Name: streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica
Uploaded: 2020-06-16T15:00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica at JoVE.com

אנו אסירי תודה לגארת ' אילסלי על תמיכתו בהקמת מערכת התרבות. אנו מכירים את התרומות של ריצוקו סואיאמה ושל סילביין Guillot למאמצי הזיהוי המוקדמים של הדגימה והמינים. תודות מיוחדות הן בשל הירוקי נישידה, טאקשי ונאמה, וטאסואיה אוטקזאנו לתמיכה והדרכה נדיבות לאורך כל הדרך, כולל הקמתה הראשונית של מערכת הקולטיורינג המקומית ושיתוף בעלי חיים ותרבות מיקרואליגל. כמו כן, אנו מודים לדניאל כרורד, ז'אן-מארי זר, אן אג'יורד, כריסטיאן קאניטרו, ואלפונסו פרנדז-רולדן על שיתוף המומחיות שלהם בדיגום ובתפירה. ג'יי דנטון, צ'רלס פלסי, וג ג'ולי. סיפקו משוב לא יסולא בפז בכתב היד שרלוט ווסט ניסח משוואה כללית לחישוב פריחת אצות. בסופו של דבר, אנו מודים לווייס על מימון, מרי קולינס וועדת הבטיחות בעבודת השטח של העובדים לקבלת ייעוץ בנוגע להליכי דיגום בטוחים, הצוות של מכונת הקפה-מכונה לבניית הציוד הפולחני והדיגום, וקואיצ'י טודה בגין אספקת מי-ים.

