Name: streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica
Uploaded: 2020-06-16T15:00:00
Duration: 11 min 55 s
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Siamo grati a Garth Ilsley per il suo sostegno nella creazione del sistema culturale. Riconosciamo il contributo di Ritsuko Suyama e Sylvain Guillot al campionamento precoce e agli sforzi di identificazione delle specie. Un ringraziamento speciale è grazie a Hiroki Nishida, Takeshi Onuma e Tatsuya Omotezako per il loro generoso sostegno e guida in tutto, tra cui l'istituzione iniziale del sistema di coltura locale e la condivisione di animali e cultura microalgal. Ringraziamo anche Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Caestro e Alfonso Ferràndez-Roldàn per aver condiviso le loro competenze nel campionare e coltivare. Jai Denton, Charles Plessy e Jeffrey Jolly fornirono un feedback prezioso sul manoscritto. Charlotte West ha formulato un'equazione generalizzata per il calcolo delle alghe. Infine, ringraziamo OIST per il finanziamento, Mary Collins e il Comitato per la sicurezza sul lavoro sul campo OIST per la consulenza sulle procedure di campionamento sicuro, il personale del negozio di macchine OIST per la costruzione di attrezzature di coltura e campionamento e Koichi Toda per la fornitura di acqua di mare.

L'autore non ha nulla da dichiarare.

Per facilitare la flessibilità nella creazione della cultura O. dioica, è importante comprendere l'habitat naturale degli animali. I dati stagionali forniscono informazioni sulle gamme di parametri fisici, che possono essere utilizzate per guidare le condizioni di coltura di laboratorio. Aiuta anche a comprendere le fluttuazioni stagionali nell'abbondanza di animali. A Okinawa, O. dioica è più affidabile trovare da giugno a ottobre. Tuttavia, nella baia di Tokyo, le popolazioni picchiano in febbraio eottobre il 41. Anche se la coltura di O. dioica è spesso segnalata a 20 gradi centigradi o inferiore a27,28,29, Okinawan O. dioica mostra una migliore sopravvivenza a temperature superiori ai 20 gradi centigradi;29 questo potrebbe essere spiegato dal fatto che la temperatura minima delle acque di mare di superficie a Okinawa è di 20 gradi centigradi(Figura 6). L'abbondanza di O. dioica potrebbe anche essere influenzata dalle fioriture di fitoplancton42 e dall'abbondanza di predatori43,44. Indipendentemente da dove vengono raccolti O. dioica, comprendere la stagionalità delle popolazioni locali massimizza la possibilità di campionamento e di coltura del successo.
Data la stagione e la posizione appropriate, il campionamento netto è un modo efficace per raccogliere un gran numero di Oikopleura con il minimo sforzo. Le reti a cretolone con una dimensione di rete più piccola (60-70 m) possono anche essere utilizzate per raccogliere tutte le fasi degli animali. Gli animali completamente maturi si trovano raramente in rete, forse a causa della loro fragilità alla fine del ciclo di vita. Pertanto, l'identificazione delle specie seguite dal campionamento è ottenuta dall'osservazione microscopica delle cellule sottocordali. Gli individui maturi di solito appaiono uno o due giorni dopo il campionamento mentre gli animali continuano a crescere in laboratorio. Sebbene il campionamento netto sia efficiente, in circostanze diverse potrebbero essere necessari metodi di campionamento alternativi. Ad esempio, il campionamento netto vicino alle aree urbane può raccogliere un gran numero di fitoplancton, rendendo difficile isolare l'Oikopleura. In questi casi, si raccomanda un semplice campionamento di benne per raccogliere l'acqua di mare o il campionamento in barca da aree oltre il porto. I risultati hanno mostrato che il graduale cambiamento di salinità dovuto a giorni consecutivi di pioggia non ha influenzato l'abbondanza di O. dioica; tuttavia, il campionamento a terra subito dopo eventi meteorologici estremi come i cicloni tropicali dovrebbe essere evitato. Questi eventi causano improvvisi e drastici cambiamenti biogeochimici in un corpo riparato di acqua45,46. Il deflusso delle acque piovane può trasportare inquinanti, sedimenti e sostanze nutritive in eccesso, che aumentano la torbidità e la qualità dell'acquainferiore 47. Il plancton per l'alimentazione dei filtri, come l'Oikopleura,può essere particolarmente suscettibile a questi cambiamenti a causa della loro modalità di alimentazione e della mobilità limitata. In tali circostanze, si consiglia di posticipare il campionamento per alcuni giorni fino a quando le condizioni locali tornano alla normalità.
