Name: streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica
Uploaded: 2020-06-16T15:00:00
Duration: 11 min 55 s
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Wir danken Garth Ilsley für seine Unterstützung beim Aufbau des Kultursystems. Wir würdigen die Beiträge von Ritsuko Suyama und Sylvain Guillot zu den Bemühungen um frühe Probenahme und Artenidentifizierung. Ein besonderer Dank gilt Hiroki Nishida, Takeshi Onuma und Tatsuya Omotezako für ihre großzügige Unterstützung und Beratung durchweg, einschließlich der Ersteinrichtung des lokalen Kultivierungssystems und des Teilens von Tieren und Mikroalgenkultur. Wir danken auch Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Caéestro und Alfonso Ferréndez-Roldén für den Austausch ihrer Expertise in den Bereichen Sampling und Kultivierung. Jai Denton, Charles Plessy und Jeffrey Jolly gaben unschätzbares Feedback zu dem Manuskript. Charlotte West formulierte eine verallgemeinerte Gleichung für die Algenberechnung. Abschließend danken wir OIST für die Finanzierung, Mary Collins und dem OIST Fieldwork Safety Committee für die Beratung zu sicheren Probenahmeverfahren, den Mitarbeitern der OIST-Maschinenwerkstatt für den Bau von Kultivierungs- und Probenahmegeräten und Koichi Toda für die Lieferung von Meerwasser.

Der Autor hat nichts zu erklären.

