Name: streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica
Uploaded: 2020-06-16T15:00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica at JoVE.com

가르트 일슬리가 문화체계 구축을 지원해 주신 것에 감사드립니다. 스야마 리츠코와 실뱅 길롯이 조기 샘플링 과 종 식별 노력에 기여한 것을 인정합니다. 니시다 히로키, 오누마 다케시, 오모테자코 다츠야가 지역 배양 시스템 초기 구축, 동물 및 미세골 문화 공유 등 다양한 지원과 지도를 해주셔서 특별한 감사를 드립니다. 또한 다니엘 추루, 장 마리 부케, 앤 아조르드, 크리스티안 카네스트로, 알폰소 페란데스-롤단이 샘플링과 배양에 대한 전문 지식을 공유해 주신 것에 대해 서도 감사드립니다. 제이 덴튼, 찰스 플레시, 제프리 졸리는 원고에 대한 귀중한 피드백을 제공했다. 샬롯 웨스트는 조류 계산을위한 일반화 방정식을 공식화. 마지막으로, 안전한 샘플링 절차에 대한 조언을 제공하는 자금 조달에 대한 OIST, 메리 콜린스와 OIST 현장 작업 안전위원회, 배양 및 샘플링 장비의 건설을위한 OIST 기계 공장의 직원, 그리고 바닷물을 제공하는 고이치 토다에 대한 조언을 감사드립니다.

저자는 선언할 것이 없습니다.