. לסופר אין מה להצהיר

כדי להקל על הגמישות בהקמת תרבות O ' דיוקה , חשוב להבין את הסביבה הטבעית של בעלי החיים. נתונים עונתיים מספקים מידע על טווחים של פרמטרים פיזיים, אשר ניתן להשתמש כדי להנחות את התנאים culturing מעבדה. היא גם מסייעת להבנת תנודות עונתיות בשפע של בעלי חיים. באוקינווה, O. דיואיקה נמצא באופן האמין ביותר מיוני עד אוקטובר. עם זאת, במפרץ טוקיו, אוכלוסיות שיא בפברואר ובאוקטובר41. למרות שהקולטיורינג של או. דיואיקה מדווחים לעתים קרובות ב-20 מעלותצלזיוס או27התחתונות,28,29, אוקינאווה O. דיואיקה מראה הישרדות טובה יותר בטמפרטורות מעל 20 ° c; זה יכול להיות מוסבר על ידי העובדה את הטמפרטורה מינימום מי ים באוקינווה הוא ~ 20 ° צ' (איור 6). השפע של O. דיואיקה עשוי להיות מושפע גם על ידי פיטופלנקטון פורח42 ו טורף שפע43,44. ללא קשר למקום שבו נאספים O. דיוצה , הבנת העונתיות של האוכלוסיות המקומיות מגדילה את הסיכוי להצלחה בדיגום והצלחה.
בהינתן העונה והמיקום המתאימים, הדגימה הנטו היא דרך יעילה לאסוף מספר גדול של אויקופאורה עם מאמץ מינימלי. רשתות פלנקטון עם גודל שינוי קטן יותר (60-70 μm) עשוי לשמש גם כדי לאסוף את כל שלבי החיות. חיות בוגרות לחלוטין מצויים ברשת, אולי בשל שבריתם בסוף מחזור החיים. לכן, זיהוי המינים ולאחריו דגימה מושגת על ידי התבוננות מיקרוסקופית של תאים subchordal. אנשים מבוגרים בדרך כלל מופיעים יומיים או יומיים לאחר הדגימה כבעלי חיים ממשיכים לצמוח במעבדה. למרות שדגימה נטו יעילה, שיטות דגימה חלופיות עשויות להיות נחוצות בנסיבות שונות. לדוגמה, דגימה נטו ליד אזורים עירוניים יכולה לאסוף מספר רב של פיטופלנקטון, מה שמקשה על הבידוד של אויקופורה. במקרים כאלה, מדגם דלי פשוט לאיסוף מי ים או דגימת סירה מאזורים שמעבר לנמל מומלצים. התוצאות הראו כי השינוי ההדרגתי במליחות עקב ימי גשם רצופים לא השפיע על השפע של O. דיואיקה; עם זאת, החוף דגימה מיד לאחר אירועי מזג אוויר קיצוניים כגון ציקלונים טרופיים צריך להימנע. אירועים אלה גורמים שינויים ביוגיאוכימיים פתאומי ודרסטי בגוף מוגן של מים45,46. מי שנגר הסער עשוי לשאת מזהמים, משקעים וחומרים מזינים עודפים, המגבירים את העכירות ואת איכות המים הנמוכה47. פלנקטון של האכלה מסננים, כגון אויקופלירה, עשויים להיות רגישים במיוחד לשינויים אלה עקב מצב של האכלה וניידות מוגבלת. בנסיבות כאלה, אנו ממליצים לדחות את הדגימה לכמה ימים עד שהתנאים המקומיים יחזרו למסלולם.
המבוא של מערכת סינון מרובת שלבים חיוני לשמור על אורגניזמים קטנים, האכלה מסננים כגון O. דיואיקה. באמצעות מי ים מסוננים למדי (למשל, a 25 יקרומטר רשת במערכת התרבות הקודמת), התרבות היתה לעתים קרובות לא יציבה במיוחד במהלך הקיץ, בגלל השפע הגבוה של פיטופלנקטון. למרות שחלק מהפיטופלנקטון מועילים לצמיחה של o. דיוקה , אחרים מייצרים ביוטוקסינים שעלולים לגרום להתפתחות חריגה של עוברי O. דיוקה 48. בנוסף, ריכוז גבוה של אלהלמה כגון chaetoceros spp. הם עלולים להזיק O. דיואיקה צמיחה כפי שהם יכולים להחזיק setae ארוכה אשר יכול לסתום את הבית ולמנוע האכלה יעילה49. לעתים קרובות הבחנו בבתים של בעלי חיים קטנים שסתומים על ידי C. calcitrans setae; לכן, אנו מאכילים כעת את C. calcitrans רק לבעלי חיים ביום 2 ומעלה (שולחן 3).
למרות שזאת לא היתה בעיה, לאורך זמן קטן לטווח הארוך של O. דיוניקה יכול לחוות טיפות פתאומיות בגודל האוכלוסייה בגלל צוואר בקבוק גנטי; במקרים כאלה, מרטינו-סולאנים ואח '29 ממליצים להוסיף אנשים פראיים חדשים לתרבות כל 20 דורות.
מערכת התרבות של אויקופורה היא גמישה. ניתן להקים תרבות יציבה תוך שבוע. מגוון לטווח ארוך של O. הינו אפשרי בתקציב צנוע עם ציוד לא מומחה. המאמץ היומיומי הנדרש לתחזוקת 5-10 הספלים של אויקופורה הוא בדרך כלל פחות מ 2 שעות עם 2 אנשים. כמו כן ניתן לשמור על הצמח במי ים מלאכותיים, שיועיל לאלה ללא גישה למי ים טבעיים28. אחסון לטווח ארוך של מזון פריחת אצות אפשרי באמצעות התרבות המוצק ו הקריוגנית29. כמו-כן, ניתן להוריד את הזרע בזרעים של או, ולהישאר מסוגלים ליותר משנה50. כל הגורמים הללו מתכוונים כי התרבויות ניתן להקים מחדש בקלות. בסופו של דבר, ניסיון העבר עם מקרי בשוגג של פלאורורכיה sp. עשוי להציע כי מערכת culturing שפותחה עבור אויקופורה יכול להיות מורחב לקהילה רחבה יותר של אורגניזמים הפלחיים שבירים.
O. דיוקה ממשיכה לספק תובנות חזקות לתחומים ביולוגיים שונים. הבנה של העונתיות המקומית, מערכת התרבות הדקדקנית, ומספר אנשים מסורים מאפשרים לתרבות יעילה להיות מבוסס עם מעט מאמץ. מערכת התרבות אויקופורה מספקת את המשאבים הבסיסיים לחקור מגוון רחב של שדות ביולוגיים הנוגעים לאקולוגיה, פיתוח, גנומיקה והתפתחות של הכאודייט הימי הייחודי הזה.

