filter-voeding vermogen, snelle generatie tijd, bewaard vroege ontwikkeling, en een compact genoom. Om deze redenen wordt het beschouwd als een nuttig modelorganisme voor mariene ecologische studies, evolutionaire ontwikkelingsbiologie en genomica. Aangezien onderzoek vaak een gestage aanvoer van dierlijke hulpbronnen vereist, is het nuttig om een betrouwbaar, onderhoudsarm cultuursysteem op te zetten. Hier beschrijven we een stapsgewijze methode voor het opzetten van een O. dioica cultuur. We beschrijven hoe potentiële bemonsteringsplaatsen, verzamelmethoden, identificatie van dieren en de opzet van het kweeksysteem kunnen worden geselecteerd. We geven advies over het oplossen van problemen op basis van onze eigen ervaringen. We belichten ook kritische factoren die helpen om een robuust cultuursysteem in stand te houden. Hoewel het hier verstrekte cultuurprotocol is geoptimaliseerd voor O. dioica,hopen we dat onze samplingtechniek en cultuuropstelling nieuwe ideeën zullen inspireren voor het behoud van andere kwetsbare pelagische ongewervelde dieren.

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica at JoVE.com

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is een tunicate model organisme op verschillende gebieden van de biologie. We beschrijven bemonsteringsmethoden, soortenidentificatie, kweekopstelling en kweekprotocollen voor de dieren en algenvoer. We belichten belangrijke factoren die hebben bijgedragen aan de versterking van het cultuursysteem en het bespreken van de mogelijke problemen en oplossingen.

Gestroomlijnde bemonstering en teelt van de Pelagische Kosmopolitische Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