O. dioica 문화의 설립에 유연성을 촉진하기 위해, 동물의 자연 서식지를 이해하는 것이 중요하다. 계절 데이터는 실험실 배양 조건을 안내하는 데 사용할 수있는 물리적 매개 변수의 범위에 대한 정보를 제공합니다. 또한 풍부한 동물의 계절 적 변동을 이해하는 데 도움이됩니다. 오키나와에서는 6월부터 10월까지 O. 디오이카가 가장 안정적으로 발견됩니다. 그러나 도쿄만에서는 2월과 10월41일에인구가 정점에 달합니다. O. 디오이카의 배양은 종종 20 °C 또는 27이하,28,,29에서보고되지만, 오키나와 O. 디오이카는 20 ° C 이상의 온도에서 더 나은 생존을 보여줍니다;27 이는 오키나와의 최소 지표해수 온도가 ~20°C(도6)라는사실에 의해 설명될 수 있다. O. 디오이카의 풍요로움은 또한 식물성 플랑크톤 꽃42및 육식 동물 풍부43,,44에의해 영향을받을 수 있습니다. O. dioica가 수집되는 위치에 관계없이 지역 주민의 계절성을 이해하면 샘플링 및 배양 성공의 기회를 극대화합니다.
적절한 계절과 위치를 감안할 때, 그물 샘플링은 최소한의 노력으로 많은 수의 Oikopleura를 수집하는 효과적인 방법입니다. 작은 메쉬 크기 (60-70 μm)를 가진 플랑크톤 그물은 또한 동물의 모든 단계를 수집하는 데 사용될 수있다. 완전히 성숙한 동물은 거의 그물에서 찾을 수 있습니다, 아마도 때문에 수명 주기의 끝에 그들의 취약성. 따라서, 샘플링에 이어 종 식별은 하위 코드 세포의 현미경 관찰에 의해 달성된다. 성숙한 개별은 일반적으로 동물이 실험실에서 성장하는 것을 계속으로 1 또는 2 일 후에 샘플링 후에 나타납니다. 순 샘플링은 효율적이지만 다른 상황에서는 대체 샘플링 방법이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 도시 지역 근처의 순 샘플링은 많은 양의 식물성 플랑크톤을 수집할 수 있으므로 Oikopleura를분리하기가 어렵습니다. 이러한 경우 항구 너머 지역에서 표면 해수 또는 보트 샘플링을 수집하는 간단한 버킷 샘플링을 권장합니다. 그 결과, 연속적인 비로 인한 신분적 변화는 O. 디오이카의풍요로움에 영향을 미치지 않았다는 것을 보여주었다. 그러나 열대 저기압과 같은 극단적 인 기상 사건 직후 해안 샘플링을 피해야합니다. 이러한 사건은 물45,,46의보호 된 몸에 갑작스럽고 과감한 생화학적 변화를 일으킨다. 우수 유출은 오염물질, 퇴적물 및 과잉 영양소를 운반할 수 있으며, 이는 탁도를 높이고 수질이낮아진다(47). 오이코플레우라와같은 필터 공급 플랑크톤은 먹이주기 모드와 제한된 이동성으로 인해 이러한 변화에 특히 취약할 수 있습니다. 이러한 상황에서는 현지 조건이 정상으로 돌아올 때까지 며칠 동안 샘플링을 연기하는 것이 좋습니다.
다단계 필터 시스템의 도입은 O. dioica와같은 작은 필터 공급 유기체를 유지하는 데 필수적입니다. 제대로 여과된 바닷물(예: 이전 배양 시스템에서 25 μm 메쉬)을 사용하면 특히 여름에는 식물성 플랑크톤의 풍부가 높기 때문에 문화가 불안정했습니다. 일부 식물성 플랑크톤은 O. dioica 성장에 유익하지만, 다른 사람들은 O. dioica 배아48의 비정상적인 발달을 일으킬 수있는 바이오 톡신을 생산한다.48 또한, 채토세로스 spp와 같은 고농도의 규음은 집을 막아 효율적인수유를방지할 수 있는 긴 세태를 소유할 수 있기 때문에 O. 디오이카 성장에 잠재적으로 해롭다. 우리는 종종 C. calcitrans setae에 의해 막히는 작은 동물의 집을 관찰; 따라서, 우리는 지금 2 일 이상(표 3)에서동물에게만 C. calcitrans를 공급합니다.
여기서는 문제가 되지 않았지만, O. dioica의 소규모 장기 배양은 유전 병목 현상으로 인해 인구 규모에 급격한 하락을 경험할 수 있습니다. 이러한 경우, Martí-Solans외. 29 는 20 세대마다 문화에 새로운 야생 개인을 추가하는 것이 좋습니다.
오이코플레라 문화 시스템은 유연합니다. 안정적인 문화는 1주일 이내에 확립될 수 있습니다. O. dioica의 장기 배양은 비 전문 장비와 겸손한 예산에 가능하다. 오이코플레라의 5-10 부커의 유지 보수에 필요한 일일 노력은 일반적으로 2 명으로 2 시간 미만입니다. O. 디오이카는 또한 천연 바닷물에 접근하지 않는 사람들에게 유익한 인공 해수에서 유지 될수있다(28). 고체 배양및냉동보존(29)을이용하여 조류식품의 장기 보관이 가능하다. 더욱이, O. 디오이카 정자는 극저온 보존될 수 있고, 1년 이상50년이상 생존할 수 있다. 이러한 모든 요인은 문화를 쉽게 재확립할 수 있음을 의미합니다. 마지막으로, Pleurobrachia Sp의우발적 인 배양과 과거의 경험. Oikopleura를 위해 개발된 배양 시스템이 잠재적으로 깨지기 쉬운 펠라기 유기체의 광범위한 지역 사회로 확장 될 수 있음을 제안 할 수 있습니다.
O. 디오이카는 다양한 생물학적 분야에 대한 강력한 통찰력을 지속적으로 제공하고 있습니다. 지역 계절성, 세심한 문화 시스템, 그리고 소수의 헌신적인 개인에 대한 이해는 약간의 노력으로 효과적인 문화를 확립할 수 있도록 합니다. Oikopleura 배양 시스템은 생태, 발달, 유전체학 및 이 독특한 해양 화음의 진화와 관련된 광범위한 생물학적 분야를 조사하기 위한 기준자원을 제공합니다.