אורגניזמים מודל היו אינסטרומנטלי בטיפול בשאלות ביולוגיות רבות כולל אלה הנוגעים פיתוח, גנטיקה, ופיזיולוגיה. יתר על כן, אורגניזמים נוספים מודל להקל על גילויים חדשים ולכן הם חיוניים כדי להשיג הבנה גדולה יותר של הטבע1,2. זואופלנקטון ימיים הם קבוצות מגוונות של אורגניזמים לשחק תפקיד חשוב באוקיינוס האקולוגית3,4,5,6. למרות השפע והחשיבות האקולוגית שלהם, אורגניזמים של ז'לטין כגון מינהור פלנקטון הם לעתים קרובות תחת מיוצגים במחקרים פלנקטון ביולוגי משום שקיפות שלהם שברישלהם להפוך את אוסף השדה ואת הזיהוי מאתגרת7,8. טכניקות דגימה מותאם ומעבדה לאפשר התבוננות מקרוב של בעלי החיים בתוך מבחנה, אשר הפכה את הידע בביולוגיה של מינהור פלנקטון9,10,11,12.
לאראמיאות (נספחים) הם מחלקה של שחייה ימית ללא תשלום הכוללת כ-70 מינים שתוארו ברחבי העולם8,13. כפי שהם אחת הקבוצות הנפוצות ביותר בתוך זואופלנקטון קהילות14,15,16,17, לאראמיאות מייצגים מקור מזון עיקרי לאורגניזמים גדולים פלנקטון כגון הזחלים דגים18,19. בניגוד לבני-הזוג-מורפולוגיה, שומרות על המבנה של ראשן, ונשארים מפלקוניים לאורך כל חייהם20. כל חיה מתגוררת בתוך מבנה מורכב, הניזון ממסננים, הידוע כבית. הם מצטברים חלקיקים בבתיהם על ידי יצירת זרמי מים דרך התנועה גלית של זנבות שלהם21. בתים סתומים נמחקים לאורך כל היום, שחלקם יוצרים אגרגטים פחמן ובסופו של דבר לשקוע אל קרקעית הים22; כך, לאראמיאות לשחק תפקיד מרכזי השטף פחמן גלובלי23. רוב המינים מדווחים לחיות באזור פלזה בתוך 100 העליון של העמודה המים13; עם זאת, הענק הגדול הבאוורצ מכונה לאכלס את מעמקי 300 m24. מחקר על האמבטיה במונטריי ביי, קליפורניה חשפה כי בעלי החיים משמשים גם וקטור ביולוגי של microplastics, מציע חשיבות פוטנציאלית בהבנת התפקיד של נספחים בתחבורה האנכית והפצה של microplastics באוקיינוסים25.
בשנים האחרונות כאורגניזם מודל,מושך את תשומת הלב בשנה האחרונה למודל בגלל כמה מאפיינים יוצאי דופן. הוא מדווח בדרך כלל ברחבי האוקיינוסים בעולם. הוא בשפע במים החוף26, אשר מאפשר דגימה קלה מן החוף. לטווח ארוך, מעגלי יציבה אפשרי עם מי-ים טבעיים ומלאכותיים27,28,29. זמני הייצור התלויים בטמפרטורה קצרים כמו 4-9 ימים בתנאי מעבדה. היא בעלת פוריות גבוהה עם כל נקבה המסוגלת לייצר > 300 ביצים לאורך כל השנה. כמו tunicate, זה תופס עמדה פילוגנטי חשובה להבנת אבולוציה מיתרניים30,31. ב 70 מגה, O. דיואיקה יש את הגנום הקטן ביותר שזוהו בין כל chordates32. בקרב לאראמואים, או. דיואיקה הינו המינים היחידים שאינם מהדיכודסטיים עד כה33.
התרבות הראשונה בעלת מיקרואצות מPaffenhöfer במעבדה, דווחה על ידי ה- 34. פרוטוקול התרבות המקורי באמצעות מנועים סינכרוניים ומשוטים פותחה על ידי Fenaux ו גורסקי35 ומאוחר יותר אומצה על ידי מעבדות מרובות. לאחרונה, Fujii et al.36 דיווח O. דו כאניקה בתוך מי ים מלאכותיים, מערכת תרבות חזקה ואוסף השדה תוארו על ידי זר והפרוטוקול ממוטב עבור מערכת פשוטה, במחיר סביר דיווחו על ידי מארטי-solansואח ' 29. מלבד מערכת התרבות המסורתית אויקוקולורה , עיצוב חדש שדווחו עם מיכל גידול כפול של שפופרת יש גם את הפוטנציאל לתרבות אויקופליורה sp. 37.
אנו מציגים פרוטוקול מפורט לייזום מונואולית O. הדו המבוססת על שילוב של פרוטוקולים שפותחו על ידי קבוצות מחקר של אויקויורה העיקרי בבית הסארס הבינלאומי לביולוגיה מולקולרית של ימית27, אוניברסיטת ברצלונה29, אוניברסיטת אוסקה28, ותצפיות שלנו. בפרוטוקולי התרבות שפורסמו בעבר, מידע מפורט על ההרכב של פריחת אצות מדיה, שיטות דיגום החוף, וזיהוי אויקופליורה היו רק מתוארים בערך, השארת הרבה בהירות. כאן, בעזרת מידע חזותי בפרוטוקול וידאו, הרכבנו את כל המידע הקריטי הדרוש כדי להקים תרבות O. דיוקה מהיסוד באופן פשוט, צעד אחר צעד. אנו מתארים כיצד להבדיל o. דיואיקה ממינים אחרים שבדרך כלל דיווחו, O. longicauda, שהוא אחד השלבים המאתגרים ביותר. למרות שמערכות התרבות הקיימות חלות על הטיפוח של O. דיוקה ברחבי העולם, אנו מדגישים את חשיבות התאמת הפרוטוקולים המבוססת על תנאים סביבתיים מקומיים. המידע המוצג משלב נתונים שפורסמו באופן נרחב וכן ידע שהושג באמצעות התנסות. הפרוטוקול הנוכחי מתאים באופן אידיאלי לחוקרים המעוניינים להקים תרבות מבראשית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2764-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alluminum pulley</td>
			<td>Rainbow Products</td>
			<td>10604-10607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalamin (B12)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-03682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>039-04412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium edetate hydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon wrench</td>
			<td>Anex</td>
			<td>No.6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>091-00872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jebao programmable auto dosing pump</td>
			<td>Jebao</td>
			<td>DP-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet pump</td>
			<td>REI-SEA</td>
			<td>RMD-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>134-15302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene wound cartridge filter</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>TCW-10N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-5N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-1N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwless terminal block</td>
			<td>SATO PARTS</td>
			<td>SL4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple plankton net</td>
			<td>RIGO, Japan</td>
			<td>5512-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metasilicate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>307815-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-02545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchronous electric motor</td>
			<td>Servo</td>
			<td>D5N6Z15M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamin hydrochloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV sterilizer</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>UVF-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194858</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica

הקבוצה של אויקוקולורה היא דמית המטוס עם יכולת יוצאת דופן האכלה מסנן, זמן דור מהיר, שימור מוקדם התפתחות, ו הגנום קומפקטית. מסיבות אלו, הוא נחשב לאורגניזם מודל שימושי למחקרים אקולוגיים ימיים, ביולוגיה התפתחותית אבולוציונית וגנומיקה. כאשר מחקרים דורשים לעתים קרובות אספקה קבועה של משאבי בעלי חיים, זה שימושי להקים מערכת התרבות אמין, תחזוקה נמוכה. כאן נתאר שיטת צעד-אחר-צעד להקמת תרבות של א. דו . אנו מתארים כיצד לבחור אתרי דגימה פוטנציאליים, שיטות איסוף, זיהוי בעלי חיים היעד, ואת הגדרת מערכת culturing. אנו מספקים ייעוץ לפתרון בעיות בהתבסס על ההתנסויות שלנו. כמו כן אנו מדגישים גורמים קריטיים המסייעים לקיים מערכת תרבותית חזקה. למרות שפרוטוקול התרבות שסופק כאן הוא מיטבי עבור O. דיואיקה, אנו מקווים שטכניקת הדגימה והגדרת התרבות שלנו תעודד רעיונות חדשים לשמירת חסרי חוליות שבירים אחרים.

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica at JoVE.com

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

דיוקולורה היא אורגניזם מודל מטונלי בתחומי הביולוגיה השונים. אנו מתארים שיטות דגימה, זיהוי מינים, התקנת culturing, ו culturing פרוטוקולים עבור בעלי חיים והזנה פריחת אצות. אנו מדגישים גורמי מפתח שסייעו לחזק את מערכת התרבות ולדון בבעיות וברזולוציות האפשריות.