Um die Flexibilität bei der Etablierung der O. dioica-Kultur zu erleichtern, ist es wichtig, den natürlichen Lebensraum der Tiere zu verstehen. Saisonale Daten liefern Informationen über die Bereiche der physikalischen Parameter, die verwendet werden können, um Laborkultivierungsbedingungen zu leiten. Es hilft auch, saisonale Schwankungen in der Fülle von Tieren zu verstehen. In Okinawa wird O. dioica am zuverlässigsten von Juni bis Oktober gefunden. In der Bucht von Tokio erreicht die Bevölkerungszahl jedoch im Februar und41.Oktober ihren Höhepunkt. Obwohl die Kultivierung von O. dioica oft bei 20 °C oder niedriger27,28,29berichtet wird, zeigt Okinawan O. dioica ein besseres Überleben bei Temperaturen über 20 °C; dies könnte dadurch erklärt werden, dass die minimale Oberflächentemperatur des Meerwassers in Okinawa 20 °C beträgt (Abbildung 6). Die Fülle von O. dioica könnte auch durch Phytoplanktonblüten42 und RaubtierFülle43,44beeinflusst werden. Unabhängig davon, wo O. dioica gesammelt werden, maximiert das Verständnis der Saisonalität der lokalen Bevölkerung die Chance auf Probenahme und Kultivierung.
Angesichts der geeigneten Jahreszeit und Lage ist die Netzprobe eine effektive Möglichkeit, eine große Anzahl von Oikopleura mit minimalem Aufwand zu sammeln. Planktonnetze mit einer kleineren Maschenweite (60-70 m) können auch verwendet werden, um alle Stufen der Tiere zu sammeln. Vollreife Tiere sind selten im Netz zu finden, vielleicht aufgrund ihrer Fragilität am Ende des Lebenszyklus. Daher wird die Artenidentifikation, gefolgt von einer Probenahme, durch mikroskopische Beobachtung von subchordalen Zellen erreicht. Ältere Individuen erscheinen in der Regel ein oder zwei Tage nach der Probenahme, da die Tiere im Labor weiter wachsen. Obwohl die Netto-Probenahme effizient ist, können unter verschiedenen Umständen alternative Probenahmemethoden erforderlich sein. Zum Beispiel können Netzproben in der Nähe von städtischen Gebieten eine große Anzahl von Phytoplankton sammeln, was es schwierig macht, Oikopleurazu isolieren. In solchen Fällen wird eine einfache Eimerprobenahme zur Erfassung von Oberflächenmeerwasser oder Bootsproben aus Gebieten außerhalb des Hafens empfohlen. Die Ergebnisse zeigten, dass die allmähliche Veränderung des Salzgehalts aufgrund der aufeinanderfolgenden Regentage die Fülle von O. dioicanicht beeinflusste; Uferproben unmittelbar nach extremen Wetterereignissen wie tropischen Wirbelstürmen sollten jedoch vermieden werden. Diese Ereignisse verursachen plötzliche und drastische biogeochemische Veränderungen in einem geschützten Gewässer45,46. Der Regenwasserabfluss kann Schadstoffe, Sedimente und überschüssige Nährstoffe transportieren, die die Trübung erhöhen und die Wasserqualität senken47. Filter-Fütterung Plankton, wie Oikopleura, kann besonders anfällig für diese Veränderungen aufgrund ihrer Art der Fütterung und eingeschränkte Mobilität. In einem solchen Fall empfehlen wir, die Probenahme um einige Tage zu verschieben, bis sich die örtlichen Bedingungen wieder normalisieren.
Die Einführung eines mehrstufigen Filtersystems ist für die Erhaltung kleiner, filterfressender Organismen wie O. dioicaunerlässlich. Mit schlecht gefiltertem Meerwasser (z. B. einem 25-mm-Netz im vorherigen Kultursystem) war die Kultur vor allem im Sommer oft instabil, was möglicherweise auf die höhere Fülle an Phytoplankton zurückzuführen ist. Obwohl einige Phytoplankton sind vorteilhaft für O. dioica Wachstum, andere produzieren Biotoxine, die abnormale Entwicklung von O. dioica Embryonen verursachen können48. Darüber hinaus ist eine hohe Konzentration von Diatomen wie Chaetoceros spp. potenziell schädlich für das O. dioica Wachstum, da sie lange Setae besitzen können, die das Haus verstopfen und eine effiziente Fütterung verhindern können49. Wir beobachteten häufig Häuser von Kleintieren, die von C. calcitrans setae verstopft wurden; Daher füttern wir Jetzt C. calcitrans nur noch an Tiere an Tag 2 und älter (Tabelle 3).
Obwohl es hier kein Problem war, kann die kleine langfristige Kultivierung von O. dioica aufgrund eines genetischen Engpasses plötzliche Bevölkerungsrückgänge erleben; in solchen Fällenempfehlen die Beiden, alle 20 Generationen neue wilde Individuen in die Kultur einzuspeisen.
Das Oikopleura-Kultursystem ist flexibel. Innerhalb einer Woche kann eine stabile Kultur aufgebaut werden. Eine langfristige Kultivierung von O. dioica ist mit einem bescheidenen Budget mit nicht spezialisierter Ausrüstung möglich. Der tägliche Aufwand für die Wartung von 5-10 Bechern von Oikopleura ist in der Regel weniger als 2 Stunden mit 2 Personen. O. dioica kann auch in künstlichem Meerwasser gehalten werden, was für diejenigen, die keinen Zugang zu natürlichem Meerwasser haben, von Vorteil ist28. Langfristige Lagerung von Algennahrung ist mit Feststoffkultur und Kryokonservierungmöglich 29. Darüber hinaus kann O. dioica Sperma kryokonserviert werden, und lebensfähig bleiben für mehr als ein Jahr50. All diese Faktoren bedeuten, dass Kulturen leicht wiederhergestellt werden können. Schließlich, vergangenheitErfahrung mit versehentlicher Kultivierung von Pleurobrachia sp. könnte darauf hindeuten, dass das für Oikopleura entwickelte Kultivierungssystem potenziell auf eine breitere Gemeinschaft empfindlicher pelagischer Organismen ausgedehnt werden könnte.
O. dioica liefert weiterhin kraftvolle Einblicke in verschiedene biologische Felder. Ein Verständnis der lokalen Saisonalität, ein akribisches Kultursystem und ein paar engagierte Individuen ermöglichen es, mit wenig Aufwand eine effektive Kultur zu etablieren. Das Oikopleura-Kultursystem bietet die Basisressourcen, um eine breite Palette biologischer Bereiche in Bezug auf Ökologie, Entwicklung, Genomik und Evolution dieses einzigartigen Marinechorats zu untersuchen.