모형 유기체는 발달, 유전학 및 생리학에 관련되었던 그 포함하여 많은 생물학 질문을 해결에 있는 중요한 역할을 했습니다. 또한, 추가 모델 유기체는 새로운 발견을 용이하게하고 따라서 자연1,,2의더 큰 이해를 달성하는 것이 중요합니다. 해양 동물 플랑크톤은,해양,생태계3,4,5,56에서중요한 역할을하는 다양한 생물 그룹입니다. 그들의 풍부하고 생태학적 중요성에도 불구하고, 플랑크토닉 성구와 같은 젤라틴 유기체는 그들의 투명성과 취약성이 필드 수집 및 식별 도전을 도전하기 때문에 플랑크톤 생물 다양성 연구에서 종종 과소 대표된다7,,8. 적응된 샘플링 기술과 실험실 배양은 발단성 우두골9,,10,,11,,12의생물학에 대한 지식을 발전시킨 시험관 내 동물의 면밀한 관찰을 가능하게 한다.
Larvaceans (부속) 약 70 개의 설명 된종으로구성된 무료 수영 해양 투운의 클래스입니다8,13. 그들은 동물 플랑크톤 지역 사회 내에서 가장 풍부한 그룹 중 하나이기 때문에14,,15,,16,,17,애벌레는 물고기 애벌레 와 같은 더 큰 플랑크토닉 생물에 대한 주요 식품 소스를 나타냅니다18,,19. ascidians와는 달리- 세실 tunicates-larvaceans는 올챙이 같은 형태를 유지하고 그들의 생활 내내 플랑크토닉 남아20. 각 동물은 집으로 알려진 자체 내장, 복잡한 필터 공급 구조 안에 살고있다. 그들은 그들의 꼬리의 기복 운동을 통해 수류를 만들어 자신의 집에 미립자를 축적(21). 막힌 집은 하루 종일 버려지며, 그 중 일부는 탄소 응재를 형성하고 결국 해저22로가라 앉습니다. 따라서, larvaceans는 글로벌 탄소 플럭스23에서중요한 역할을한다. 대부분의 종은 물 기둥13의상부 100m 내의 펠라기 구역에 사는 것으로 보고된다. 그러나 거대한 라바천 바토코르데우스는 300m24의깊이에 서식하는 것으로 알려져 있다. 캘리포니아 몬테레이 베이의 바토코르데우스(Bathochordaeus)에 대한 연구에 따르면 동물들은 미세 플라스틱의 생물학적 벡터역할을 하며, 이는해양에서미세 플라스틱의 수직 수송 및 분포에서 부속자의 역할을 이해하는 데 잠재적중요성을 시사한다.
라바천종인 오이코플레우라 디오이카는최근 몇 가지 놀라운 특성으로 인해 모델 유기체로서 주목받고 있다. 그것은 일반적으로 세계의 바다에 걸쳐 보고된다. 특히 해안해26에풍부하여 해안에서 쉽게 샘플링할 수 있습니다. 천연 및 인공 해수(27,,28,,29)를모두 통해 장기적이고 안정적인 배양이 가능하다.28 온도 종속 생성 시간은 실험실 조건에서 4-9일만큼 짧습니다. 일년 내내 달걀을 생산할 수 있는 각 여성과 높은 fecundity를 가지고 있습니다. 투니케이트로서, 그것은 화음 진화(30)31을이해하기위한 중요한 필로 유전학 위치를 차지한다., 70 Mb에서 O. dioica는 모든 chordates32사이에서 가장 작은 식별 된 게놈을 갖는다. 애벌레 중, O. 디오이카는 지금까지33까지유일하게 설명된 비 헤르마포디악 종이다.
실험실에서 재배된 미세조류를 사용한 최초의 성공적인 O. 디오이카 문화는 Paffenhöfer34에의해 보고되었다. 동기 모터와 패들을 사용한 최초의 배양 프로토콜은 Fenaux와 Gorsky35에 의해 개발되었으며 나중에 여러 실험실에서 채택되었습니다. 최근에는 후지이외(36)가 인공 해수에서 O. dioica 배양, 강력한 배양 시스템 및 현장 수집을 보고했으며,27일 부케 등에서 설명하고 단순화되고 저렴한 시스템을 위한 최적화된 프로토콜을 마티 솔란스 외29에보고했다. 전통적인 오이코플레우라 문화 시스템 외에도 이중 튜브 사육 탱크가 있는 새로 보고된 디자인도 오이코플레라 스프를 문화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 37.
우리는 해양 분자 생물학을위한 사스 국제 센터에서 주요 Oikopleura 연구 그룹에 의해 개발 된 프로토콜의 조합을 기반으로 O. dioica 단문화를 시작하기위한 자세한 프로토콜을 제시27,바르셀로나 대학29,오사카 대학28,우리 자신의 관찰. 이전에 발표된 문화 프로토콜에서는 조류 매체의 구성, 해안 샘플링 기술 및 Oikopleura 식별에 관한 자세한 정보는 대략적인 설명에 불과하여 많은 모호성을 남겼습니다. 여기에서는 비디오 프로토콜의 시각적 정보를 지원하여 O. dioica 문화를 처음부터 간단하고 단계별로 설정하는 데 필요한 모든 중요한 정보를 수집했습니다. 우리는 O. dioica를 가장 어려운 단계 중 하나인 다른 일반적으로 보고된 종인 O. longicauda와구별하는 방법을 설명합니다. 기존 문화 시스템은 전 세계적으로 O. dioica의 재배에 적용 할 수 있지만, 우리는 지역 환경 조건에 따라 프로토콜 조정의 중요성을 강조한다. 제시된 정보는 널리 게시된 데이터와 경험을 통해 얻은 지식을 결합합니다. 현재 프로토콜은 처음부터 문화를 확립하는 데 관심이있는 연구자에게 이상적입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2764-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alluminum pulley</td>
			<td>Rainbow Products</td>
			<td>10604-10607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalamin (B12)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-03682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>039-04412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium edetate hydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon wrench</td>
			<td>Anex</td>
			<td>No.6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>091-00872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jebao programmable auto dosing pump</td>
			<td>Jebao</td>
			<td>DP-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet pump</td>
			<td>REI-SEA</td>
			<td>RMD-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>134-15302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene wound cartridge filter</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>TCW-10N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-5N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-1N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwless terminal block</td>
			<td>SATO PARTS</td>
			<td>SL4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple plankton net</td>
			<td>RIGO, Japan</td>
			<td>5512-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metasilicate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>307815-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-02545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchronous electric motor</td>
			<td>Servo</td>
			<td>D5N6Z15M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamin hydrochloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV sterilizer</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>UVF-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194858</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica

Oikopleura 디오이카는 뛰어난 필터 공급 능력, 빠른 생성 시간, 보존 된 초기 개발 및 컴팩트 한 게놈을 갖춘 판자 코드입니다. 이러한 이유로, 그것은 해양 생태 학 연구, 진화 발달 생물학 및 유전체학에 대 한 유용한 모델 유기체로 간주 됩니다. 연구는 종종 동물 자원의 꾸준한 공급을 필요로하기 때문에, 신뢰할 수있는, 낮은 유지 보수 문화 시스템을 설정하는 것이 유용합니다. 여기서는 O. dioica 문화를 수립하기 위한 단계별 방법을 설명합니다. 잠재적인 샘플링 사이트, 수집 방법, 대상 동물 식별 및 배양 시스템의 설정을 선택하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 우리 자신의 경험을 기반으로 문제 해결 조언을 제공합니다. 또한 강력한 문화 시스템을 유지하는 데 도움이 되는 중요한 요소를 강조합니다. 여기에 제공되는 문화 프로토콜은 O. dioica에최적화되어 있지만, 우리는 우리의 샘플링 기술과 문화 설정이 다른 깨지기 쉬운 pelagic 무척추 동물을 유지하기위한 새로운 아이디어를 고무 할 수 있기를 바랍니다.

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica at JoVE.com

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

오이코플레우라 디오이카는 다양한 생물학 분야의 투니케이트 모델 유기체입니다. 동물 및 조류 사료에 대한 샘플링 방법, 종 식별, 배양 설정 및 배양 프로토콜을 설명합니다. 우리는 문화 시스템을 강화하고 가능한 문제와 해결에 대해 논의하는 데 도움이 되는 주요 요소를 강조합니다.