L'introduzione di un sistema di filtro multifase è essenziale per mantenere piccoli organismi che alimentano filtri come O. dioica. Utilizzando acqua di mare scarsamente filtrata (ad esempio, una maglie da 25 m nel sistema di coltura precedente), la coltura era spesso instabile soprattutto durante l'estate, potenzialmente a causa della maggiore abbondanza di fitoplancton. Anche se alcuni fitoplancton sono benefici per la crescita diOica, altri producono biotossine che possono causare lo sviluppo anomalo di embrioni O. dioica 48. Inoltre, un'alta concentrazione di diatomee come Chaetoceros spp. sono potenzialmente dannose per la crescita di O. dioica in quanto possono possedere lunghe setae che possono intasare la casa e prevenire un'alimentazione efficiente49. Spesso osservavamo case di piccoli animali intasati da C. calcitrans setae; quindi, ora diamo da mangiare C. calcitrans solo agli animali al giorno 2 e più anziani (Tabella 3).
Anche se non era un problema qui, la coltura a lungo termine su piccola scala di O. dioica può sperimentare improvvisi cali di dimensione della popolazione a causa di un collo di bottiglia genetico; in questi casi, Marta-Solans et al.29 consiglia di aggiungere nuovi individui selvatici alla cultura ogni 20 generazioni.
Il sistema di coltura Oikopleura è flessibile. Una cultura stabile può essere stabilita entro una settimana. La coltura a lungo termine di O. dioica è possibile con un budget modesto con attrezzature non specialistiche. Lo sforzo quotidiano richiesto per la manutenzione di 5-10 becher di Oikopleura è generalmente meno di 2 ore con 2 persone. O. dioica può essere mantenuta anche in acqua di mare artificiale, che è vantaggioso per coloro che non hanno accesso all'acqua di mare naturale28. Lo stoccaggio a lungo termine di alimenti algali è possibile utilizzando la cultura solida e la crioconservazione29. Inoltre, lo sperma O. dioica può essere crioconservato e rimanere vitale per più di un anno50. Tutti questi fattori significano che le culture possono essere facilmente ristabilite. Infine, esperienza passata con la coltura accidentale di Pleurobrachia sp. può suggerire che il sistema di coltura sviluppato per Oikopleura potrebbe potenzialmente essere esteso a una più ampia comunità di fragili organismi pelagici.
O. dioica continua a fornire potenti approfondimenti su vari campi biologici. La comprensione della stagionalità locale, un sistema culturale meticoloso e alcuni individui dedicati permettono di stabilire una cultura efficace con poco sforzo. Il sistema di coltura di Oikopleura fornisce le risorse di base per studiare una vasta gamma di campi biologici relativi all'ecologia, allo sviluppo, alla genomica e all'evoluzione di questo unico accordo marino.

Gli organismi modello sono stati fondamentali nell'affrontare molte questioni biologiche, tra cui quelle relative allo sviluppo, alla genetica e alla fisiologia. Inoltre, ulteriori organismi modello facilitano nuove scoperte e sono quindi cruciali per ottenere una maggiore comprensione della natura1,2. Lo zooplancton marino sono diversi gruppi di organismi che svolgono un ruolo importante negli ecosistemi oceanici3,4,5,6. Nonostante la loro abbondanza e l'importanza ecologica, gli organismi gelatinosi come i tunicati planctoni sono spesso sottorappresentati negli studi sulla biodiversità del plancton perché la loro trasparenza e fragilità rendono la raccolta e l'identificazione dei campi impegnativida 7,8. Tecniche di campionamento adattate e colture di laboratorio permettono una più stretta osservazione degli animali in vitro, che ha ulteriormente intensificato le conoscenze nella biologia dei tunicati planctonici9,10,11,12.