Modellorganismen haben bei der Behandlung vieler biologischer Fragen, einschließlich der Fragen im Zusammenhang mit Entwicklung, Genetik und Physiologie, eine entscheidende Rolle dabei geleistet. Darüber hinaus erleichtern zusätzliche Modellorganismen neue Entdeckungen und sind daher entscheidend, um ein besseres Verständnis der Natur zu erreichen1,2. Marine Zooplankton sind verschiedene Gruppen von Organismen, die eine wichtige Rolle in Ozean-Ökosystemespielen 3,4,5,6. Trotz ihrer Fülle und ökologischen Bedeutung sind gelatinöse Organismen wie planktonische Tunikaten in Plankton-Biodiversitätsstudien oft unterrepräsentiert, weil ihre Transparenz und Fragilität die Feldsammlung und -identifikation zu einer Herausforderung macht7,8. Angepasste Probenahmeverfahren und Laborkultivierung ermöglichen eine genauere Beobachtung der Tiere in vitro, was das Wissen in der Biologie der planktonischen Tunikaten9,10,11,12gefördert hat.
Larvaceans (Appendicularians) sind eine Klasse von freischwimmenden Meerestunika, die rund 70 beschriebene Arten weltweitumfassen 8,13. Da sie eine der am häufigsten vorkommenden Gruppen innerhalb der Zooplanktongemeinschaften14,15,16,17sind, stellen Larven eine primäre Nahrungsquelle für größere planktonische Organismen wie Fischlarven18,19dar. Im Gegensatz zu Ascidians behalten die sessile Tunikaten-Larvaceane eine Kaulquappen-ähnliche Morphologie und bleiben planktonisch ihr ganzes Leben lang20. Jedes Tier lebt in einer selbst gebauten, komplizierten Filter-Fütterungsstruktur, die als Haus bekannt ist. Sie akkumulieren Partikel in ihren Häusern, indem sie Wasserströmungen durch die wellige Bewegung ihrer Schwänze erzeugen21. Verstopfte Häuser werden den ganzen Tag über entsorgt, von denen einige Kohlenstoffaggregate bilden und schließlich auf den Meeresboden sinken22; Daher spielen Larven eine wichtige Rolle beim globalen Kohlenstofffluss23. Die meisten Arten leben berichten, in der pelagischen Zone innerhalb der oberen 100 m der Wassersäule13zu leben; jedoch ist der riesige Larven Bathochordaeus bekannt, die Tiefen von 300 m24bewohnen. Eine Studie über Bathochordaeus in Monterey Bay, Kalifornien, ergab, dass die Tiere auch als biologischer Vektor von Mikroplastik dienen, was auf eine potenzielle Bedeutung für das Verständnis der Rolle von Appendicularians beim vertikalen Transport und vertrieb von Mikroplastik in den Ozeanenhindeutet 25.
Oikopleura dioica, eine Larvenart, hat in den letzten Jahren aufgrund mehrerer bemerkenswerter Eigenschaften als Modellorganismus auf sich aufmerksam gemacht. Es wird häufig in den Weltmeeren berichtet. Es ist besonders reichlich inKüstengewässern 26, die einfache Probenahme von der Küste ermöglicht. Langfristige, stabile Kultivierung ist sowohl mit natürlichem als auch künstlichem Meerwasser27,28,29möglich. Die temperaturabhängigen Erzeugungszeiten sind unter Laborbedingungen bis zu 4-9 Tage. Es hat eine hohe Fruchtbarkeit mit jedem Weibchen in der Lage, >300 Eier das ganze Jahr über zu produzieren. Als Tunikatnimmt es eine wichtige phylogenetische Position für das Verständnis der Chordate-Evolution30,31. Mit 70 Mb hat O. dioica das kleinste identifizierte Genom unter allen Chordaten32. Unter den Larvaceanen ist O. dioica die einzige bisher beschriebene nicht-hermaphroditische Art33.
Die erste erfolgreiche O. dioica Kultur mit im Labor angebauten Mikroalgen berichtete Paffenhöfer34. Das ursprüngliche Kulturprotokoll mit Synchronmotoren und Paddeln wurde von Fenaux und Gorsky35 entwickelt und später von mehreren Laboratorien übernommen. In jüngerer Zeit berichteten Fujii et al.36 über die Kultivierung von O. dioica im künstlichen Meerwasser, ein robustes Kultursystem und eine Feldsammlung wurden von Bouquet et al.27 beschrieben und ein optimiertes Protokoll für ein vereinfachtes, erschwingliches System wurde von Marti-Solans et al.29berichtet. Neben dem traditionellen Oikopleura-Kultursystem hat ein neu gemeldetes Design mit einem Doppelrohr-Aufzuchttank auch das Potenzial, Oikopleura sp zu kultizieren. 37.
Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Initiierung einer O. dioica Monokultur auf der Grundlage einer Kombination von Protokollen, die von großen Oikopleura-Forschungsgruppen am Sars International Centre for Marine Molecular Biology27, der Universität Barcelona29, der Osaka University28und unseren eigenen Beobachtungen entwickelt wurden. In zuvor veröffentlichten Kulturprotokollen wurden detaillierte Informationen über die Zusammensetzung von Algenmedien, Küstenprobentechniken und Oikopleura-Identifikation nur grob beschrieben, was eine Menge Unklarheiten hinterließ. Hier haben wir mit Hilfe visueller Informationen im Videoprotokoll alle wichtigen Informationen zusammengestellt, die notwendig sind, um eine O. dioica-Kultur von Grund auf auf einfache, schrittweise Weise aufzubauen. Wir beschreiben, wie man O. dioica von einer anderen häufig gemeldeten Art, O. longicauda, unterscheidet, die einer der anspruchsvollsten Schritte ist. Obwohl die bestehenden Kultursysteme für den weltweiten Anbau von O. dioica anwendbar sind, unterstreichen wir die Bedeutung der Protokollanpassung auf der Grundlage lokaler Umweltbedingungen. Die präsentierten Informationen kombinieren weit veröffentlichte Daten sowie Erfahrungserfahrungen. Das aktuelle Protokoll ist ideal für Forscher geeignet, die eine Kultur von Grund auf neu aufbauen möchten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2764-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alluminum pulley</td>
			<td>Rainbow Products</td>
			<td>10604-10607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalamin (B12)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-03682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>039-04412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium edetate hydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon wrench</td>
			<td>Anex</td>
			<td>No.6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>091-00872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jebao programmable auto dosing pump</td>
			<td>Jebao</td>
			<td>DP-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet pump</td>
			<td>REI-SEA</td>
			<td>RMD-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>134-15302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene wound cartridge filter</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>TCW-10N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-5N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-1N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwless terminal block</td>
			<td>SATO PARTS</td>
			<td>SL4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple plankton net</td>
			<td>RIGO, Japan</td>
			<td>5512-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metasilicate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>307815-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-02545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchronous electric motor</td>
			<td>Servo</td>
			<td>D5N6Z15M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamin hydrochloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV sterilizer</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>UVF-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194858</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica

Oikopleura dioica ist ein planktonisches Chordate mit außergewöhnlicher Filter-Fütterungsfähigkeit, schneller Erzeugungszeit, konservierter früher Entwicklung und einem kompakten Genom. Aus diesen Gründen gilt er als nützlicher Modellorganismus für marine ökologische Studien, evolutionäre Entwicklungsbiologie und Genomik. Da die Forschung oft eine stetige Versorgung mit tierischen Ressourcen erfordert, ist es sinnvoll, ein zuverlässiges, wartungsarmes Kultursystem aufzubauen. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Etablierung einer O. dioica-Kultur. Wir beschreiben, wie potenzielle Probenahmestellen, Sammelmethoden, Zieltieridentifikation und die Einrichtung des Kultivierungssystems ausgewählt werden. Wir beraten Sie bei der Fehlerbehebung auf der Grundlage unserer eigenen Erfahrungen. Wir heben auch kritische Faktoren hervor, die dazu beitragen, ein robustes Kultursystem aufrechtzuerhalten. Obwohl das hier bereitgestellte Kulturprotokoll für O. dioicaoptimiert ist, hoffen wir, dass unsere Probenahmetechnik und unser Kulturaufbau neue Ideen für die Aufrechterhaltung anderer fragiler pelagischer Wirbellose inspirieren werden.

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Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica ist ein Tunika-Modellorganismus in verschiedenen Bereichen der Biologie. Wir beschreiben Probenahmemethoden, Artenidentifikation, Kultivierungsaufbau und Kultivierungsprotokolle für die Tiere und Algenfutter. Wir heben Schlüsselfaktoren hervor, die zur Stärkung des Kultursystems beigetragen haben, und diskutieren die möglichen Probleme und Lösungen.

