Name: streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica
Uploaded: 2020-06-16T15:00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica at JoVE.com

Vi er takknemlige overfor Garth Ilsley for hans støtte til å etablere kultursystemet. Vi anerkjenner Ritsuko Suyamas og Sylvain Guillots bidrag til tidlig prøvetaking og artsidentifikasjonsarbeid. Spesiell takk skyldes Hiroki Nishida, Takeshi Onuma og Tatsuya Omotezako for deres sjenerøse støtte og veiledning gjennom, inkludert første etablering av det lokale kulturingssystemet og deling av dyr og mikroalgal kultur. Vi takker også Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Cañestro og Alfonso Ferrández-Roldán for å dele sin kompetanse på prøvetaking og kulturing. Jai Denton, Charles Plessy og Jeffrey Jolly ga uvurderlige tilbakemeldinger på manuskriptet. Charlotte West formulerte en generalisert ligning for algeberegning. Til slutt takker vi OIST for finansiering, Mary Collins og OIST Fieldwork Safety Committee for råd om trygge prøvetakingsprosedyrer, de ansatte i OIST maskinverksted for bygging av kulturing og prøvetakingsutstyr, og Koichi Toda for å levere sjøvann.

1. O. dioica kultur anlegg
<ol><li>Vannfilter system (Figur 1)<ol>
<li>Samle naturlig sjøvann fra en havn på 2-3 m dybde. Før sjøvannet gjennom et sandfilter (porestørrelse 1,4 mm) og transport til en delt reservoartank i laboratoriet. Bruk et beholderfilter til å sirkulere vannet for å opprettholde vannkvaliteten i den delte reservoartanken.</li>
		<li>I et kulturrom, sett opp et flertrinns filtersystem bestående av en 100 L reservoartank med en magnetisk drivpumpe, 5 μm og 1 μm polypropylen sårpatronfiltre, og en UV-sterilisator (100 V) (Figur 1).</li>
		<li>Overfør sjøvannet fra den delte reservoartanken til kulturrommets reservoartank. Før sjøvannet gjennom en filterenhet på 25 μm (Figur 1A,B) før du går inn i kulturrommets reservoartank. Sirkuler sjøvannet gjennom 5 og 1 μm filtre over natten for å grundig fjerne partikler som potensielt kan hindre utviklingen av dyr. MERK: Et ekstra filter med større nettingstørrelse (25-50 μm) er nyttig for å hindre at større partikler tetter patronfiltrene med mindre nettingstørrelser. Det filtrerte sjøvannet (fSW) er klart til bruk neste morgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Oikopleura kulturing enhet (Figur 2)<ol>
<li>Vedlikehold dyr i 5 eller 10 l runde, gjennomsiktige plastbeger.</li>
		<li>Plasser kulturbeger på en stødig hylle i rustfritt stål med to nivåer (L x W x H = 150 cm x 45 cm x 90 cm) med et 5 mm tykt, gjennomsiktig akryloverflatebord.</li>
		<li>Plasser hvite lysrør under akryloverflaten for å belyse dyrene fra bunnen av begerene.</li>
		<li>Plasser et svart plastark bak begerene. Det svarte arket skaper kontrast og forbedrer visualiseringen av de gjennomsiktige dyrene.</li>
		<li>Koble synkrone elektriske motorer til akryl padleårer (L x H = 8 cm x 27 cm) (Tilleggsfil 2). Suspendere padleårer i kulturbeger fra parallelle skinner som går langs lengden av hylleenheten (Figur 2A).</li>
		<li>Slå på motorene for å generere en mild sirkulær bevegelse i begerglassene ved 15 RPM. MERK: Dyr i sine cellulosehus er nøytralt spenstige; Vannsirkulasjonen bidrar imidlertid til å holde egg, larver og algemat som skal suspenderes og jevnt fordeles i kulturbegerene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Automatisk doseringspumpe (valgfritt) MERK: En automatisk fôringsenhet reduserer bemanningsbehovet, spesielt i helgene.<ol>
<li>Kalibrer volumet av dispenseringsvæske fra en automatisk doseringspumpe i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
		<li>Bruk 50 ml rør som algereservoarer.</li>
		<li>Bor to 5 mm hull på hettene på 50 ml rør for å passere gjennom flyselskapets rør. Koble ett rør til en standard akvariumluftpumpe for å introdusere luftbobler, og det andre røret til innløpsporten til doseringspumpen (Figur 2B). MERK: Innføring av en tynn strøm av luftbobler bidrar til å hindre at alger bosetter seg på undersiden av rørene.</li>
		<li>Programmer tid og volum av algefôr som skal dispenseres på en gitt dag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Algestasjon<ol>
<li>Bruk en hylle (L x B x H = 90 cm x 46 cm x 115 cm) til å plassere fire 1 l runde bunnkolber som inneholder alge arbeidskulturer (se trinn 2.1).</li>
		<li>Belys arbeidskulturene ved å plassere lysrør bak kolbene.</li>
		<li>Forsegle flasker med to-hulls gummipropper.</li>
		<li>Før en 1 ml engangspipette gjennom gummiproppen. Bruk flyselskapets rør til å koble pipetten til en akvariumluftpumpe. Introduser en strøm av luftbobler i kolben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mikroalgal mat
<ol><li>Initiere algekulturer MERK: Opprettholde tre sett med kulturer (lager, sub-, og arbeidskulturer) for tre mikroalgale arter, Chaetoceros kalser , Isochrysis sp., Rhinomonas reticulata, og en art av cyanobakterier, Synechococcus sp.. Lager- og underkulturer brukes som back-ups. Arbeidskulturen brukes til daglig fôring.<ol>
<li>Forbered reagenser som er nødvendige for dyrking av mikroalger og cyanobakterier (Tabell 1).</li>
		<li>For å initiere lagerkultur, autoklav (121 °C, 25 min) 60 – 80 ml fSW i en 100 ml Erlenmeyer kolbe. Aseptisk inokulert spesifisert mengde modifisert Conway medium27 og mikroalger (tabell 2). For eksempel, for å inokulere en lagerkultur av C. kalser, autoklav 60 ml sjøvann, aseptically inokulere 30 μL hver av vitamin og løsning A, 15 μL natriumsilikat, 60 μL streptomycin og 30 μL C. kalsitegn fra forrige lagerkultur. MERK: R. reticulata går fra rødrosa til orangish-brun når den utsettes for for mye lys. Flytt dem bort fra lyset når de har begynt å vende seg fra klar til lys rosa.</li>
		<li>Opprettholde lagerkulturen i en inkubator satt til 17 °C med kontinuerlig belysning. Etter ca. 10 dager endrer kulturen farge for å indikere algevekst (figur 3). Når fargene vises, flytt dem til 4 °C for langtidslagring i opptil 1 måned.</li>
		<li>På en ren benk, aseptically inokulere en underkultur fra lagerkulturen (Tabell 2). Inkuber ved 17 °C med kontinuerlig belysning. Etter alge farger vises, fortsett å lagre dem i inkubatoren opptil 2 uker.</li>