Larvacei (Appendicolari) sono una classe di tunicati marini che comprendono circa 70 specie descritte in tutto il mondo8,13. Poiché sono uno dei gruppi più abbondanti all'interno delle comunità di zooplancton14,15,16,17,larvacei rappresentano una fonte primaria di cibo per organismi planctonici più grandi come le larve di pesce18,19. A differenza degli ascidiani - i tunicati sessili-larvacei mantengono una morfologia girino-come e rimangono planctonici per tutta la vita20. Ogni animale vive all'interno di una struttura auto-costruita e intricata per l'alimentazione dei filtri conosciuta come casa. Accumulano particolato nelle loro case creando correnti d'acqua attraverso il movimento ondulato delle loro code21. Le case intasate vengono scartate per tutto il giorno, alcune delle quali formano aggregati di carbonio e alla fine affondano al fondo marino22; così, i larvacei svolgono un ruolo importante nel flusso globale del carbonio23. La maggior parte delle specie sono segnalate per vivere nella zona pelagica entro i 100 m superiori della colonna d'acqua13; tuttavia, la larva gigante Bathochordaeus è noto per abitare le profondità di 300 m24. Uno studio su Bathochordaeus nella baia di Monterey, California ha rivelato che gli animali fungono anche da vettore biologico di microplastiche, suggerendo una potenziale importanza nella comprensione del ruolo degli appendicolari nel trasporto verticale e nella distribuzione di microplastiche negli oceani25.
Oikopleura dioica, una specie di larvaceica, ha attirato l'attenzione negli ultimi anni come organismo modello a causa di diverse caratteristiche notevoli. È comunemente riportato in tutti gli oceani del mondo. E 'particolarmente abbondante nelle acque costiere26, che permette un facile campionamento dalla riva. La coltura stabile e a lungo termine è possibile con acqua di mare sia naturale che artificiale27,28,29. I tempi di generazione dipendenti dalla temperatura sono brevi fino a 4-9 giorni in condizioni di laboratorio. Ha un'alta fecondità con ogni femmina in grado di produrre >300 uova durante tutto l'anno. Come tunicato, occupa un'importante posizione filogenetica per comprendere l'evoluzione accordiate30,31. A 70 Mb, O. dioica ha il più piccolo genoma identificato tra tutti i chordates32. Tra i larvepati, O. dioica è l'unica specie non ermafrotica descritta finora33.
La prima coltura di O. dioica di successo con microalghe coltivate in laboratorio è stata riportata da Paffenh'fer34. Il protocollo originale della coltura con motori e pale sincroni è stato sviluppato da Fenaux e Gorsky35 e successivamente adottato da più laboratori. Più recentemente, Fujii et al.36 ha riferito o. dioica culturing in acqua di mare artificiale, un sistema di coltura robusto e la raccolta sul campo sono stati descritti da Bouquet et al.27 e un protocollo ottimizzato per un sistema semplificato e conveniente è stato segnalato da Marti-Solans et al.29. Oltre al tradizionale sistema di coltura Oikopleura, un design recentemente riportato con un serbatoio di allevamento a doppio tubo ha anche il potenziale per la coltura Oikopleura sp. 37.
Presentiamo un protocollo dettagliato per l'insorgere di una monocultura O. dioica basato su una combinazione di protocolli sviluppati dai principali gruppi di ricerca Oikopleura presso il Sars International Centre for Marine Molecular Biology27, l'Università di Barcellona29, l'Università di Osaka28,e le nostre osservazioni. Nei protocolli culturali pubblicati in precedenza, informazioni dettagliate sulla composizione dei media algali, sulle tecniche di campionamento a terra e sull'identificazione di Oikopleura sono state descritte solo approssimativamente, lasciando molte ambiguità. Qui, con l'aiuto delle informazioni visive nel protocollo video, abbiamo raccolto tutte le informazioni critiche necessarie per creare una cultura O. dioica da zero in modo semplice e graduale. Descriviamo come distinguere O. dioica da un'altra specie comunemente riportata, O. longicauda, che è uno dei passi più impegnativi. Anche se i sistemi di coltura esistenti sono applicabili per la coltivazione di O. dioica in tutto il mondo, sottolineiamo l'importanza dell'adattamento del protocollo in base alle condizioni ambientali locali. Le informazioni presentate combinano dati ampiamente pubblicati e conoscenze acquisite attraverso l'esperienza. L'attuale protocollo è ideale per i ricercatori interessati a stabilire una cultura da zero.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2764-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alluminum pulley</td>
			<td>Rainbow Products</td>