Optimierte Probenahme und Kultivierung des pelagischen Kosmopolitischen Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

Dieses Protokoll zeigt visuell, wie man ein langfristiges, zuverlässiges Kultursystem für das marine pelagische Tunika Oikopleura dioica etabliert. Das Oikopleura-Kultursystem stellt die Basisressourcen zur Verfügung, um eine breite Palette biologischer Bereiche in Bezug auf Ökologie, Entwicklung, Genomik und Evolution zu untersuchen. Diese Art hat einen kurzen Lebenszyklus, hohe Fruchtbarkeit, und es kann leicht von der Küste gesammelt werden, so dass es ein ausgezeichneter Modellorganismus.Obwohl dieses Protokoll für O.dioica optimiert ist, hoffen wir, dass es auf andere planktonische Organismen angewendet werden kann. Um zu beginnen, initiieren Algennahrung, um Oikopleura Kultur zu erhalten, beginnend mit autoklavieren gefiltertem Meerwasser. Um eine Bestandskultur von Chaetoceros calcitrans zu initiieren, wurden 60 meilenlanges autoklaviertes Meerwasser mit folgenden:30 Mikroliter Vitaminen, 30 Mikroliter Lösung A, 15 Mikroliter Natriumsilikat und 60 Mikroliter Streptomycin ergänzt.Schließlich wurden 30 Mikroliter C.calcitrans aus einer früheren Bestandskultur als Inoculant hinzugefügt. Siehe Tabelle 2 im Manuskript über Ergänzungs- und Impfvolumina für die anderen Algenarten und Kulturarten. Nach der Impfung werden der Bestand und die Subkulturen in einem Inkubator bei 17 Grad Celsius mit kontinuierlicher Beleuchtung gepflegt.Nach ca. 10 Tagen wird das Algenwachstum durch die Farbgefärbten der Kolben bestätigt. Wenn dies geschieht, verschieben Sie die Bestandskulturen bis zu einem Monat lang bei vier Grad Celsius in die Langzeitlagerung, während die Subkultur im selben Brutkasten erhalten bleibt. Um eine Arbeitskultur zu schaffen, fügen Sie notwendige Ergänzungen zu 400 mils autoklaviertes Meerwasser hinzu und impfen Sie mit 100 mils der vorherigen Subkultur.Versiegeln Sie den Kolben mit einer Gummikappe, legen Sie eine Einwegpipette ein, und bewegen Sie sie zu einer Algenstation und halten Sie sie bei Raumtemperatur mit einer achtstündigen Fotoperiode und konstanter Belüftung. Zweimal täglich algenllassende Kulturen manuell wirbeln, um eine Aggregation am Boden des Kolbens zu verhindern. Sobald die Algenkulturen etabliert sind, sammeln Sie Feldproben an einem lokalen Standort.Gießen Sie ein Planktonnetz, und lassen Sie das Kabeljau Ende ein bis zwei Meter unter der Oberfläche sinken. Schleppen Sie das Netz mit einer Geschwindigkeit von etwa 5 bis 1 Meter pro Sekunde. Fahren Sie zwischen zwei und fünf Minuten hin und her.Die Abschleppzeit sollte entsprechend dem Planktonreichtum vor Ort angepasst werden. Nach dem Abschleppen vorsichtig das Netz herausheben und den Inhalt des Kabeljaus langsam in eine 500-Meilen-Glasflasche übertragen. Füllen Sie die Flasche bis zum Rand, um Luftblasen zu vermeiden, die stressen für die Tiere während des Transports verursachen könnten.In diesem Stadium kann das Vorhandensein von Oikopleura durch die Betrachtung der Probenflaschen vor einem dunklen Hintergrund bestätigt werden. Für die Identifizierung auf Artenebene ist jedoch eine mikroskopische Beobachtung erforderlich. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis drei 500-Meilen-Flaschen gesammelt wurden.Sammeln Sie Oberflächenmeerwasser, um Salzgehalt, Temperatur und Chlorophyllkonzentration mit einem CTD-Profiler aufzuzeichnen. Sammeln Sie zusätzlich 10 bis 15 Liter Meerwasser vor Ort, um die Tiere an Laborbedingungen zu gewöhnen. Um die Tiere zu akklimatisieren, bereiten Sie ein 1:1-Verhältnis von Oberflächen-Meerwasser aus dem Probengelände und gefiltertem Meerwasser vor, das im Labor gehalten wird.Das Endvolumen sollte je nach Konzentration der Planktonprobe auf fünf bis zehn Liter eingestellt werden. Die 500-Mil-Probe vorsichtig in den vorbereiteten Becher geben. Mit einem Paddel, das an einem Synchronmotor befestigt ist, der sich bei 15 Umdrehungen pro Minute dreht, halten Sie das Plankton über Nacht in Dersuspension.