דיגום וטיפוח בצורה מפושטת של לאראקא הקוסמופוליטן, אויקולאורה דיואיקה

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

פרוטוקול זה מדגים באופן חזותי כיצד להקים מערכת תרבות ארוכת טווח ואמינה עבור הטוניקה הפלגית הימית Oikopleura dioica. מערכת התרבות Oikopleura מספקת את המשאבים הבסיסיים לחקור מגוון רחב של תחומים ביולוגיים הקשורים לאקולוגיה, פיתוח, גנומיקה ואבולוציה. למין זה יש מחזור חיים קצר, פליות גבוהה, ו ניתן לאסוף אותו בקלות מהחוף, מה שהופך אותו לאורגניזם מודל מעולה.למרות פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור O.dioica, אנו מקווים שזה יכול להיות מיושם על אורגניזמים פלנקטוניים אחרים. כדי להתחיל, ליזום מזון אצות כדי לקיים את תרבות Oikopleura, החל autoclaving מי ים מסוננים. כדי ליזום תרבות מלאי של calcitrans Chaetoceros, 60 מילס של מי ים autoclaved היה בתוספת הבאים:30 microliters של ויטמינים, 30 microliters של פתרון A, 15 microliters של נתרן סיליקט, ו 60 microliters של סטרפטומיצין.לבסוף, 30 מיקרוליטרים של C.calcitrans מתרבות מניות קודמת נוספו כחוסנים. עיין בטבלה השנייה בכתב היד לגבי כרכים של תוספים וחיסון עבור מינים אחרים של אצות וסוגי תרבות. לאחר החיסון, המניות ותת-התת-תתיים נשמרים באינקובטור ב-17 מעלות צלזיוס עם תאורה רציפה.לאחר כ 10 ימים, צמיחת אצות מאושר על ידי flasks להיות צבעוני. כאשר זה קורה, להעביר את תרבות המניות לאחסון לטווח ארוך בארבע מעלות צלזיוס עד חודש תוך שמירה על תת התרבות באותו אינקובטור. כדי ליצור תרבות עבודה, להוסיף תוספי מזון הדרושים 400 מיל של מי ים autoclaved לחסן עם 100 mils של תת התרבות הקודמת.לאטום את הבקבוק עם כובע גומי, להכניס אחד מיליון, פיפטה חד פעמית, ולהעביר אותם לתחנת אצות ולשמור אותם בטמפרטורת החדר עם photoperiod שמונה שעות ו aeration מתמיד. באופן ידני מערבולת תרבויות אצות פעמיים ביום כדי למנוע צבירה בתחתית הבקבוק. לאחר הקמת תרבויות האצות, לאסוף דגימות שדה באתר מקומי.השליכו רשת פלנקטון, ואפשרו לקצה בקלה לשקוע מטר עד שני מטרים מתחת לפני השטח. לירות את הרשת במהירות של כ 5 עד 1 מטרים לשנייה. ממשיכים להתריע הלוך ושוב בין שתיים לחמש דקות.זמן הגרירה צריך להיות מותאם על פי שפע פלנקטון באתר. לאחר ההתרנגות, יש להרים בזהירות את הרשת ולהעביר באיטיות את תכולת קצה בקלה לבקבוק זכוכית של 500 מ"מ. ממלאים את הבקבוק בשוליים כדי למנוע בועות אוויר שיכולות לגרום ללחץ על בעלי החיים במהלך ההובלה.בשלב זה, נוכחותו של Oikopleura ניתן לאשר על ידי צפייה בקבוקי מדגם על רקע כהה. עם זאת, נדרשת תצפית מיקרוסקופית לזיהוי ברמת המינים. חזור על תהליך זה עד שלושה בקבוקים 500-mil נאספו.לאסוף מי ים פני השטח כדי לתעד מליחות, טמפרטורה, וריכוז כלורופיל עם profiler CTD. בנוסף, לאסוף 10 עד 15 ליטר של מי ים באתר כדי לעזור להתאקלם בעלי החיים לתנאי מעבדה. כדי להתאקלם בבעלי החיים, הכינו יחס של אחד לאחד של מי ים עיליים מאתר הדגימה ומי ים מסוננים המתוחזקים במעבדה.הנפח הסופי צריך להיות מותאם בין חמישה ל 10 ליטר, בהתאם לריכוז של מדגם פלנקטון. הוסיפו בזהירות את דגימת ה-500 מ"מ לסק המוכן. באמצעות משוט המחובר למנוע סינכרוני המסתובב ב-15 סל"ד, השאר את פלנקטון בהשעיה למשך הלילה.למחרת בבוקר, לבדוק את נוכחותו של Oikopleura בעין. מעבירים את בעלי החיים לצלחת פטרי, ומתבוננים תחת מיקרוסקופ שדה כהה שנקבע בין הגדלה 20 עד 40 פעמים לזיהוי חיובי. Oikopleura מאופיינים כחיות בצורת ראשן המחשוף את זנבותיהם בתוך בית שקוף.כדי לאשר O.dioica, לחפש זכרים בוגרים לחלוטין עם גונאדים צהובים או נקבות עם ביצים. אם החיות לא בשלות, חפשו נוכחות של שני תאים תת-סדריים בחצי הדיסטלי של הזנב. אלה קיימים הן בבעלי חיים בוגרים והן בבעלי חיים לא בוגרים.ברגע שהמין מאושר, להעביר אותם לצלחת פטרי חדשה. חזור על תהליך זה עד 10 עד 20 אנשים אושרו ברמת המינים. אם לא נמצא O.dioica, לשמור על המקה ערבוב במשך יום או יומיים נוספים.O.dioica קטן שלא היו ניתנים לצפייה בתחילה ימשיך לגדול ולהיות קל יותר לראות. אם אף אחד מהם אינו מופיע לאחר שבוע, בטל את הדגימה ונסה שוב לדגום. על מנת להקים מונוקולטורה, לבודד 120 O.dioica מדגם שדה בחמישה ליטרים של מי ים מסוננים.