Dit protocol laat visueel zien hoe je een betrouwbaar cultuursysteem op lange termijn opzetten voor de mariene pelagische tunicate Oikopleura dioica. Oikopleura cultuursysteem biedt de basismiddelen om een breed scala van biologische gebieden met betrekking tot ecologie, ontwikkeling, genomics en evolutie te onderzoeken. Deze soort heeft een korte levenscyclus, hoge fecundity, en het kan gemakkelijk worden verzameld vanaf de kust, waardoor het een uitstekend model organisme.Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor O.dioica, hopen we dat het kan worden toegepast op andere planktonische organismen. Om te beginnen, initiëren algen voedsel om Oikopleura cultuur te ondersteunen, te beginnen met autoclaving gefilterd zeewater. Om een voorraadcultuur van Chaetoceros calcitrans te initiëren, werd 60 mils autoclaved zeewater aangevuld met de volgende:30 microliter vitaminen, 30 microliter van oplossing A, 15 microliter natriumsilicaat en 60 microliterten van streptomycine.Ten slotte werden 30 microliters van C.calcitrans uit een vorige voorraadcultuur toegevoegd als entmateriaal. Raadpleeg tabel twee in het manuscript over supplement- en inentingsvolumes voor de andere algensoorten en cultuursoorten. Na inenting worden de voorraad en subculturen gehandhaafd in een couveuse op 17 graden Celsius met continue verlichting.Na ongeveer 10 dagen wordt de algengroei bevestigd doordat de kolven gekleurd worden. Wanneer dit gebeurt, verplaats de voorraad culturen op lange termijn opslag op vier graden Celsius voor maximaal een maand met behoud van de subcultuur in dezelfde incubator. Om een werkcultuur te creëren, voeg je de nodige supplementen toe aan 400 mils autogevlaveerd zeewater en inentuleren met 100 mils van de vorige subcultuur.Sluit de kolf af met een rubberen dop, steek een wegwerppipet van een miljoen in en verplaats ze naar een algenstation en bewaar ze op kamertemperatuur met een acht uur durende fotoperiode en constante beluier. Draai twee maal per dag met de hand algenculturen om aggregatie aan de onderkant van de kolf te voorkomen. Zodra de algenculturen zijn vastgesteld, verzamel veldmonsters op een lokale site.Giet een plankton net, en laat de kabeljauw einde te zinken een tot twee meter onder het oppervlak. Sleep het net met een snelheid van ongeveer 5 tot 1 meter per seconde. Blijf twee tot vijf minuten heen en weer slepen.De trektijd moet worden aangepast aan de overvloed ter plaatse. Na de sleep, voorzichtig til het net en langzaam de inhoud van de kabeljauw einde over te brengen naar een 500-mil, glazen fles. Vul de fles aan de rand om luchtbellen te voorkomen die stress kunnen veroorzaken aan de dieren tijdens het transport.In dit stadium kan de aanwezigheid van Oikopleura worden bevestigd door de monsterflessen tegen een donkere achtergrond te bekijken. Microscopische observatie is echter vereist voor identificatie op soortenniveau. Herhaal dit proces tot drie flessen van 500 mil zijn verzameld.Verzamel oppervlaktezeewater om zoutgehalte, temperatuur en chlorofylconcentratie vast te leggen met een CTD-profiler. Verzamel bovendien 10 tot 15 liter zeewater ter plaatse om de dieren te helpen acclimatiseren aan laboratoriumomstandigheden. Om de dieren te acclimatiseren, bereidt u een één-op-één verhouding van oppervlaktezeewater van de monstersite voor en gefilterd zeewater dat in het lab wordt onderhouden.Afhankelijk van de concentratie van het planktonmonster moet het uiteindelijke volume worden aangepast tot vijf tot 10 liter. Voeg het monster van 500 mil voorzichtig toe aan het bereide bekerglas. Met behulp van een peddel bevestigd aan een synchrone motor draaien op 15 RPM, houd het plankton in schorsing 's nachts.De volgende ochtend, controleer op de aanwezigheid van Oikopleura door het oog. Breng de dieren naar een petrischaaltje en observeer onder een donkere veldmicroscoop die 20 tot 40 keer tussen de vergroting ligt voor een positieve identificatie. Oikopleura worden gekenmerkt als kikkervisvormige dieren die hun staarten golven in een doorschijnend huis.Om O.dioica te bevestigen, zoek naar volledig volwassen mannetjes met gele geslachtskoeten of vrouwtjes met eieren. Als de dieren onvolwassen zijn, kijk dan voor de aanwezigheid van twee subchorale cellen op de distale helft van de staart. Deze zijn aanwezig in zowel volwassen als onvolwassen dieren.Zodra de soort is bevestigd, breng ze naar een nieuwe petrischaal. Herhaal dit proces tot 10 tot 20 individuen zijn bevestigd op soortenniveau. Als er geen O.dioica worden gevonden, houd de beker roeren voor een extra dag of twee.Kleine O.dioica die aanvankelijk niet waarneembaar waren, zullen blijven groeien en gemakkelijker te zien worden. Als er na een week geen verschijnt, verwijdert u het monster en probeert u opnieuw monsters te nemen. Om een monocultuur te vestigen, isoleer 120 O.dioica van een veldmonster in vijf liter gefilterd zeewater.De volgende ochtend, kijk voor volledig volwassen mannetjes geïdentificeerd door gele geslachtsgenoten en voor vrouwtjes met eieren die verschijnen als glinsterende, gouden bollen. Bereid een paaibeker door voorzichtig 15 mannetjes en 30 vrouwtjes met een vijf-mil, stompe pipet naar een beker met 2,5 liter gefilterd zeewater. Om fysieke stress tijdens de handmatige overdracht te minimaliseren, laat u de dieren langzaam los onder het oppervlak van het nieuwe zeewater.Laat geïsoleerde volwassenen op natuurlijke wijze paaien. Na het paaien kan succesvolle bevruchting worden bevestigd door vijf tot 10 mils zeewater uit de bodem van het paaibeker en het identificeren van eieren met decolletés onder een microscoop te extraheren. Op de eerste ochtend na het paaien, dag één, moet een nieuwe generatie jonge dieren met opgeblazen huizen in de beker verschijnen.Gebruik een 500-mil, handheld beker om dieren voorzichtig over te brengen naar een nieuw bekerglas met 7,5 liter vers, gefilterd zeewater. Giet langzaam de inhoud aan de oppervlakte om turbulentie en afschuifkrachten te minimaliseren. Breng op de tweede ochtend na het paaien, dag twee, handmatig 150 dieren over naar een nieuw bekerglas met vijf liter vers, gefilterd zeewater.Op de derde ochtend na het paaien, dag drie, breng je handmatig 120 dieren over naar een nieuw bekerglas met vijf liter vers, gefilterd zeewater. Tegen de vierde dag moeten seksueel volwassen, volwassen dieren aanwezig zijn. Verzamel 15 mannetjes en 30 vrouwtjes voor een nieuwe paaibeker met 2,5 liter gefilterd zeewater om de volgende generatie te starten.Dit proces wordt herhaald en gehandhaafd voor het leven van de cultuur. Om een monocultuur van O.dioica in stand te houden, wordt algenvoedsel dagelijks bereid uit werkculturen. De dieren worden drie keer per dag gevoerd.Bereid dagelijks voedsel door het meten van de absorptie van de werkcultuur met behulp van een spectrofotometer ingesteld op 660 nanometer. Absorptiewaarden, doel O.dioica cultuurvolumes en dierlijke volwassenheid worden in een voorbereide spreadsheet geplaatst op basis van een eerder bepaalde algengroeicurve om het exacte volume algen te berekenen dat nodig is voor het voeden van de dag. Pipette de berekende volumes in 50-mil buizen, en centrifuge op 5,000g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Langzaam giet af supernatant, en voorzichtig pipette op en neer om de pelleted algen resuspend. Vul de buizen aan hun oorspronkelijke volume met vers, gefilterd zeewater. Op basis van de dagelijkse algenvoeddiagram uit de spreadsheet, voer het opgegeven bedrag aan elk bekerglas om 9 uur per .m.12 p.m. en 17 p.m. Een geautomatiseerde doseerpomp kan worden ingesteld om de dieren te voeden op 5 p.m.in het weekend zonder de aanwezigheid van het personeel van de culturing. Na elke voeding, handhaven van de bereide algen voedsel op vier graden Celsius tot klaar om te worden gebruikt voor de volgende feed. O.dioica kan worden verzameld uit een haven door het zachte slepen van een gemodificeerd plankton net uitgerust met 100-micron mesh en een niet-filtering kabeljauw einde.De bemonstering tussen 2015 en 19 toonde seizoensgebonden variatie in de aanwezigheid van O.dioica in de havens van Okinawa. Oppervlakte zeewater temperatuur leek de aanwezigheid van de dieren beïnvloeden. O.dioica domineerde toen de oppervlakte zeewater temperatuur was 28 graden of hoger.O.dioica naast elkaar bestaan met Oikopleura longicauda bij temperaturen tussen de 24 en 27 graden. O.longicauda domineerde echter bij temperaturen onder de 23 graden. Veranderingen in het zoutgehalte correleerden niet met de overvloed aan O.dioica.De drie belangrijkste factoren voor het opzetten van stabiele O.dioica cultuursystemen zijn het handhaven van een hoge waterkwaliteit met een multi-step filtratiesysteem, het identificeren van een optimaal voedingsregime, bij voorkeur door het creëren van algen standaard curven, en de voorbereiding van paaibekers met voldoende aantallen mannen en vrouwen. Volgens het meegeleverde protocol is de levenscyclus van O.dioica vier dagen bij 23 graden. We hebben op betrouwbare wijze zes onafhankelijke populaties van O.dioica, die allemaal meer dan 20 generaties duurden.Tot slot kan het snel en kosteneffectief tot stand brengen van een stabiele cultuur van O.dioica. Met een goede opzet kan binnen een week een stabiele cultuur worden bereikt. In combinatie met zijn kleine genoom en snelle levenscyclus maakt dit O.dioica tot een krachtige chordate modelsoort.O.dioica kan worden onderhouden in zowel kunstmatig als natuurlijk zeewater. Langdurige opslag van algenvoedsel is mogelijk met behulp van vaste cultuur en cryopreservatie. Bovendien kan O.dioica sperma ook cryopreserved worden en langer dan een jaar levensvatbaar blijven.O.dioica blijft krachtige inzichten bieden in verschillende biologische gebieden. Een goed begrip van lokale seizoensgebondenheid, een nauwgezet cultuursysteem en een paar toegewijde individuen maken het mogelijk om effectieve cultuur met weinig inspanning tot stand te brengen.