Überprüfen Sie am nächsten Morgen die Anwesenheit von Oikopleura mit dem Auge. Übertragen Sie die Tiere auf eine Petrischale und beobachten Sie unter einem Dunkelfeldmikroskop, das 20 bis 40 Mal zwischen der Vergrößerung eingestellt ist, um eine positive Identifizierung zu erhalten. Oikopleura sind als kaulenförmige Tiere gekennzeichnet, die ihre Schwänze in einem durchscheinenden Haus wellig ieren.Um O.dioica zu bestätigen, suchen Sie nach vollreifen Männchen mit gelben Gonaden oder Weibchen mit Eiern. Wenn die Tiere unreif sind, achten Sie auf das Vorhandensein von zwei subchordalen Zellen an der distalen Hälfte des Schwanzes. Diese sind sowohl bei reifen als auch bei unreifen Tieren vorhanden.Sobald die Art bestätigt ist, übertragen Sie sie auf eine neue Petrischale. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis 10 bis 20 Individuen auf Artenebene bestätigt wurden. Wenn keine O.dioica gefunden werden, halten Sie den Becher für ein oder zwei Tage rühren.Kleine O.dioica, die anfangs nicht beobachtbar waren, werden weiter wachsen und leichter zu sehen sein. Wenn nach einer Woche keine sampeln, verwerfen Sie die Probe, und versuchen Sie erneut, die Probezuführen durchzuführen. Um eine Monokultur zu etablieren, isolieren Sie 120 O.dioica aus einer Feldprobe in fünf Litergefiltertem Meerwasser.Achten Sie am nächsten Morgen auf vollreife Männchen, die von gelben Gonaden identifiziert werden, und nach Weibchen mit Eiern, die als schimmernde, goldene Kugeln erscheinen. Bereiten Sie einen Laichbecher vor, indem Sie 15 Männchen und 30 Weibchen mit einer fünf-Mil- und stumpfen Pipette sanft in einen Becher mit 2,5 Litergefiltertem Meerwasser übertragen. Um körperliche Belastungen während des manuellen Transfers zu minimieren, lassen Sie die Tiere langsam unter der Oberfläche des neuen Meerwassers frei.Lassen Sie isolierte Erwachsene auf natürliche Weise laichen. Nach dem Laichen kann eine erfolgreiche Befruchtung bestätigt werden, indem fünf bis 10 Meilen Meerwasser vom Grund des Laichbechers extrahiert und Eier mit Spaltungen unter dem Mikroskop identifiziert werden. Am ersten Morgen nach dem Laichen, dem ersten Tag, sollte eine neue Generation von Jungtieren mit aufgeblasenen Häusern im Becher erscheinen.Verwenden Sie einen 500-Meilen-Handbecher, um Tiere sanft in ein neues Becherglas mit 7,5 Liter frischem, gefiltertem Meerwasser zu bringen. Gießen Sie den Inhalt langsam an die Oberfläche, um Turbulenzen und Scherkräfte zu minimieren. Am zweiten Morgen nach dem Laichen, Tag zwei, bringen Sie 150 Tiere manuell in ein neues Becherglas mit fünf Literfrischem, gefiltertem Meerwasser.Am dritten Morgen nach dem Laichen, Tag drei, überführen Sie 120 Tiere manuell in ein neues Becherglas mit fünf Litern frischem, gefiltertem Meerwasser. Bis zum vierten Tag sollten geschlechtsreife, erwachsene Tiere anwesend sein. Sammeln Sie 15 Männchen und 30 Weibchen für einen neuen Laichbecher mit 2,5 Litergefiltertem Meerwasser, um die nächste Generation zu initiieren.Dieser Prozess wird wiederholt und für das Leben der Kultur aufrechterhalten. Um eine Monokultur von O.dioica aufrechtzuerhalten, werden Algennahrung täglich aus Arbeitskulturen zubereitet. Die Tiere werden dreimal täglich gefüttert.Bereiten Sie die tägliche Nahrung vor, indem Sie die Absorption der Arbeitskultur mit einem Spektralphotometer auf 660 Nanometer messen. Absorptionswerte, Ziel-O.dioica-Kulturvolumen und tierische Reife werden in eine