		<li>Inokuler arbeidskultur fra underkultur (Tabell 2). Forsegle kolben med en gummihette og sett inn 1 ml engangspipette. Flytt kolben til algestasjonen og hold den ved romtemperatur med en 8 timers fotoperiode. Forsyning med konstantlufting. Forny arbeidskulturen hver fjerde dag.</li>
		<li>Rør lager og subkulturer to ganger om dagen ved å virvle. MERK: Langsiktig lagring av algekultur på solide medier og kryopreservation er mulig opptil 3 måneder og 1 år, henholdsvis29.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opprette algevekstkurver (valgfritt) MERK: Nøyaktig vurdering av fôringsmengde er viktig for å opprettholde en stabil kultur av O. dioica. Vi skapte vekstkurver for to primære algematarter, Chaetoceros kalser og Isochrysis sp.<ol>
<li>Forbered C. calcitrans og Isochrysis sp. arbeidskulturer (Tabell 2).</li>
		<li>For hver arbeidskultur, prøv tre separate ganger og måle absorbanser ved 660 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Ta de gjennomsnittlige målingene av triplikatet fra hver arbeidskultur.</li>
		<li>Etter produsentens instruksjoner for en automatisert celleteller, forberede algeprøver for telling. Tell hvert utvalg tre ganger. Ta gjennomsnittet av tre tellinger for å bestemme det totale antallet celler som finnes i hver prøve.</li>
		<li>Fortsett å telle daglig til ca. 50 gjennomsnittlige målinger registreres.</li>
		<li>Lag vekstkurver for begge algearter (figur 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Feltsamling av vill Oikopleura spp.
<ol><li>Modifisert planktonnett (figur 5) MERK: Nøkkelen til vellykket prøvetaking av Oikopleura spp. er den langsomme tauingen av et planktonnett med en vektet, ikke-filtrering av torskeende. Figur 5 viser et skjematisk diagram over et modifisert planktonnett.<ol>
<li>Bytt ut torskeenden på et håndholdt planktonnett med en modifisert 500 ml skrueflaske.</li>
		<li>Bor et hull med 3 cm diameter i 4 cm diameter skruetoppen på vaskeflasken for å la vann og dyr komme inn i torskeenden.</li>
		<li>Monter flaskehetten på enden av planktonnettet. Pakk den tett med elektrisk tape. Fest hetten ytterligere med en slangeklemme i rustfritt stål.</li>
		<li>Fest en vekt på 70 g på utsiden av den modifiserte torskeenden med glidelåsbånd.</li>
		<li>Fest sikkerhetsbåndet for å sikre torskeenden ytterligere.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Velge samlingsområder (figur 6) MERK: Alle utvalgssamlinger ble godkjent av OIST Fieldwork Safety Committee. Det kan være sesongvariasjon i tilstedeværelsen av Oikopleura spp. avhengig av plasseringen (Figur 6). Unngå prøvetaking umiddelbart etter ekstreme værhendelser som alvorlige regnstormer.<ol>
<li>Bruk satellittvisningen på et kartnettsted til å identifisere potensielle prøvetakingssteder. Vi fokuserte på havner og fiskebrygger som er lett tilgjengelig med bil og ligger inne i bukter eller i nærheten av havet drop-offs hvor plankton har en tendens til å samle: Ishikawa havn i Kin Bay, Okinawa, Japan (GPS: 26 ° 25'39.3 "N 127 ° 49'56.6 "E).</li>
		<li>Besøk potensielle prøvetakingssteder for å vurdere land tilgjengelighet og sikkerhet for hvert område. Innhente inkassotillatelse fra lokale myndigheter etter behov.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prøvetaking prosedyre<ol>
<li>Kast planktonnettet i sjøen og la torsken synke 1-2 m under vannoverflaten.</li>
		<li>Slep nettet horisontalt for hånd på 50-100 cm s-1. Fortsett å slepe ved å gå frem og tilbake i 2-5 minutter. Juster slepetiden i henhold til overflod av planteplankton i havnen, med kortere slep når det er mer planteplankton. MERK: Larvaceans er skjøre dyr. Rask tauing eller gjentatt støping av nettet kan skade dyr fanget i torskenden.</li>
		<li>Løft forsiktig nettet. Overfør langsomt innholdet i torskeenden til en 500 ml rund glassflaske. Fyll prøveflasken helt med sjøvann for å unngå luftbobler. MERK: Tilstedeværelsen av Oikopleura spp. kan bekreftes ved å se prøveflasker mot en svart bakgrunn. De fleste dyr forlater husene sine mens de samles. Derfor er mikroskopisk observasjon nødvendig for artsnivåidentifikasjon.</li>
		<li>Gjenta prøvetakingen til tre 500 ml flasker samles inn.</li>
		<li>Mål saltholdighet, temperatur og klorofyll ved hjelp av en CTD-profiler for å registrere omfanget av fysiske parametere der dyr naturlig eksisterer.</li>
		<li>Samle 10-15 L overflate sjøvann i en bøtte for å akklimatisere dyr i laboratoriet innstillingen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Dyr isolasjon og identifisering (Figur 7, Figur 8)
<ol><li>
Oikopleura spp. identifikasjon MERK: Andre planktoniske organismer som kan ligne Oikopleura spp. ved første øyekast inkluderer chaetognaths, Fritillaria spp., nematoder, fiske larver med eggeplomme-sacs, og Ciona spp. larver.<ol>
<li>For å akklimatisere dyr til laboratorieforhold, overfør hver 500 ml prøve til et 10 L-beger som inneholder 1:1-forhold av overflatevann fra prøvetakingsstedet og filtrert sjøvann (fSW) som vedlikeholdes i laboratoriet (Figur 7A,B). Juster volumet på begeret til 5-10 L avhengig av konsentrasjonen av planktonprøve. MERK: Hvis planktonprøven inneholder uønsket avfall, må du kjøre gjennom et grovt filter (nettstørrelse ~600 μm) før du overfører til et 10 L-beger.</li>
		<li>Bruk en padle festet til en synkron elektrisk motor (15 RPM) og hold plankton i suspensjon over natten (trinn 1.2.5).</li>
		<li>Identifiser Oikopleura spp. ved å lete etter 1-2 mm lange, rumpetrollformede dyr som bølget halene inne i et sfærisk, gjennomskinnelig hus. Noen dyr kan være midlertidig fritt-svømming uten husene. Overfør forsiktig ~5 dyr til en tom petriskål ved hjelp av en stump pipette.</li>
		<li>For slektsidentifikasjon, kast dyr fra husene sine ved å forsiktig poking huset med en overføring pipette.</li>
		<li>Observer husløse dyr under et 20-40x mørkfeltmikroskop og bekreft Oikopleura spp (Figur 8).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
O. dioica identifikasjon MERK: O. dioica kan visuelt identifiseres ved tilstedeværelse av fullt modne menn og kvinner eller to store subkolrale celler som ligger på den distale halvdelen av halene. Avstanden mellom to subkolidalceller kan variere mellom individer.<ol>