Research

JoVE Journal

Environment

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Geïntegreerde Field Lysimetry en poriënwater bemonstering voor evaluatie van chemische Mobiliteit in de bodem en bestaande vegetatie

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Grondmonstername en isolatie van Entomopathogene Nematoden (Steinernematidae, Heterorhabditidea)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Clean monsterneming en analyse van de rivier en estuariene Waters voor Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

Modification and Application of a Leaf Blower-vac for Field Sampling of Arthropods

Wijziging en toepassing van een bladblazer-vac voor Field Sampling geleedpotigen

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Protocol voor microplastics bemonstering op het zeeoppervlak en Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Bemonstering bodems in een heterogene onderzoek uitzetten

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the ...

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Een nieuwe draagbare In Vitro blootstelling Cassette voor aërosol bemonstering

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Teelt van groene microalgen in Bubble kolom Photobioreactors en een kwantitatieve analyse voor neutrale lipiden

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri Uljanin 1884 for Experimental Studies

Teelt van de mariene pelagische Tunicate Dolioletta gegenbauri (uljanin 1884) voor experimentele studies

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

Sampling for Estimating Frankliniella Species Flower Thrips and Orius Species Predators in Field Experiments

Sampling for Estimating Frankliniella Species Flower Thrips and Orius Species Predators in Field Experiments

Bemonstering voor de raming van Frankliniella soorten bloem Thrips en Orius soorten roofdieren in veldexperimenten

The western flower thrips, Frankliniella occidentalis (Pergande), is a polyphagous pest that has been spread worldwide. The extensive use of insecticides ...