vorbereitete Tabelle eingefügt, die auf einer zuvor ermittelten Algenwachstumskurve basiert, um das genaue Algenvolumen zu berechnen, das für die Fütterung des Tages erforderlich ist. Die berechneten Volumina in 50-Meilen-Rohre und Zentrifuge bei 5 000g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zerführen.Langsam überstand gießen und sorgfältig Pipette auf und ab gießen, um die pelletierten Algen wieder aufzuhängen. Füllen Sie die Rohre auf ihr ursprüngliches Volumen mit frischem, gefiltertem Meerwasser. Basierend auf dem täglichen Algenfütterungsdiagramm aus der Tabelle, füttern Sie die angegebene Menge zu jedem Becher bei 9 a.m.12 .m und 17.m. Eine automatische Dosierpumpe kann eingestellt werden, um die Tiere mit 5 p.m zu füttern.an Wochenenden ohne das Vorhandensein von Kultivierungspersonal. Nach jeder Fütterung die zubereitete Algennahrung bei vier Grad Celsius aufbewahren, bis sie für das nächste Futter verwendet werden kann. O.dioica kann aus einem Hafen durch das sanfte Abschleppen eines modifizierten Planktonnetzes mit 100-Mikron-Netz und einem nicht filternden Kabeljau-Ende gesammelt werden.Die Probenahme zwischen 2015 und 19 zeigte saisonale Schwankungen in Anwesenheit von O.dioica in den Häfen von Okinawa. Die Oberflächentemperatur des Meerwassers schien die Anwesenheit der Tiere zu beeinflussen. O.dioica dominierte, wenn die Oberflächentemperatur des Meerwassers 28 Grad oder höher war.O.dioica koexistierte mit Oikopleura longicauda bei Temperaturen zwischen 24 und 27 Grad. Allerdings dominierte O.longicauda bei Temperaturen unter 23 Grad. Veränderungen des Salzgehalts korrelierten nicht mit der Fülle von O.dioica.Die drei wichtigsten Faktoren für die Etablierung stabiler O.dioica-Kultursysteme sind die Aufrechterhaltung einer hohen Wasserqualität mit einem mehrstufigen Filtersystem, die Identifizierung eines optimalen Fütterungssystems, vorzugsweise durch die Erstellung von Algenstandardkurven, und die Vorbereitung von Laichbechern mit einer ausreichenden Anzahl von Männchen und Weibchen. Nach dem bereitgestellten Protokoll beträgt der Lebenszyklus von O.dioica vier Tage bei 23 Grad. Wir haben zuverlässig sechs unabhängige Populationen von O.dioica etabliert, die alle mehr als 20 Generationen dauerten.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Etablierung einer stabilen Kultur von O.dioica schnell und kostengünstig erfolgen kann. Mit einem richtigen Setup kann innerhalb einer Woche eine stabile Kultur erreicht werden. In Verbindung mit seinem kleinen Genom und seinem schnellen Lebenszyklus macht dies O.dioica zu einer leistungsstarken Chordatenmodellart.O.dioica kann sowohl in künstlichem als auch in natürlichem Meerwasser gehalten werden. Langfristige Lagerung von Algennahrung ist mit fester Kultur und Kryokonservierung möglich. Darüber hinaus kann O.dioica Sperma auch kryokonserviert werden und lebensfähig für mehr als ein Jahr bleiben.O.dioica bietet weiterhin kraftvolle Einblicke in verschiedene biologische Felder. Ein Verständnis der lokalen Saisonalität, ein akribisches Kultursystem und ein paar engagierte Individuen ermöglichen es, mit wenig Aufwand eine effektive Kultur zu etablieren.

Research

JoVE Journal

Environment

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Integrierte Feld Lysimetrie und Porenwasserprobennahme für die Bewertung von Chemical Mobilität in Böden und Vegetation Gegründet

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Forschung

Umwelt

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

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Bodenproben und Isolierung von Nematoden (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

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