			<td>10604-10607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalamin (B12)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-03682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>039-04412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium edetate hydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon wrench</td>
			<td>Anex</td>
			<td>No.6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>091-00872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jebao programmable auto dosing pump</td>
			<td>Jebao</td>
			<td>DP-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet pump</td>
			<td>REI-SEA</td>
			<td>RMD-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>134-15302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene wound cartridge filter</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>TCW-10N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-5N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-1N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwless terminal block</td>
			<td>SATO PARTS</td>
			<td>SL4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple plankton net</td>
			<td>RIGO, Japan</td>
			<td>5512-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metasilicate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>307815-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-02545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchronous electric motor</td>
			<td>Servo</td>
			<td>D5N6Z15M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamin hydrochloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV sterilizer</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>UVF-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194858</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica

Oikopleura dioica è un accordo planctonico con eccezionale capacità di filtraggio, tempo di generazione rapido, prestato sviluppo precoce, e un genoma compatto. Per questi motivi, è considerato un organismo modello utile per gli studi ecologici marini, la biologia evolutiva dello sviluppo e la genomica. Poiché la ricerca spesso richiede una fornitura costante di risorse animali, è utile stabilire un sistema di coltura affidabile e a bassa manutenzione. Qui descriviamo un metodo passo-passo per stabilire una cultura O. dioica. Descriviamo come selezionare potenziali siti di campionamento, metodi di raccolta, identificazione animale di destinazione e la configurazione del sistema di coltura. Forniamo consigli per la risoluzione dei problemi in base alle nostre esperienze. Mettiamo in evidenza anche i fattori critici che aiutano a sostenere un sistema di coltura robusto. Anche se il protocollo culturale fornito qui è ottimizzato per O. dioica, speriamo che la nostra tecnica di campionamento e la configurazione della cultura ispireranno nuove idee per mantenere altri fragili invertebrati pelagici.

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Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

L'oikopleura dioica è un organismo modello di tunicato in vari campi della biologia. Descriviamo i metodi di campionamento, l'identificazione delle specie, l'impostazione della coltura e i protocolli di coltura per gli animali e i mangimi algali. Mettiamo in evidenza i fattori chiave che hanno contribuito a rafforzare il sistema culturale e a discutere i possibili problemi e risoluzioni.

Campionamento semplificato e coltivazione del LarvaENo Cosmopolita Pelagico, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

Questo protocollo dimostra visivamente come istituire un sistema di coltura affidabile e a lungo termine per la tunicata pelagica marina Oikopleura dioica. Il sistema di coltura di Oikopleura fornisce le risorse di base per indagare una vasta gamma di campi biologici relativi all'ecologia, allo sviluppo, alla genomica e all'evoluzione. Questa specie ha un breve ciclo di vita, un'alta fecondità e può essere facilmente raccolta dalla riva, rendendola un eccellente organismo modello.Sebbene questo protocollo sia ottimizzato per O.dioica, speriamo che possa essere applicato ad altri organismi planctonici. Per iniziare, inizia il cibo di alghe per sostenere la cultura di Oikopleura, a partire dall'autoclave dell'acqua di mare filtrata. Per avviare una coltura stock di Chaetoceros calcitrans, 60 mils di acqua di mare autoclavata sono stati integrati con i seguenti:30 microlitri di vitamine, 30 microlitri della soluzione A, 15 microlitri di silicato di sodio e 60 microlitri di streptomicina.Infine, 30 microlitri di C.calcitrans di una precedente coltura stock sono stati aggiunti come inoculanti. Fare riferimento alla tabella due del manoscritto per quanto riguarda i volumi di integrazione e inoculazione per