<li>Deretter må du sjekke om det er en fullt moden Oikopleura med en gonad fylt med egg (Figur 8A) eller sperm (Figur 8B). Hvis dyret bare har egg eller sædceller, hopp til trinn 4.2.3 som det er O. dioica, den eneste beskrevne ikke-hermaphroditic arter.</li>
		<li>Hvis dyret er umodent (Figur 8C), se etter to subkolrdale celler på enden av halen (figur 8D).</li>
		<li>Når arten er bekreftet, overfør den til en ny petriskål. Gjenta trinn 4.1.3-4.2.2 til 10-20 personer er bekreftet på artsnivå. MERK: For enklere identifisering, bedøve dyr i en petriskål som inneholder 0,015% trikain metansulfonat (MS222) i fSW.</li>
		<li>Hvis ingen O. dioica er funnet, hold begeret suspendert for en ekstra dag eller to. Det kan være umodne O. dioica som vil fortsette å vokse og bli lettere å bli oppdaget. Hvis ingen vises etter en uke, forkaster du prøven og prøver på nytt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Dyrkingsprotokoll for O. dioica
<ol><li>Initiere en O. dioica monokultur fra et felt innsamlet prøve (Figur 7) MERK: Algal mat tilberedes daglig fra arbeidskulturer, og hvert monokulturbeger mates tre ganger om dagen klokken 09.00, 24.00 og 17.00 (se trinn 5.2). Dyrene opprettholdes ved 23 °C. Under disse forholdene er Okinawa O. dioica livssyklusen 4 dager (Figur 7C).<ol>
<li>For å initiere en monokultur av O. dioica,isolere 120 dyr og overføre til et nytt beger som inneholder 5 L frisk fSW (Figur 7B, C).</li>
		<li>Neste morgen, se etter fullt modne menn med gule gonader og kvinner med egg som vises som gylne kuler (Figur 8A, B).</li>
		<li>Lag et gytebeger ved å forsiktig overføre 15 menn og 30 kvinner til et nytt beger som inneholder 2,5 L frisk fSW med en 5 ml sløv pipette. MERK: Hvis det ikke er nok menn og kvinner, overfør så mange voksne som mulig til et beger som inneholder 1 L fSW og la dem gyte naturlig. For å minimere fysisk stress for dyr under manuell overføring, bør de sakte siphoned og slippes ut under vannoverflaten.</li>
		<li>La dyrene gyte naturlig for å initiere neste generasjon. Tailed larver skal vises ca 3 timer etter befruktning. MERK: Gyting utføres ved å fullt modne dyr forlate husene sine, svømme mot overflatevannet og slippe sine vilt. Vellykket befruktning kan bekreftes ved å trekke ut 5-10 ml sjøvann fra bunnen av gytebegeret og identifisere egg med spalting under et mikroskop.</li>
		<li>På den første morgenen etter gyting (Dag 1), bør en ny generasjon dyr med oppblåste hus vises i begeret. Bruk et håndholdt beger på 500 ml til å overføre innholdet i gytebegeret forsiktig til et nytt beger som inneholder 7,5 L frisk fSW (totalt 10 l). Hell i en vinkel for å unngå en sprutende bevegelse.</li>
		<li>På den andre morgenen (dag 2) overfører du manuelt 150 dyr til et nytt beger som inneholder 5 L frisk fSW.</li>
		<li>På den tredje morgenen (dag 3) overfører du manuelt 120 dyr til et nytt beger med 5 liter frisk fSW. MERK: For å synkronisere utviklingen av dyr, er det viktig å velge personer med lignende størrelser under manuell overføring på dag 2 og 3. Maksimalt 10 dyr kan siphoned i en enkelt overføring.</li>
		<li>På den fjerde morgenen (Dag 4) skal fullt modne dyr vises. Gjenta trinn 5.1.3 for å lukke livssyklusen. MERK: En automatisert fôringspumpe kan settes til å mate dyrene klokken 17.00 i helgene uten tilstedeværelse av kulturing av ansatte.</li>
	</ol></li>
	<li>Daglig fremstilling av algemat fra arbeidskultur<ol>
<li>Mål absorbansen av arbeidskulturen på 660 nm.</li>
		<li>Basert på Daily Feeding Chart, finn ut hvor mange algeceller som må mates for dyrene av bestemt størrelse (Tabell 3).</li>
		<li>Ved hjelp av algevekstkurver (Figur 4), løse ligningene nedenfor for å beregne volumet av algemat (ml) som kreves på en gitt dag.<ol>
<li>Hvis du vil beregne volumet på en bestemt alge som trengs for en bestemt dag og fôringstid, bruker du følgende ligning: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61279/61279equ01.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61279/61279equ02.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61279/61279equ03.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61279/61279equ04.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61279/61279equ05.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61279/61279equ06.jpg"> <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61279/61279equ07.jpg"> Hvor YA er algekonsentrasjonen på en gitt dag og A er volumet av alger som trengs per fôring. Videre vises den lineære relasjonen mellom YA til x, verdiene for avskjæring (c) og helling (m) i figur 4. Se tabell 3 for K-verdier.</li>
			<li>For eksempel, for å beregne volumet av Isochrysis sp. nødvendig ved en 9 AM fôring av dag 3 dyr opprettholdt i en 5 L kultur og med algeabsorbanse på 0,234 (målt ved 660 nm), ble følgende beregnet: <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61279/61279equ08.jpg"> <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61279/61279equ09v3.jpg"> MERK: Lagre disse ligningene i et regneark slik at den daglige fôringsmengden beregnes automatisk basert på absorbansmålinger, størrelsen på dyrene og volumet av kultur sjøvann (Tilleggsfil 1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Overfør det beregnede volumet av alger til 50 ml rør, sentrifuge ved 5000 x g i 5 min ved 20 °C.</li>
		<li>Fjern supernatanten. Fyll rørene tilbake til det opprinnelige volumet med frisk fSW, og utskift gamle algemedier.</li>
		<li>Oppbevar tilberedt mat i kjøleskapet til den er klar til å brukes til neste fôr. Kast den gamle algematen etter at ny mat er tilberedt neste morgen.</li>
	</ol></li>
	<li>Aktivt kull (valgfritt) MERK: 10 g aktivt kull legges til hvert kulturbeger for å opprettholde vannkvaliteten. Kullet kan gjenbrukes opptil fire ganger. Åpne kullposen langsomt for å unngå kullstøv fra å komme inn i kulturbegerene.<ol>
<li>Overfør ~700 g aktivt kull i en beholder. Bløtlegg i ferskvann (FW) i 48 timer og la dem bosette seg på bunnen.</li>
		<li>Skyll med FW for å fjerne restkullstøv.</li>
		<li>Kok kull i FW i 15-20 min. Fjern fra varme og la avkjøles.</li>
		<li>Skyll til det meste av kullstøvet er fjernet, og vannet blir klart.</li>
		<li>Oppbevar rent kull i 2 L beger som inneholder fSW. Dekk begeret for å hindre at støv kommer inn.</li>
		<li>Tilsett trekull til hvert nytt beger før du overfører dyrene.</li>
	</ol></li>
</ol>