למחרת בבוקר, חפש זכרים בוגרים לחלוטין שזוהו על ידי גונאדים צהובים ולנקבות עם ביצים המופיעות כעולמות זהובים מנצנצים. הכן מקור להשריץ על ידי העברה עדין של 15 זכרים ו -30 נקבות עם פיפטה 5 מ"מ, קהה סוף למזימה המכילה 2.5 ליטר מי ים מסוננים. כדי למזער את הלחץ הפיזי במהלך ההעברה הידנית, שחררו באיטיות את בעלי החיים מתחת לפני השטח של מי הים החדשים.אפשר למבוגרים מבודדים להשריץ באופן טבעי. לאחר ההשרצתה, הפריה מוצלחת יכולה להיות מאושרת על ידי חילוץ חמישה עד 10 מיל של מי ים מתחתית הקוסם להשריץ וזיהוי ביצים עם מחשוף תחת מיקרוסקופ. בבוקר הראשון לאחר ההשרתה, היום הראשון, דור חדש של בעלי חיים צעירים עם בתים מנופחים צריך להופיע במזווה.השתמש ב-500 מ"ל, כף יד, כדי להעביר בעדינות בעלי חיים לסק חדש המכיל 7.5 ליטר מי ים טריים ומסוננים. יוצקים לאט את התוכן על פני השטח כדי למזער את המערבולות ולהסיר כוחות. בבוקר השני לאחר ההשרצות, היום השני, להעביר באופן ידני 150 בעלי חיים למזווה חדש המכיל חמישה ליטרים של מי ים טריים ומסוננים.בבוקר השלישי שלאחר ההשרצות, היום השלישי, מעבירים ידנית 120 בעלי חיים למזנון חדש עם חמישה ליטרים של מי ים טריים ומסוננים. עד היום הרביעי, בוגר מינית, בעלי חיים בוגרים צריכים להיות נוכחים. לאסוף 15 זכרים ו 30 נקבות עבור מקור הוליד חדש עם 2.5 ליטרים של מי ים מסוננים ליזום את הדור הבא.תהליך זה חוזר ומתוחזק על חיי התרבות. על מנת לשמור על מונוקולטורה של O.dioica, מזון אצות מוכן מדי יום מתרבויות עבודה. בעלי החיים ניזונים שלוש פעמים ביום.הכן מזון יומי על ידי מדידת ספיגת תרבות העבודה באמצעות ספקטרופוטומטר שנקבע על 660 ננומטר. ערכי ספיגה, נפחי תרבות O.dioica היעד, ובגרות בעלי חיים ממוקמים לתוך גיליון אלקטרוני מוכן המבוסס על עקומת צמיחה אצות שנקבעו בעבר כדי לחשב את הנפח המדויק של אצות הנדרש להאכלת היום. פיפטה את הנפחים המחושבים לצינורות 50 מ"מ, וצנטריפוגה ב 5, 000g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאט לאט לשפוך את על טבעי, בזהירות פיפטה למעלה ולמטה כדי לעכל את האצות גלולה. מילוי הצינורות לנפח המקורי שלהם עם מי ים טריים ומסוננים. בהתבסס על תרשים האכלת האצות היומי מהגיליון האלקטרוני, הזן את הכמות שצוינה לכל מקור בשעה 9 בבוקר.m.12 אחה.m ו-17:.m. ניתן להגדיר משאבת מנון אוטומטית כדי להאכיל את בעלי החיים בשעה 17:.m.בסופי שבוע ללא נוכחות של צוות culturing. לאחר כל האכלה, לשמור על מזון אצות מוכן בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לשמש להזנה הבאה. O.dioica ניתן לאסוף מנמל על ידי גרירה עדינה של רשת פלנקטון שונה מצויד רשת 100 מיקרון וסוף בקלה ללא סינון.הדגימה בין 2015 ל -19 הראתה שונות עונתית בנוכחות O.dioica בנמלי אוקינאווה. נראה כי טמפרטורת מי הים השפיעה על נוכחותם של בעלי החיים. O.dioica שלט כאשר טמפרטורת מי הים פני השטח היה 28 מעלות ומעלה.O.dioica בשיתוף פעולה עם Oikopleura longicauda בטמפרטורות שבין 24 ל -27 מעלות. עם זאת, O.longicauda שלט בטמפרטורות מתחת 23 מעלות. שינויים במליחות לא לתאם עם השפע של O.dioica.שלושת הגורמים החשובים ביותר להקמת מערכות תרבות יציבות של O.dioica הם שמירה על איכות מים גבוהה עם מערכת סינון רב-שלבית, זיהוי משטר הזנה אופטימלי, רצוי על ידי יצירת עקומות תקן אצות, והכנת מקורים הולידו עם מספר מספיק של זכרים ונקבות. בעקבות הפרוטוקול שסופק, מחזור החיים של O.dioica הוא ארבעה ימים ב 23 מעלות. הקמנו באופן אמין שש אוכלוסיות עצמאיות של או.דיויקה, כולן נמשכו יותר מ-20 דורות.לסיכום, הקמת תרבות יציבה של O.dioica יכולה להיעשות במהירות וחסכונית. עם התקנה נכונה, תרבות יציבה יכולה להיות מושגת בתוך שבוע. בשילוב עם הגנום הקטן שלה ומ מחזור החיים המהיר, זה הופך את O.dioica למין מודל אקורדט רב עוצמה.ניתן לשמור על O.dioica במי ים מלאכותיים וטבעיים. אחסון ארוך טווח של מזון אצות אפשרי באמצעות תרבות מוצקה והקפאה. בנוסף, זרע O.dioica יכול גם להיות cryopreserved ולהישאר קיימא במשך יותר משנה.O.dioica ממשיך לספק תובנות רבות עוצמה לתחומים ביולוגיים שונים. הבנה של עונתיות מקומית, מערכת תרבות קפדנית, וכמה אנשים מסורים מאפשרים ליצור תרבות יעילה במאמץ מועט.