le altre specie di alghe e tipi di coltura. Dopo l'inoculazione, lo stock e le sottoculture vengono mantenuti in un incubatore a 17 gradi Celsius con illuminazione continua.Dopo circa 10 giorni, la crescita delle alghe è confermata dal colore dei contenitori. In questo caso, spostare le colture stock in uno stoccaggio a lungo termine a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese mantenendo la sottocultura nello stesso incubatore. Per creare una cultura di lavoro, aggiungere i supplementi necessari a 400 mils di acqua di mare autoclavata e inoculare con 100 mils della sottocultura precedente.Sigillare il pallone con un cappuccio di gomma, inserire una pipetta monouso da un milione e spostarli in una stazione di alghe e mantenerli a temperatura ambiente con un fotoperiodo di otto ore e un'aerazione costante. Ruotare manualmente le colture di alghe due volte al giorno per evitare l'aggregazione nella parte inferiore del pallone. Una volta stabilite le colture di alghe, raccogliere campioni di campo in un sito locale.Lanciare una rete di plancton e permettere all'estremità del merluzzo di affondare da uno a due metri sotto la superficie. Trainare la rete ad una velocità di circa 5-1 metri al secondo. Continuare a trainare avanti e indietro per due o cinque minuti.Il tempo di traino dovrebbe essere regolato in base all'abbondanza di plancton in loco. Dopo il traino, sollevare con cura la rete e trasferire lentamente il contenuto dell'estremità del merluzzo in una bottiglia di vetro da 500 mil. Riempire la bottiglia sul bordo per evitare bolle d'aria che potrebbero causare stress agli animali durante il trasporto.In questa fase, la presenza di Oikopleura può essere confermata visualizzando le bottiglie campione su uno sfondo scuro. Tuttavia, è necessaria un'osservazione microscopica per l'identificazione a livello di specie. Ripetere questo processo fino a quando non sono state raccolte tre bottiglie da 500 mil.Raccogli l'acqua di mare di superficie per registrare la salinità, la temperatura e la concentrazione di clorofilla con un profiler CTD. Inoltre, raccogli da 10 a 15 litri di acqua di mare in loco per aiutare ad acclimatare gli animali alle condizioni di laboratorio. Per acclimatare gli animali, preparare un rapporto uno-a-uno di acqua di mare di superficie dal sito campione e acqua di mare filtrata mantenuta in laboratorio.Il volume finale deve essere regolato tra i cinque e i 10 litri, a seconda della concentrazione del campione di plancton. Aggiungere con cura il campione da 500 mil al becher preparato. Utilizzando una pagaia attaccata a un motore sincrono che ruota a 15 giri/min, mantenere il plancton in sospensione durante la notte.La mattina seguente, controlla la presenza di Oikopleura a occhio. Trasferire gli animali in una piastra di Petri e osservare sotto un microscopio a campo scuro impostato tra 20 e 40 volte per un'identificazione positiva. Gli Oikopleura sono caratterizzati come animali a forma di girino che ondulato la coda all'interno di una casa traslucida.Per confermare O.dioica, cerca maschi completamente maturi con gonadi gialle o femmine con uova. Se gli animali sono immaturi, cercare la presenza di due cellule subcordonali nella metà distale della coda. Questi sono presenti sia negli animali maturi che in quello immaturo.Una volta confermata la specie, trasferirli in una nuova piastra di Petri. Ripeti questo processo fino a quando 10-20 individui sono stati confermati a livello di specie. Se non viene trovata alcuna O.dioica, mantenere il becher mescolando per un giorno o due in più.I piccoli O.dioica che inizialmente non erano osservabili continueranno a crescere e diventeranno più facili da vedere. Se dopo una settimana non viene visualizzato nessuno, scartare il campione e riprovare a campionarlo. Per stabilire una monocoltura, isolare 120 O.dioica da un campione di campo in cinque litri di acqua di mare filtrata.La mattina seguente, cerca i maschi completamente maturi identificati dalle gonadi gialle e le femmine con uova che appaiono come sfere luccicanti e dorate. Preparare un becher di deposizione delle uova trasferendo delicatamente 15 maschi e 30 femmine con una pipetta da cinque mil e smussata su un becher contenente 2,5 litri di acqua di mare filtrata. Per ridurre al minimo lo stress fisico durante il trasferimento manuale, rilasciare lentamente gli animali sotto la superficie della nuova acqua di mare.Consentire agli adulti isolati di deporre le uova in modo naturale. Dopo la deposizione delle uova, la fecondazione riuscita può essere confermata estraendo da cinque a 10 mils di acqua di mare dal fondo del becher di deposizione delle uova e identificando