Forfatteren har ingenting å erklære.

For å legge til rette for fleksibilitet i etableringen av O. dioica kultur, er det viktig å forstå dyrenes naturlige habitat. Sesongdata gir informasjon om områdene av fysiske parametere, som kan brukes til å veilede laboratoriekulterende forhold. Det bidrar også til å forstå sesongmessige svingninger i overflod av dyr. I Okinawa er O. dioica mest pålitelig funnet fra juni til oktober. Men i Tokyo bay, befolkningen topp i februar og oktober41. Selv om kultering av O. dioica er ofte rapportert ved 20 °C eller lavere27,28,29, Viser Okinawan O. dioica bedre overlevelse ved temperaturer over 20 °C; Dette kan forklares av det faktum at minimum overflate sjøvann temperatur i Okinawa er ~ 20 ° C (Figur 6). Overflod av O. dioica kan også bli påvirket av planteplankton blomstrer42 og rovdyr overflod43,44. Uansett hvor O. dioica samles inn, maksimerer forståelsen av sesongvariasjoner for lokalbefolkningen sjansen for prøvetaking og kulturing suksess.
Gitt riktig sesong og plassering, er netto prøvetaking en effektiv måte å samle et stort antall Oikopleura med minimal innsats. Plankton garn med mindre mesh størrelse (60-70 μm) kan også brukes til å samle alle stadier av dyrene. Helt modne dyr finnes sjelden i nettet, kanskje på grunn av deres skjørhet på slutten av livssyklusen. Derfor oppnås artsidentifikasjon etterfulgt av prøvetaking ved mikroskopisk observasjon av subkolidale celler. Modne individer vises vanligvis en eller to dager etter prøvetaking som dyr fortsetter å vokse i laboratoriet. Selv om netto prøvetaking er effektiv, kan alternative prøvetakingsmetoder være nødvendig under forskjellige omstendigheter. For eksempel kan netto prøvetaking i nærheten av urbane områder samle et stort antall planteplankton, noe som gjør det vanskelig å isolere Oikopleura. I slike tilfeller anbefales enkel bøtteprøvetaking for å samle overflate sjøvann eller båtprøvetaking fra områder utenfor havnen. Resultatene viste at den gradvise endringen i saltholdighet på grunn av påfølgende dager med regn ikke påvirket overflod av O. dioica; Imidlertid bør landprøvetaking umiddelbart etter ekstreme værhendelser som tropiske sykloner unngås. Disse hendelsene forårsaker plutselige og drastiske biogeokjemiske endringer i en skjermet kropp av vann45,46. Avrenning av overvann kan bære forurensende stoffer, sedimenter og overflødige næringsstoffer, noe som øker turbiditeten og lavere vannkvalitet47. Filterfôring plankton, som Oikopleura,kan være spesielt utsatt for disse endringene på grunn av deres fôringsmåte og begrenset mobilitet. I slike tilfeller anbefaler vi å utsette prøvetaking i noen dager til de lokale forholdene går tilbake til det normale.
Innføringen av et flertrinns filtersystem er avgjørende for å opprettholde små, filterfôringsorganismer som O. dioica. Ved hjelp av dårlig filtrert sjøvann (for eksempel et 25 μm nett i det forrige kultursystemet), var kulturen ofte ustabil, spesielt om sommeren, potensielt på grunn av den høyere overfloden av planteplankton. Selv om noen planteplankton er gunstige for O. dioica vekst, andre produserer biotoksiner som kan forårsake unormal utvikling av O. dioica embryoer48. I tillegg er en høy konsentrasjon av diatomer som Chaetoceros spp. potensielt skadelig for O. dioica vekst som de kan ha lange setae som kan tette huset og hindre effektiv fôring49. Vi observerte ofte hus av små dyr som blir tilstoppet av C. calcitrans setae; Derfor fôrer vi nå C. calcitrans bare til dyr på dag 2 og eldre (Tabell 3).
Selv om det ikke var et problem her, kan liten skala langsiktig dyrking av O. dioica oppleve plutselige dråper i befolkningsstørrelse på grunn av en genetisk flaskehals; i slike tilfeller anbefaler Martí-Solans et al.29 å legge til nye ville individer i kulturen hver 20.
Oikopleura kultursystem er fleksibelt. En stabil kultur kan etableres innen en uke. Langsiktig dyrking av O. dioica er mulig på et beskjedent budsjett med ikke-spesialutstyr. Den daglige innsatsen som kreves for vedlikehold av 5-10 beger av Oikopleura er generelt mindre enn 2 timer med 2 personer. O. dioica kan også opprettholdes i kunstig sjøvann, noe som er gunstig for de uten tilgang til naturlig sjøvann28. Langsiktig lagring av algemat er mulig ved hjelp av solid kultur og kryopreservation29. Videre kan O. dioica sperm være cryopreserved, og forbli levedyktig i mer enn et år50. Alle disse faktorene betyr at kulturer lett kan gjenopprettes. Endelig, tidligere erfaring med utilsiktet dyrking av Pleurobrachia sp. kan tyde på at kulturingssystemet utviklet for Oikopleura potensielt kan utvides til et bredere samfunn av skjøre pelagiske organismer.
O. dioica fortsetter å gi kraftig innsikt i ulike biologiske felt. En forståelse av lokal sesongvariasjon, et omhyggelig kultursystem og noen dedikerte individer tillater effektiv kultur å bli etablert med liten innsats. Oikopleura kultursystem gir grunnlinjeressurser for å undersøke et bredt spekter av biologiske felt knyttet til økologi, utvikling, genomikk og utvikling av denne unike marine chordate.

Modellorganismer har vært medvirkende til å ta opp mange biologiske spørsmål, inkludert de som er relatert til utvikling, genetikk og fysiologi. Videre legger flere modellorganismer til rette for nye funn og er derfor avgjørende for å oppnå en større forståelse av naturen1,2. Marine dyreplankton er ulike grupper av organismer som spiller en viktig rolle i havet økosystemer3,4,5,6. Til tross for deres overflod og økologiske betydning, gelatinøse organismer som planktonic tunikatter er ofte underrepresentert i plankton biologisk mangfold studier fordi deres åpenhet og skjørhet gjør feltsamling og identifikasjon utfordrende7,8. Tilpassede prøvetakingsteknikker og laboratoriekulasjoner tillater nærmere observasjon av dyrene in vitro, som har fremmet kunnskapen i biologien til planktoniske tunikaer9,10,11,12.