펠라곤 코스모폴리탄 라르바천, 오이코플레우라 디오이카의 간소화된 샘플링 및 재배

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

이 프로토콜은 해양 골반 투니케이트 Oikopleura 디오이카를 위한 장기적고 신뢰할 수 있는 배양 시스템을 구축하는 방법을 시각적으로 보여줍니다. Oikopleura 배양 시스템은 생태학, 발달, 유전체학 및 진화와 관련된 광범위한 생물학적 분야를 조사하기 위한 기준자원을 제공합니다. 이 종은 짧은 수명 주기, 높은 fecundity를 가지고 있으며, 쉽게 우수한 모델 유기체만들기, 해안에서 수집 할 수 있습니다.이 프로토콜은 O.dioica에 최적화되어 있지만 다른 판크토닉 유기체에 적용 될 수 있기를 바랍니다. 먼저 여과된 바닷물을 자동화하는 것부터 시작하여 Oikopleura 문화를 유지하기 위해 조류 음식을 시작하십시오. 채토세로스 칼시트랜스의 주식 문화를 시작하기 위해, 오토클레이브 해수 의 60 밀은 다음과 같은 보충되었다: 30 비타민의 마이크로 리터, 용액 A의 마이크로 리터 30 마이크로 리터, 나트륨 규산염의 15 마이크로 리터, 그리고 60 연쇄 상감술의 마이크로 리터.마지막으로, 이전 주식 문화에서 C.calcitrans의 30 마이크로 리터는 무분이한 것으로 추가되었습니다. 다른 조류 종 및 문화 유형에 대한 보충 및 접종 볼륨에 관한 원고의 표 2를 참조하십시오. 접종 후, 주식과 하위 문화는 연속 조명과 섭씨 17도에서 인큐베이터로 유지됩니다.약 10 일 후, 조류 성장은 플라스크가 착색됨으로써 확인됩니다. 이 경우 동일한 인큐베이터에서 하위 문화를 유지하면서 최대 1개월 동안 4도의 장기 보관으로 주식 문화를 이동합니다. 작업 문화를 만들기 위해, 에 필요한 보충제를 추가 400 오토 클레이브 바닷물의 밀과 접종 100 이전 하위 문화의 밀.플라스크를 고무 캡으로 밀봉하고, 일회용 파이펫을 삽입하고, 조류 스테이션으로 옮기고 8시간의 포토기간과 일정한 폭기로 실온에서 유지합니다. 플라스크 의 바닥에 응집을 방지하기 위해 수동으로 하루에 두 번 조류 문화를 소용돌이. 조류 문화가 확립되면 현지 사이트에서 현장 샘플을 수집합니다.플랑크톤 그물을 캐스팅하고 대구 끝이 표면 아래 1~2미터 가라앉을 수 있도록 합니다. 초당 약 5~1m의 속도로 그물을 견인합니다. 2~5분 간 계속 견인합니다.견인 시간은 현장에서 플랑크톤 풍부에 따라 조정되어야 합니다. 견인 후 조심스럽게 그물을 들어 올려 대구 끝의 내용을 500 mil, 유리 병으로 천천히 전달합니다. 수송 하는 동안 동물에 게 스트레스를 일으킬 수 있는 기포를 피하기 위해 테두리에 병을 채우기.이 단계에서, 오이코플레라의 존재는 어두운 배경에 대한 샘플 병을 보고 확인할 수 있습니다. 그러나 종 수준의 식별을 위해서는 현미경 관찰이 필요합니다. 500마일 병 3개가 수집될 때까지 이 과정을 반복하십시오.CTD 프로파일러를 사용하여 염도, 온도 및 엽록소 농도를 기록하기 위해 표면 해수를 수집합니다. 또한 10~15리터의 현장 해수를 수집하여 동물을 실험실 조건에 적응시킬 수 있도록 도와줍니다. 동물을 적응시키기 위해, 실험실에서 유지되는 견본 부지 및 여과된 해수에서 표면 해수의 일대일 비율을 준비합니다.최종 부피는 플랑크톤 샘플의 농도에 따라 5~10리터 사이로 조정되어야 한다. 500mil 샘플을 준비된 비커에 조심스럽게 추가합니다. 15 RPM에서 회전하는 동기 모터에 부착 된 패들을 사용하여 플랑크톤을 밤새 서스펜션상태로 유지하십시오.다음 날 아침, 눈으로 오이코플라의 존재를 확인하십시오. 동물을 페트리 접시로 옮기고, 양성 식별을 위해 20~40배 배율로 설정된 암암장 현미경으로 관찰한다. 오이코플레우라는 반투명 주택 안에서 꼬리를 기복하는 올챙이 모양의 동물로 특징지어졌습니다.O.dioica를 확인하려면 노란색 조나드또는 계란이있는 암컷이있는 완전히 성숙한 남성을 찾으세요. 동물이 미숙한 경우 꼬리의 말단 절반에 두 개의 하위 코드 세포의 존재를 찾습니다. 이들은 성숙하고 미숙한 동물 둘 다에 있습니다.종이 확인되면, 새로운 페트리 요리로 전송합니다. 10~20명의 개인이 종 수준에서 확인될 때까지 이 과정을 반복하십시오. O.dioica가 발견되지 않으면 비커가 하루 이틀 동안 교반하십시오.처음에 관찰할 수 없었던 작은 O.dioica는 계속 성장하고 쉽게 볼 수 있게 될 것입니다. 1주일 후에 나타나지 않으면 샘플을 버리고 다시 샘플링해 봅보십시오. 단문화를 확립하기 위해, 여과된 해수 5리터의 필드 샘플에서 120 O.dioica를 분리한다.