le uova con scollatura al microscopio. La prima mattina dopo la deposizione delle uova, primo giorno, una nuova generazione di giovani animali con case gonfiate dovrebbe apparire nel becher.Utilizzare un becher portatile da 500 mil per trasferire delicatamente gli animali in un nuovo bicchiere contenente 7,5 litri di acqua di mare fresca e filtrata. Versare lentamente il contenuto in superficie per ridurre al minimo le turbolenze e le forze di taglio. La seconda mattina dopo la deposizione delle uova, secondo giorno, trasferire manualmente 150 animali su un nuovo becher contenente cinque litri di acqua di mare fresca e filtrata.Il terzo giorno dopo la deposizione delle uova, terzo giorno, trasferire manualmente 120 animali in un nuovo becher con cinque litri di acqua di mare fresca e filtrata. Entro il quarto giorno, gli animali adulti sessualmente maturi dovrebbero essere presenti. Raccogli 15 maschi e 30 femmine per un nuovo becher di deposizione delle uova con 2,5 litri di acqua di mare filtrata per iniziare la prossima generazione.Questo processo viene ripetuto e mantenuto per la vita della cultura. Al fine di mantenere una monocoltura di O.dioica, il cibo di alghe viene preparato quotidianamente dalle culture lavorative. Gli animali vengono nutriti tre volte al giorno.Preparare il cibo quotidiano misurando l'assorbanza della coltura di lavoro utilizzando uno spettrofotometro fissato a 660 nanometri. I valori di assorbanza, i volumi di coltura O.dioica target e la maturità animale sono inseriti in un foglio di calcolo preparato basato su una curva di crescita delle alghe precedentemente determinata per calcolare il volume esatto di alghe richiesto per l'alimentazione del giorno. Pipettare i volumi calcolati in tubi da 50 mil e centrifugare a 5.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente.Versare lentamente il supernatante e pipettare con cura su e giù per rimescolare le alghe pellettate. Riempire i tubi al loro volume originale con acqua di mare fresca e filtrata. In base al grafico giornaliero di alimentazione delle alghe dal foglio di calcolo, alimentare la quantità specificata per ogni becher alle 9 .m.12 p.m. e 17 p.m. Una pompa di dosing automatizzata può essere impostata per nutrire gli animali a 5 p.m.nei fine settimana senza la presenza di personale di ristrutturazione. Dopo ogni alimentazione, mantenere il cibo di alghe preparato a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per essere utilizzato per il mangime successivo. O.dioica può essere raccolta da un porto con il delicato traino di una rete di plancton modificata dotata di rete da 100 micron e di un sacco non filtrante.Il campionamento tra il 2015 e il 19 ha mostrato variazioni stagionali nella presenza di O.dioica nei porti di Okinawa. La temperatura superficiale dell'acqua di mare sembrava influenzare la presenza degli animali. O.dioica dominava quando la temperatura superficiale dell'acqua di mare era di 28 gradi o superiore.O.dioica coesiste con Oikopleura longicauda a temperature comprese tra 24 e 27 gradi. Tuttavia, O.longicauda dominò a temperature inferiori ai 23 gradi. I cambiamenti di salinità non erano correlati con l'abbondanza di O.dioica.I tre fattori più importanti per stabilire sistemi stabili di coltura O.dioica sono il mantenimento di un'elevata qualità dell'acqua con un sistema di filtrazione in più step, identificando un regime di alimentazione ottimale, preferibilmente creando curve standard di alghe e la preparazione di becher di deposizione delle uova con un numero sufficiente di maschi e femmine. Seguendo il protocollo fornito, il ciclo di vita di O.dioica è di quattro giorni a 23 gradi. Abbiamo stabilito in modo affidabile sei popolazioni indipendenti di O.dioica, tutte durate più di 20 generazioni.In conclusione, stabilire una cultura stabile dell'O.dioica può essere fatto in modo rapido ed economico. Con una configurazione corretta, una cultura stabile può essere raggiunta entro una settimana. In combinazione con il suo piccolo genoma e il rapido ciclo di vita, questo rende O.dioica una potente specie modello cordata.O.dioica può essere mantenuto sia in acqua di mare artificiale che naturale. Lo stoccaggio a lungo termine di cibo algale è possibile utilizzando coltura solida e crioconservazione. Inoltre, lo sperma O.dioica può anche essere crioconservato e rimanere vitale per più di un anno.O.dioica continua a fornire potenti intuizioni su vari campi biologici. La comprensione della stagionalità locale, un meticoloso sistema culturale e alcuni individui dedicati consentono di stabilire una cultura efficace con poco sforzo.

Research

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