Larvaceans (Appendicularians) er en klasse av frittsvømming marine tunikaer bestående av rundt 70 beskrevne arter over hele verden8,,13. Siden de er en av de rikeste gruppene i dyreplanktonsamfunn14,,15,16,17,representerer larvaceans en primær matkilde for større planktoniske organismer som fiskelarver18,19. I motsetning til ascidians-sessile tunicates-larvaceans beholde en rumpetroll-lignende morfologi og forbli planktonic gjennom hele livet20. Hvert dyr bor inne i en selvbygd, intrikat filter-fôring struktur kjent som et hus. De samler partikler i sine hus ved å skape vannstrømmer gjennom den bølgende bevegelsen av halene21. Tette hus kastes hele dagen, hvorav noen danner karbonaggregater og til slutt synker til havbunnen22; dermed larvaceans spille en viktig rolle i global karbon flux23. De fleste arter er rapportert å leve i pelagisk sone innenfor de øvre 100 m av vannsøylen13; Imidlertid er den gigantiske larvacean Bathochordaeus kjent for å bebo dypet av 300 m24. En studie på Bathochordaeus i Monterey Bay, California viste at dyrene også tjene som en biologisk vektor av mikroplast, noe som tyder på en potensiell betydning i å forstå rollen som appendicularians i vertikal transport og distribusjon av mikroplast i havene25.
Oikopleura dioica, en art av larvean, har tiltrukket seg oppmerksomhet de siste årene som modellorganisme på grunn av flere bemerkelsesverdige egenskaper. Det rapporteres ofte over hele verdenshavene. Det er spesielt rikelig i kystnære farvann26, noe som gjør det enkelt å prøvetaking fra land. Langsiktig, stabil dyrking er mulig med både naturlig og kunstig sjøvann27,28,29. Temperaturavhengige generasjonstider er så korte som 4-9 dager i laboratorieforhold. Den har høy fecundity med hver kvinne som er i stand til å produsere > 300 egg gjennom hele året. Som en tunikat, opptar det en viktig fylogenetisk posisjon for å forstå chordate evolusjon30,31. Ved 70 Mb har O. dioica det minste identifiserte genomet blant alle chordates32. Blant larver er O. dioica den eneste beskrevne ikke-hermaphroditic arter så langt33.
Den første vellykkede O. dioica kultur med laboratoriedyrket mikroalger ble rapportert av Paffenhöfer34. Den opprinnelige kulturprotokollen ved hjelp av synkrone motorer og padleårer ble utviklet av Fenaux og Gorsky35 og senere vedtatt av flere laboratorier. Mer nylig rapporterte Fujii et al.36 O. dioica culturing i kunstig sjøvann, et robust kultursystem og feltsamling ble beskrevet av Bouquet et al.27 og en optimalisert protokoll for et forenklet, rimelig system ble rapportert av Marti-Solans et al.29. Bortsett fra det tradisjonelle Oikopleura kultursystemet, har en nylig rapportert design med en dobbel rør oppdrettstank også potensial til kultur Oikopleura sp. 37.
Vi presenterer en detaljert protokoll for å initiere en O. dioica monokultur basert på en kombinasjon av protokoller utviklet av store Oikopleura forskningsgrupper ved Sars International Centre for Marine Molecular Biology27,Universitetet i Barcelona29,Osaka University28, og våre egne observasjoner. I tidligere publiserte kulturprotokoller ble detaljert informasjon om sammensetningen av algemedier, landprøvetakingsteknikker og Oikopleura-identifikasjon bare grovt beskrevet, noe som etterlot mye tvetydighet. Her, ved hjelp av visuell informasjon i videoprotokollen, har vi samlet all den kritiske informasjonen som trengs for å sette opp en O. dioica kultur fra grunnen av på en enkel, trinnvis måte. Vi beskriver hvordan man skiller O. dioica fra en annen vanlig rapportert art, O. longicauda, som er et av de mest utfordrende trinnene. Selv om de eksisterende kultursystemene gjelder for dyrking av O. dioica over hele verden, fremhever vi viktigheten av protokolljustering basert på lokale miljøforhold. Den presenterte informasjonen kombinerer mye publiserte data samt kunnskap oppnådd gjennom erfaring. Den nåværende protokollen er ideelt egnet for forskere som er interessert i å etablere en kultur fra bunnen av.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2764-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alluminum pulley</td>
			<td>Rainbow Products</td>
			<td>10604-10607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalamin (B12)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-03682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>039-04412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium edetate hydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon wrench</td>
			<td>Anex</td>
			<td>No.6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>091-00872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jebao programmable auto dosing pump</td>
			<td>Jebao</td>
			<td>DP-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet pump</td>
			<td>REI-SEA</td>
			<td>RMD-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>134-15302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene wound cartridge filter</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>TCW-10N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-5N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-1N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwless terminal block</td>
			<td>SATO PARTS</td>
			<td>SL4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple plankton net</td>
			<td>RIGO, Japan</td>
			<td>5512-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metasilicate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>307815-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-02545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchronous electric motor</td>
			<td>Servo</td>
			<td>D5N6Z15M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamin hydrochloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV sterilizer</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>UVF-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194858</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica

Oikopleura dioica er en planktonisk chordate med eksepsjonell filter-fôring evne, rask generasjon tid, bevart tidlig utvikling, og et kompakt genom. Av disse grunnene regnes det som en nyttig modellorganisme for marine økologiske studier, evolusjonær utviklingsbiologi og genomikk. Ettersom forskning ofte krever en jevn tilførsel av dyreressurser, er det nyttig å etablere et pålitelig, lite vedlikeholdskultursystem. Her beskriver vi en trinnvis metode for å etablere en O. dioica kultur. Vi beskriver hvordan du velger potensielle prøvetakingssteder, innsamlingsmetoder, måldyridentifikasjon og oppsett av kulturingssystemet. Vi gir feilsøkingsråd basert på våre egne erfaringer. Vi fremhever også kritiske faktorer som bidrar til å opprettholde et robust kultursystem. Selv om kulturprotokollen som tilbys her er optimalisert for O. dioica,håper vi at vår prøvetakingsteknikk og kulturoppsett vil inspirere nye ideer for å opprettholde andre skjøre pelagiske virvelløse dyr.

Oikopleura kan hentes fra en båt eller fra en havn ved langsom, skånsom tauing av et 100 μm mesh planktonnett med en ikke-filtrering av torskeende (figur 5). På grunn av dyrenes skjøre natur er det viktig å unngå enhver bevegelse som kan forårsake fysisk stress, for eksempel grov håndtering av nettet eller sprut på grunn av en fanget luftlomme i prøvekrukken.
Det er viktig å forstå sesongmønsteret til lokale Oikopleura-populasjoner, samt de medfølgende svingningene i vannets fysiske egenskaper på et prøvetakingssted. Prøvetaking mellom 2015 og 2019 viste konsistent sesongvariasjon i nærvær av O. dioica i Ishikawa og Kin havner i Okinawa (Figur 6). Overflatevannstemperaturen ser ut til å være en viktig faktor. O. dioica var den dominerende arten når overflate sjøvann nådde ≥ 28 °C, og O. longicauda sameksistert med O. dioica ved temperaturer mellom 24 °C og 27 °C; O. longicauda dominerte imidlertid under 23 °C (figur 6A). Gradvis endring i saltholdighet etter flere påfølgende dager med kraftig regn korrelerte ikke med overflod av O. dioica (Figur 6B).
Ved hjelp av prøvetakingsprosedyrene beskrevet ovenfor, de fleste O. dioica vi gjenopprettet var mellom dag 2 og 3 av deres 4-dagers livssyklus (Figur 7C). Modne menn ble anerkjent av den gule fargen på gonader, mens kvinnelige gonader glitrende gull fra egg som var 70-80 μm i diameter (Figur 8A, B). Umoden O. dioica ble bekreftet av to subkolrdalceller på halen (Figur 8D). En annen dominerende art i de lokale farvannene, O. longicauda,var like i størrelse og morfologi. Vi brukte følgende kriterier for å skille O. longicauda fra O. dioica38,39,40: mangel på subkolrdal celler i halen, tilstedeværelsen av velum i bagasjerommet, og tilstedeværelsen av en hermafroditt gonad ( Figur8E,F). De forskjellige halemorfologiene er også nyttige for å skille O. longicauda fra O. dioica. Når et intakt nakent dyr uten huset ble orientert sidelengs, var halen av O. longicauda mer rett med mindre krumning, noe som gir det et "stivere" utseende i forhold til O. dioica.
De tre viktigste faktorene for å etablere et stabilt Oikopleura kultursystem er (i) opprettholde høy vannkvalitet, (ii) identifisere optimal fôring regime, og (iii) sette opp en gyte beger med tilstrekkelig antall menn og kvinner. Innføringen av et flertrinns filtersystem (Figur 1) forbedret kulturens vannkvalitet og stabilitet. Et filtreringssystem er ikke nødvendig for kunstig sjøvann; Men kostnaden, tilgjengeligheten og bekvemmeligheten av naturlig sjøvann gjør det til et bedre alternativ for laboratorier som ligger nær kysten. For å etablere fôringsregimet anbefaler vi å måle algevekstkurver som gjelder for individuelle laboratorieinnstillinger, siden temperatur- og lysforholdene varierer sterkt. Vi kombinerte vekstkurvene med tidligere publiserte fôringsplaner for å optimalisere algefôrkonsentrasjoner og sammensetninger27 (figur 4). Vi følger også en streng alge inokulasjonsplan for å opprettholde en ny tilførsel av algemat (Tabell 2). Det automatiserte fôringssystemet gjør det mulig for oss å opprettholde en konsekvent daglig fôringsplan uten tilstedeværelse av kulturing av ansatte (Figur 2B).
Når optimale sjøvann og fôringsforhold er oppnådd, er det viktig å initiere nye generasjoner ved å skape et gytebeger med 15 menn og 30 kvinner i 2,5 L fSW. Dette sikrer en god konsentrasjon av dag 1 dyr neste morgen, som er tilstrekkelig til å isolere 150 dyr på dag 2, 120 på dag 3 og 45 modne voksne på dag 4 for gyting. Hvis det ikke er nok menn og kvinner på dag 4, samle og overføre så mange modne individer som mulig til 1 L fSW og la dem gyte naturlig i håp om at det vil være nok larver til å bære på neste generasjon. Etter den medfølgende protokollen er livssyklusen til O. dioica 4 dager ved 23 °C (figur 7C). Vi har pålitelig etablert seks uavhengige ville bestander av O. dioica, som alle varte mer enn 20 generasjoner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61279/61279fig1v2.jpg"> Figur 1: Skjematisk av sjøvannsfiltersystem. - Jeg har ikke noeå gjøre. Sjøvann filtreres først gjennom en 25 μm filterenhet før du går inn i reservoartanken(C) En magnetisk drivpumpe brukes til å trekke sjøvann fra reservoartanken. Sjøvannet skyves deretter gjennom to polypropylenfiltre og en UV-sterilisator før du returnerer til reservoartanken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61279/61279fig1v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61279/61279fig02.jpg"> Figur 2: Kultursystem for O. dioica. (A) Oversikt over kultursystemet (B) Nærbilde av synkron motor- og algereservoar for den automatiserte doseringspumpen. Indre diameter av silisiumrør A og B er henholdsvis 2 mm og 4 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61279/61279fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61279/61279fig03.jpg"> Figur 3: Lagerkulturer for O. dioica. Fra venstre-C. calcitrans, Isochrysis sp., Synechococcus sp., og R. reticulata etter å ha blitt dyrket ved 17 ° C under kontinuerlig lys i ~ 10 dager. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61279/61279fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61279/61279fig4v2.jpg"> Figur 4: Algevekstkurve for to av de store matartene, C. calcitrans og Isochrysis sp.. Scatter tomter av optisk tetthet (OD) ved 660 nm og totale cellekonsentrasjoner for (A) C. kalsaser og (B) Isochrysis sp.. Hvert punkt representerer gjennomsnittet av tre målinger. En celleteller ble brukt til å bestemme prosentandelen av levedyktige celler og totale cellekonsentrasjoner (celler/ml). Målinger ble registrert i 20 dager (n = 47). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61279/61279fig4v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61279/61279fig05.jpg"> Figur 5: Modifisert planktonnett for Oikopleura prøvetaking. Torskeenden på et håndholdt planktonnett (100 μm mesh) erstattes med en 500 ml vaskeflaske. En vekt på 70 g er festet til torskeenden. Ca. 5 m tau er festet til nøkkelringen. Et sikkerhetsbånd er festet for å sikre torskeenden ytterligere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61279/61279fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61279/61279fig6v3.jpg"> Figur 6: Sesongvariasjon av O. dioica i Okinawa. Tilstedeværelse og fravær av O. dioica og O. longicauda i forhold til sesongmessige endringer i (A) temperatur og (B) saltholdighet ved havner i Ishikawa (26°25'39.3"N 127°49'56. 6"E) og Kin (26°26'40.2"N 127°55'00.3"E) mellom 2015-2019. Hver art ble registrert som til stede hvis mer enn 50 dyr ble manuelt talt. Temperatur- og saltholdighetsmålinger av overflatevann ble registrert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61279/61279fig6v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61279/61279fig07.jpg"> Figur 7: Flytskjema for oppstart av O. dioica monokultur. (A) Tre, 500 ml planktonprøver samles inn fra et prøvetakingssted (B) Hver prøvekansle fortynnes og O. dioica er isolert fra resten av plankton(C) En monokultur av O. dioica initieres ved manuell overføring av 120 dag 3 dyr til et nytt beger som inneholder 5 L ferskt filtrert sjøvann (fSW). Sett opp et gytebeger med 30 kvinner, 15 menn og 2,5 L frisk fSW. Den første morgenen etter gytingen (Day1), tøm tett gytebegeret med den nye generasjonen dyr i et beger som inneholder 7,5 L frisk fSW. På den andre dagen etter gyting (dag 2) overfører du 150 dyr til et beger som inneholder 5 L frisk fSW. På den tredje dagen etter gyting (dag 3) overfører du 120 dyr til et beger som inneholder 5 L frisk fSW. På den siste dagen (dag 4), sette opp en ny gytebeger som inneholder 30 kvinner, 15 menn og 2,5 L frisk fSW i utarbeidelsen av neste generasjon. Dyrene har en 4-dagers livssyklus ved 23 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61279/61279fig07large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61279/61279fig08.jpg"> Figur 8: Identifikasjon av Oikopleura spp. (A-D: O. dioica,E og F: O. longicauda). (A) Kvinne O. dioica med egg (B) Male O. dioica med sperm (C) Lateral visning av umoden O. dioica (D) Ventral visning av umodne O. dioica med to subchordal celler indikert med hvite piler (E) Ventral visning av modne O. longicauda bærer egg (pil 1) og sperm (pil 2) (F) Lateral visning av O. longicauda viser velum (pil 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61279/61279fig08large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenser</td>