다음 날 아침, 노란 조나드로 확인된 완전히 성숙한 남성과 반짝이는 황금구체로 나타나는 달걀을 가진 암컷을 찾아보세요. 15명의 수컷과 30명의 암컷을 5밀, 무딘 파이펫으로 2.5리터의 여과된 바닷물이 들어있는 비커로 부드럽게 이송하여 산란 비커를 준비한다. 수동 이송 중에 물리적 인 스트레스를 최소화하기 위해 새로운 바닷물의 표면 아래에 동물을 천천히 놓습니다.고립된 성인이 자연스럽게 생성되도록 허용합니다. 산란 후, 성공적인 수정은 산란 비커의 바닥에서 바닷물의 5 ~ 10 마일을 추출하고 현미경의 밑에 분열로 계란을 식별하여 확인할 수 있습니다. 산란 후 첫 날 아침, 부풀린 집을 가진 새로운 세대의 젊은 동물이 비커에 나타나야 합니다.500mil 핸드헬드 비커를 사용하여 7.5리터의 신선하고 여과된 바닷물이 들어있는 새로운 비커로 동물을 부드럽게 이송합니다. 난기류와 전단력을 최소화하기 위해 표면에 천천히 콘텐츠를 붓습니다. 산란 후 둘째 날 아침, 둘째 날, 150마리의 동물을 신선하고 여과된 바닷물이 들어 있는 새로운 비커로 수동으로 옮겨넣습니다.3일 아침, 산란 후 세 번째 아침에120마리의 동물을 신선하고 여과된 바닷물이 있는 새로운 비커로 수동으로 옮겨보었습니다. 4일째가 되면 성적으로 성숙하고 어른의 동물이 있어야 합니다. 다음 세대를 시작하기 위해 2.5 리터의 여과 된 바닷물이있는 새로운 산란 비커를 위해 15 명의 수컷과 30 명의 암컷을 수집하십시오.이 과정은 문화의 삶을 위해 반복되고 유지됩니다. O.dioica의 단일 문화를 유지하기 위해, 조류 음식은 노동 문화에서 매일 준비됩니다. 동물은 하루에 세 번 먹입니다.660 나노미터로 설정된 분광계를 사용하여 작업 문화의 흡수성을 측정하여 일일 음식을 준비합니다. 흡수값, 표적 O.dioica 배양량 및 동물의 성숙도는 이전에 결정된 조류 성장 곡선을 기반으로 준비된 스프레드시트에 배치되어 당일 수유에 필요한 정확한 조류 양을 계산합니다. 계산된 볼륨을 50mil 튜브로 파이프, 실온에서 5분 동안 5, 000g의 원심분리기.서서히 상체를 부어, 조심스럽게 위아래로 피펫을 위아래로 피펫하여 펠렛 조류를 다시 중단합니다. 신선한 여과 된 바닷물로 튜브를 원래 볼륨으로 리필하십시오. 스프레드시트의 일일 조류 공급 차트를 기반으로 지정된 금액을 각 비커에 공급하여 .m.12 p.m. 및 5 p.m. 5 p.m에서 동물을 먹이기 위해 자동 도징 펌프를 설정할 수 있습니다.주말에는 배양 직원의 존재없이. 각 수유 후, 다음 사료에 사용할 준비가 될 때까지 4섭씨에서 준비된 조류 식품을 유지하십시오. O.dioica는 100 미크론 메쉬와 비 필터링 대구 끝이 장착 된 수정 된 플랑크톤 그물의 부드러운 견인에 의해 항구에서 수집 할 수 있습니다.2015년과 19일 사이에 샘플링을 통해 오키나와 항구에 O.dioica가 있는 계절적 변화를 보였습니다. 표면 해수 온도는 동물의 존재에 영향을 미치는 것 같았다. 표면 해수 온도가 28도 이상이었을 때 O.dioica가 지배했습니다.O.dioica는 24~27도 의 온도에서 오이코플레우라 롱카우다와 공존했습니다. 그러나 O.longicauda는 23도 이하의 온도에서 지배했습니다. 살리니티의 변화는 O.dioica의 풍요로움과 상관관계가 없었다.안정적인 O.dioica 문화 시스템을 구축하기위한 세 가지 가장 중요한 요소는 다단계 여과 시스템으로 높은 수질을 유지하고, 최적 공급 체제를 식별하고, 바람직하게는 조류 표준 곡선을 생성하고, 남성과 여성의 충분한 수의 비커를 산란하는 것입니다. 제공된 프로토콜에 따라 O.dioica의 수명 주기는 23도에서 4 일입니다. 우리는 안정적으로 O.dioica의 여섯 독립적 인 인구를 설립했습니다, 모두는 20 세대 이상 지속.결론적으로, O.dioica의 안정적인 문화를 확립하는 것은 신속하고 비용 효율적으로 수행 할 수 있습니다. 적절한 설정을 통해 1주일 이내에 안정적인 문화를 달성할 수 있습니다. 작은 게놈과 빠른 수명 주기와 함께, 이것은 O.dioica 강력한 화음 모델 종을 만든다.O.dioica는 인공 및 천연 바닷물 모두에서 유지 될 수있다. 고체 문화와 냉동 보존을 사용하여 조류 식품의 장기 저장이 가능합니다. 또한, O.dioica 정자는 또한 극저온 보존 될 수 있으며 1 년 이상 실행 가능한 상태로 유지 될 수 있습니다.O.dioica는 다양한 생물학적 분야에 대한 강력한 통찰력을 지속적으로 제공합니다. 지역 계절성, 세심한 문화 시스템, 그리고 소수의 헌신적인 개인에 대한 이해는 약간의 노력으로 효과적인 문화를 확립할 수 있도록 합니다.