Research

JoVE Journal

Environment

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

משולב שדה Lysimetry וPorewater דגימה להערכת כימית ניידות בקרקעות וצמחייה הוקמה

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

נקי דיגום ואנליזה של נהר ושפכי הנהרות ווטרס ללימודי מתכת עקבות

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

Modification and Application of a Leaf Blower-vac for Field Sampling of Arthropods

שינוי ויישום של VAC מפוח עלים עבור דגימת שדה של פרוקי רגליים

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

פרוטוקול עבור דגימת חלקיקים על פני הים וניתוח לדוגמא

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

קרקעות הדגימה במחקר הטרוגנית מגרש

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the ...

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

חדש נייד במבחנה חשיפה קלטת לדיגום אירוסול

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

טיפוח של ירוק Microalgae בועה עמודה Photobioreactors ואת וזמינותו עבור ליפידים נייטרלי

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri Uljanin 1884 for Experimental Studies

הטיפוח-תרגול של החיל הימי ( uljanin 1884) למחקרים ניסיוניים

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

Sampling for Estimating Frankliniella Species Flower Thrips and Orius Species Predators in Field Experiments

Sampling for Estimating Frankliniella Species Flower Thrips and Orius Species Predators in Field Experiments

דגימה להערכת פרנקליאלה מיני פרחים ומינים טורפים בניסויי שדה

The western flower thrips, Frankliniella occidentalis (Pergande), is a polyphagous pest that has been spread worldwide. The extensive use of insecticides ...