			<td>Kjemiske produkter</td>
			<td>Beløpet</td>
			<td>Endelig vol. (ml)</td>
			<td>Sterilisering</td>
			<td>Lager / Åpnet</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">Løsning A</td>
			<td>Na 2 EDTA(andre)</td>
			<td>45 g</td>
			<td rowspan="7">1000</td>
			<td rowspan="7">Autoklav</td>
			<td rowspan="7">-20 °C / 4 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nano3 (andre)
</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>H3BO3
</td>
			<td>33,6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2·4H2O</td>
			<td>0,36 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>FeCl3·6H2O</td>
			<td>1,3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Løsning B</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Løsning B</td>
			<td>ZnCl2 (andre)
</td>
			<td>2,1 g</td>
			<td rowspan="5">1000</td>
			<td rowspan="5">Autoklav</td>
			<td rowspan="5">4 °C / 4 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2·6H2O</td>
			<td>2,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>(NH4)6Mo7O24·4H2O</td>
			<td>0,9 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CuSO4·5H2O</td>
			<td>2,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>*HCl (andre)</td>
			<td>-- ml</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Vitamin</td>
			<td>Tiamin (B1) · Hcl</td>
			<td>200 mg</td>
			<td rowspan="3">1000</td>
			<td rowspan="3">Autoklav</td>
			<td rowspan="3">-20 °C / 4 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cobalamin (B12)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumsilikat</td>
			<td>Na 2 Sio3 (Andre)
</td>
			<td>5%</td>
			<td>1000</td>
			<td>0,22 μm filter</td>
			<td>4 °C / 4 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Streptomycin (andre)</td>
			<td>C21H39N7O12
</td>
			<td>25 mg/ml</td>
			<td>50</td>
			<td>0,22 μm filter</td>
			<td>-20 °C / -20 °C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Oppskrift på reagenser som er nødvendige for vedlikehold av algemat. Etter oppløsning av alt kjemikaliet som er oppført for løsning B, tilsettes HCl til løsningen blir klar uten turbiditet. Alle reagensene steriliseres enten ved autoklavering (120 °C, 25 min) eller ved bruk av et 0,22 m filter. Alle reagenser unntatt vitaminlagrene steriliseres etter tilsetning av spesifisert kjemikalie. For vitaminlagrene, autoklaver vannet først, og oppløs deretter det oppførte kjemikaliet. Lagringstemperaturer for lager og åpnede reagenser er oppført.
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kultur type</td>
			<td>Algal spp.</td>
			<td>ASW (ml)</td>
			<td>Vitamin</td>
			<td>Løsning A</td>
			<td>Natriumsilikat</td>
			<td>Streptomycin (andre)</td>
			<td>Alger (ml) / Kulturtype</td>
			<td>Inkubate / Butikk</td>
			<td>Frekvens</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Lagerkultur</td>
			<td>Chaeto (andre)</td>
			<td>60</td>
			<td rowspan="4">1/2000</td>
			<td rowspan="4">1/2000</td>
			<td rowspan="4">1/4000 (Bare Chaeto)</td>
			<td rowspan="4">1/1000 (Alle unntatt Syn)</td>
			<td>0.03 / lager</td>
			<td rowspan="4">17°C / 4°C</td>
			<td rowspan="4">Annenhver uke</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iso</td>
			<td>60</td>
			<td>0.03 / lager</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rhino</td>
			<td>80</td>
			<td>0.06 / lager</td>
		</tr>
<tr>
<td>Syn (andre)</td>
			<td>60</td>
			<td>0.03 / lager</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Underkultur</td>
			<td>Chaeto (andre)</td>
			<td>500</td>
			<td rowspan="4">1/2000</td>
			<td rowspan="4">1/2000</td>
			<td rowspan="4">1/4000 (Bare Chaeto)</td>
			<td rowspan="4">1/1000 (Alle unntatt Syn)</td>
			<td>10 / lager</td>
			<td rowspan="4">17°C / 17°C</td>
			<td rowspan="4">Ukentlig</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iso</td>
			<td>500</td>
			<td>10 / lager</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rhino</td>
			<td>500</td>
			<td>20 / lager</td>
		</tr>
<tr>
<td>Syn (andre)</td>
			<td>500</td>
			<td>10 / lager</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Arbeidskultur</td>
			<td>Chaeto (andre)</td>
			<td>400</td>
			<td rowspan="4">1/2000</td>
			<td rowspan="4">1/2000</td>
			<td rowspan="4">1/4000 (Bare Chaeto)</td>
			<td rowspan="4">1/1000 (Alle unntatt Syn)</td>
			<td>100 / sub</td>
			<td rowspan="4">RM / RM</td>
			<td rowspan="4">Hver fjerde dag</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iso</td>
			<td>400</td>
			<td>100 / sub</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rhino</td>
			<td>400</td>
			<td>150 / sub</td>
		</tr>
<tr>
<td>Syn (andre)</td>
			<td>400</td>
			<td>100 / sub</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Instruksjon for vedlikehold av tre algekulturtyper. Tilsett den angitte mengden kosttilskudd til flasker som inneholder autoklavert sjøvann. Inokuler hver kolbe med spesifisert mengde algekultur. Inkuber og lagre algekulturer ved angitte temperaturer. Inokulere ny aksjekultur og underkultur fra den forrige aksjekulturen, og ny arbeidskultur fra forrige underkultur. Inokulere ny aksjekultur, underkultur og arbeidskultur annenhver uke, en uke og fire dager. Denne tidsplanen gir nok mat til ca 10 beger av O. dioica kultur. Oppretthold 2 – 3 sett av hver algekulturtype som back-ups. RM – romtemperatur.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dag</td>
			<td>Algal spp.</td>
			<td>09:00 og 17:00</td>
			<td>12.00.20</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>Chaeto (andre)</td>
			<td>—</td>
			<td>—</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iso</td>
			<td>1000</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Syn (andre)</td>
			<td>20,000</td>
			<td>40,000</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">2</td>
			<td>Chaeto (andre)</td>
			<td>1000</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iso</td>
			<td>2000</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rhino</td>
			<td>1000</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>Chaeto (andre)</td>
			<td>3000</td>
			<td>4000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iso</td>
			<td>3000</td>
			<td>4000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rhino</td>
			<td>1500</td>
			<td>1500</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">4</td>
			<td>Chaeto (andre)</td>
			<td>1000</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iso</td>
			<td>1000</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rhino</td>
			<td>1000</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: Algekonsentrasjon per fôring- modifisert fra Bouquet et al.27. Algekonsentrasjoner (celle ml-1)og algearter som brukes til daglig fôring i løpet av den 4-dagers livssyklusen til Okinawa O. dioica.
Tilleggsfil 1: Daglig fôringsdiagram. Daglige fôringsmengder for hvert kulturbeger beregnes automatisk etter at de har gått inn i daglige algeabsorpsjonsmålinger (OD), størrelsen på dyrene (dag) og volumet av sjøvann (SW vol.) i hvert kulturbeger. Vekstkurver av R. reticulata og Synechococcus sp. ble tilpasset fra Bouquet et al.27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61279/Supplemental_file1.xls" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 2: Slik kobler du synkron motor til akrylpadling. Skru på padlet godt til motoren ved hjelp av en sekskantnøkkel. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61279/61279supfig01.jpg" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica at JoVE.com