Research

JoVE Journal

Environment

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

통합 필드 Lysimetry 및 Porewater 샘플링 토양에서 화학 이동성의 평가 및 설립 식물

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

연구

환경과학

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steine​​rnematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

클린 샘플링 및 추적 금속 연구 강 하구 바다의 분석

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

Modification and Application of a Leaf Blower-vac for Field Sampling of Arthropods

수정 및 절지 동물의 필드 샘플링을위한 잎 송풍기 - 진공 청소기의 적용

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

바다 표면 및 샘플 분석에 Microplastics 샘플링을위한 프로토콜

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

다른 유형의 연구에 샘플링 토양 플롯

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the ...

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

새로운 휴대용 체 외에 노출 카세트 졸 샘플링에 대 한

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

중립 지질에 대 한 녹색 미세 거품 열 Photobioreactors에 시험 재배

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri Uljanin 1884 for Experimental Studies

실험 연구를 위한 해양 펠라기 투니케이트 돌리오레타 게겐바우리 재배 (울자닌 1884)

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

Sampling for Estimating Frankliniella Species Flower Thrips and Orius Species Predators in Field Experiments

Sampling for Estimating Frankliniella Species Flower Thrips and Orius Species Predators in Field Experiments

현장 실험에서 프랭클린니엘라 종 꽃 물방울과 오리우스 종 육식 동물을 추정하기위한 샘플링

The western flower thrips, Frankliniella occidentalis (Pergande), is a polyphagous pest that has been spread worldwide. The extensive use of insecticides ...