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica er en tunikatmodellorganisme innen ulike biologiområder. Vi beskriver prøvetakingsmetoder, artsidentifikasjon, kulturing oppsett, og kulturing protokoller for dyr og alge feed. Vi fremhever viktige faktorer som bidro til å styrke kultursystemet og diskutere mulige problemer og løsninger.

Strømlinjeformet prøvetaking og dyrking av Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

Denne protokollen demonstrerer visuelt hvordan man etablerer et langsiktig, pålitelig kultursystem for det marine pelagiske tunikate Oikopleura dioica. Oikopleura kultursystem gir grunnlinjeressurser til å undersøke et bredt spekter av biologiske felt knyttet til økologi, utvikling, genomikk og evolusjon. Denne arten har en kort livssyklus, høy fecundity, og det kan lett samles fra land, noe som gjør den til en utmerket modell organisme.Selv om denne protokollen er optimalisert for O.dioica, håper vi den kan brukes på andre planktoniske organismer. Til å begynne med, initiere algemat for å opprettholde Oikopleura kultur, starter ved autoklavering filtrert sjøvann. For å initiere en lagerkultur av Chaetoceros calcitrans, ble 60 mils autoklavet sjøvann supplert med følgende:30 mikroliter av vitaminer, 30 mikroliter løsning A, 15 mikroliter natriumsilikat og 60 mikroliter streptomycin.Til slutt ble 30 mikroliter c.calcitrans fra en tidligere aksjekultur lagt til som et inoculant. Se tabell to i manuskriptet om supplement og inokulasjonsvolumer for de andre algeartene og kulturtypene. Etter inokulasjon opprettholdes bestanden og subkulturene i en inkubator ved 17 grader Celsius med kontinuerlig belysning.Etter ca 10 dager bekreftes algevekst av kolben som blir farget. Når dette skjer, flytt lagerkulturene til langsiktig lagring ved fire grader Celsius i opptil en måned, samtidig som subkulturen opprettholdes i samme inkubator. For å skape en arbeidskultur, legg til nødvendige kosttilskudd til 400 mils autoklavet sjøvann og inokulere med 100 mils av den forrige subkulturen.Forsegle kolben med en gummihette, sett inn en engangspipette med én mil, og flytt dem til en algestasjon og vedlikehold dem ved romtemperatur med en åtte timers fotoperiode og konstant lufting. Virvle algekulturer manuelt to ganger om dagen for å forhindre aggregering nederst i kolben. Når algekulturene er etablert, samler du feltprøver på et lokalt sted.Kast et planktonnett, og la torskeden synke en til to meter under overflaten. Slep nettet med en hastighet på ca 5 til en meter per sekund. Fortsett å slepe frem og tilbake i mellom to og fem minutter.Slepetid bør justeres i henhold til plankton overflod på stedet. Etter slepet løfter du forsiktig ut nettet og overfører sakte innholdet i torsken til en 500-mil glassflaske. Fyll flasken på felgen for å unngå luftbobler som kan forårsake stress for dyrene under transport.På dette stadiet kan tilstedeværelsen av Oikopleura bekreftes ved å se prøveflaskene mot en mørk bakgrunn. Imidlertid er mikroskopisk observasjon nødvendig for identifisering på arternivå. Gjenta denne prosessen til tre 500-mil flasker er samlet inn.Samle overflate sjøvann for å registrere saltholdighet, temperatur, og klorofyll konsentrasjon med en CTD profiler. I tillegg samler du 10 til 15 liter sjøvann på stedet for å akklimatisere dyrene til laboratorieforhold. For å akklimatisere dyrene, lag et en-til-en-forhold mellom overflate sjøvann fra prøvestedet og filtrert sjøvann som vedlikeholdes i laboratoriet.Det endelige volumet bør justeres til mellom fem og 10 liter, avhengig av konsentrasjonen av planktonprøven. Tilsett forsiktig 500-mils prøven til det tilberedte begeret. Bruk en padle ved hjelp av en synkron motor som roterer ved 15 O/min, hold planktonen i suspensjon over natten.Neste morgen, se etter tilstedeværelsen av Oikopleura for øye. Overfør dyrene til en petriskål, og observer under et mørkt mikroskop satt til mellom forstørrelse 20 til 40 ganger for en positiv identifikasjon. Oikopleura karakteriseres som rumpetrollformede dyr som bølgende haler inne i et gjennomsiktig hus.For å bekrefte O.dioica, se etter fullt modne menn med gule gonader eller kvinner med egg. Hvis dyrene er umodne, se etter tilstedeværelsen av to subchordale celler på den distale halvdelen av halen. Disse er til stede hos både modne og umodne dyr.Når arten er bekreftet, overføre dem til en ny petriskål. Gjenta denne prosessen til 10 til 20 individer er bekreftet på artsnivå. Hvis ingen O.dioica er funnet, hold begeret omrøring for en ekstra dag eller to.Små O.dioica som ikke var i utgangspunktet observerbare vil fortsette å vokse og bli lettere å se. Hvis ingen vises etter en uke, forkaster du prøven og prøver å prøveprøve på nytt. For å etablere en monokultur isolerer du 120 O.dioica fra en feltprøve i fem liter filtrert sjøvann.Neste morgen, se etter fullt modne menn identifisert av gule gonader og for kvinner med egg som vises som glitrende, gylne kuler. Forbered et gytebeger ved å forsiktig overføre 15 menn og 30 kvinner med en fem mil, stump pipette til et beger som inneholder 2,5 liter filtrert sjøvann. For å minimere fysisk stress under manuell overføring, slipp sakte dyrene under overflaten av det nye sjøvannet.La isolerte voksne gyte naturlig. Etter gyting kan vellykket befruktning bekreftes ved å trekke ut fem til 10 mil sjøvann fra bunnen av gytebegeret og identifisere egg med spalting under et mikroskop. Den første morgenen etter gyting, dag én, skal en ny generasjon unge dyr med oppblåste hus vises i begeret.Bruk et 500-mils håndholdt beger til å forsiktig overføre dyr til et nytt beger som inneholder 7,5 liter friskt, filtrert sjøvann. Hell sakte innholdet på overflaten for å minimere turbulens og skjærkrefter. Den andre morgenen etter gyting, dag to, manuelt overføre 150 dyr til et nytt beger som inneholder fem liter friskt, filtrert sjøvann.På den tredje morgenen etter gyting, dag tre, manuelt overføre 120 dyr til et nytt beger med fem liter friskt, filtrert sjøvann. Innen den fjerde dagen, seksuelt modne, bør voksne dyr være tilstede. Samle 15 menn og 30 kvinner for et nytt gytebeger med 2,5 liter filtrert sjøvann for å starte neste generasjon.Denne prosessen gjentas og vedlikeholdes for kulturens liv. For å opprettholde en monokultur av O.dioica, tilberedes algemat daglig fra arbeidskulturer. Dyrene blir matet tre ganger om dagen.Forbered daglig mat ved å måle absorbans av arbeidskulturen ved hjelp av et spektrofotometer satt til 660 nanometer. Absorbansverdier, mål o.dioica kulturvolumer og dyrs modenhet plasseres i et forberedt regneark basert på en tidligere bestemt algevekstkurve for å beregne det nøyaktige volumet av alger som kreves for dagens fôring. Pipette de beregnede volumene i 50-mil rør, og sentrifuge på 5, 000g i fem minutter ved romtemperatur.Hell langsomt av overnaturant, og rør forsiktig opp og ned for å gjenopplive pelleted alger. Fyll rørene på originalt volum med friskt, filtrert sjøvann. Basert på det daglige algematediagrammet fra regnearket, må du mate det angitte beløpet til hvert beger ved 9 a.m.12 .m. og 17:.m. En automatisert nedsenderingspumpe kan stilles inn for å mate dyrene klokken 17..m.i helgene uten tilstedeværelse av kultering ansatte. Etter hver fôring, opprettholde forberedt algemat på fire grader Celsius til klar til å brukes til neste fôr. O.dioica kan hentes fra en havn ved den milde tauingen av et modifisert planktonnett utstyrt med 100-mikron mesh og en ikke-filtrering torskende.Prøvetaking mellom 2015 og 19 viste sesongmessig variasjon i tilstedeværelsen av O.dioica i havnene i Okinawa. Overflate sjøvanntemperatur syntes å påvirke tilstedeværelsen av dyrene. O.dioica dominerte når overflatevannstemperaturen var 28 grader eller høyere.O.dioica samkvidet med Oikopleura longicauda ved temperaturer mellom 24 og 27 grader. O.longicauda dominerte imidlertid ved temperaturer under 23 grader. Endringer i saltholdighet korrelerte ikke med overflod av O.dioica.De tre viktigste faktorene for å etablere stabile O.dioica kultursystemer opprettholder høy vannkvalitet med et flertrinns filtreringssystem, identifiserer et optimalt fôringsregime, helst ved å skape algestandardkurver og fremstilling av gytebeger med tilstrekkelig antall menn og kvinner. Etter den angitte protokollen er livssyklusen til O.dioica fire dager ved 23 grader. Vi har pålitelig etablert seks uavhengige populasjoner av O.dioica, som alle varte mer enn 20 generasjoner.Til slutt kan etablering av en stabil kultur av O.dioica gjøres raskt og kostnadseffektivt. Med et riktig oppsett kan en stabil kultur oppnås innen en uke. I forbindelse med sitt lille genom og raske livssyklus gjør dette O.dioica til en kraftig akkordmodell.O.dioica kan vedlikeholdes i både kunstig og naturlig sjøvann. Langsiktig lagring av algemat er mulig ved hjelp av solid kultur og kryopreservation. I tillegg kan O.dioica sperm også kryoserveres og forbli levedyktig i mer enn et år.O.dioica fortsetter å gi kraftig innsikt i ulike biologiske felt. En forståelse av lokal sesongvariasjoner, et omhyggelig kultursystem og noen få dedikerte individer gjør det mulig å etablere effektiv kultur med liten innsats.

Research

JoVE Journal

Environment

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Integrert Feltet Lysimetry og Porewater Prøvetaking for Evaluation of Chemical mobilitet i jordsmonn og Etablert Vegetasjon

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Jordprøver og Isolering av Entomopathogenic nematoder (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Rent Prøvetaking og analyse av elven og elvemunninger Waters for spormetall Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

Modification and Application of a Leaf Blower-vac for Field Sampling of Arthropods

Modifikasjon og anvendelse av en løvblåser-vac for Feltet Prøvetaking av Leddyr

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Protokoll for Microplastics Prøvetaking på havoverflaten og Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Prøvetaking jord i en heterogen forskning Plot

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the ...

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

En nye Portable In Vitro eksponering kassett for Aerosol prøvetaking

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Dyrking av grønne mikroalger boble kolonnen Photobioreactors og analysen for nøytral lipider

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri Uljanin 1884 for Experimental Studies

Dyrking av marine pelagisk Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for eksperimentelle studier

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

Sampling for Estimating Frankliniella Species Flower Thrips and Orius Species Predators in Field Experiments

Sampling for Estimating Frankliniella Species Flower Thrips and Orius Species Predators in Field Experiments

Prøvetaking for estimering Frankliniella arter Flower thrips og Orius arter rovdyr i Field eksperimenter

The western flower thrips, Frankliniella occidentalis (Pergande), is a polyphagous pest that has been spread worldwide. The extensive use of insecticides ...