Name: streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica
Uploaded: 2020-06-16T15:00:00
Duration: 11 min 55 s
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Agradecemos a Garth Ilsley su apoyo en el establecimiento del sistema cultural. Reconocemos las contribuciones de Ritsuko Suyama y Sylvain Guillot a los esfuerzos de muestreo temprano e identificación de especies. Gracias especiales se deben a Hiroki Nishida, Takeshi Onuma y Tatsuya Omotezako por su generoso apoyo y orientación en todas partes, incluyendo el establecimiento inicial del sistema de cultivo local y compartir animales y la cultura microalgal. También agradecemos a Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Cañestro y Alfonso Ferrández-Roldán por compartir su experiencia en muestreo y cultivo. Jai Denton, Charles Plessy y Jeffrey Jolly proporcionaron comentarios invaluables sobre el manuscrito. Charlotte West formuló una ecuación generalizada para el cálculo de algas. Por último, agradecemos a la OIST por su financiación, Mary Collins y el Comité de Seguridad del Trabajo de Campo de la OIST por el asesoramiento sobre procedimientos de muestreo seguros, el personal de la tienda de máquinas OIST para la construcción de equipos de cultivo y muestreo, y Koichi Toda para la entrega de agua de mar.

El autor no tiene nada que declarar.

Para facilitar la flexibilidad en el establecimiento de la cultura O. dioica, es importante entender el hábitat natural de los animales. Los datos estacionales proporcionan información sobre los rangos de parámetros físicos, que se pueden utilizar para guiar las condiciones de cultivo de laboratorio. También ayuda a entender las fluctuaciones estacionales en la abundancia de animales. En Okinawa, O. dioica se encuentra de forma más fiable de junio a octubre. Sin embargo, en la bahía de Tokio, las poblaciones alcanzan su punto máximo en febrero y octubre41. Aunque el cultivo de O. dioica se reporta a menudo a20oC o menos 27,28,29, Okinawa O. dioica muestra una mejor supervivencia a temperaturas superiores a 20 oC; esto podría explicarse por el hecho de que la temperatura mínima del agua de mar superficial en Okinawa es de 20 oC(Figura 6). La abundancia de O. dioica también podría verse influenciada por las floraciones de fitoplancton42 y la abundancia de depredadores43,,44. Independientemente de dónde se recoja O. dioica, entender la estacionalidad de las poblaciones locales maximiza la posibilidad de probar y cultivar el éxito.
Dada la temporada y la ubicación apropiadas, el muestreo neto es una forma eficaz de recolectar un gran número de Oikopleura con el mínimo esfuerzo. Las redes de plancton con un tamaño de malla más pequeño (60-70 m) también se pueden utilizar para recoger todas las etapas de los animales. Los animales completamente maduros rara vez se encuentran en la red, tal vez debido a su fragilidad al final del ciclo de vida. Por lo tanto, la identificación de especies seguida de muestreo se logra mediante la observación microscópica de células subchordal. Los individuos maduros suelen aparecer uno o dos días después del muestreo a medida que los animales continúan creciendo en el laboratorio. Aunque el muestreo neto es eficaz, podrían ser necesarios métodos de muestreo alternativos en diferentes circunstancias. Por ejemplo, el muestreo neto cerca de áreas urbanas puede recoger un gran número de fitoplancton, lo que dificulta aislar Oikopleura. En tales casos, se recomienda un muestreo simple de cubos para recoger el agua de mar superficial o el muestreo de barcos de áreas más allá del puerto. Los resultados mostraron que el cambio gradual en la salinidad debido a días consecutivos de lluvia no afectó a la abundancia de O. dioica; sin embargo, se deben evitar el muestreo en tierra inmediatamente después de eventos climáticos extremos, como ciclones tropicales. Estos eventos causan cambios biogeoquímicos repentinos y drásticos en un cuerpo protegido de agua45,,46. La escorrentía de aguas pluviales puede transportar contaminantes, sedimentos y exceso de nutrientes, que aumentan la turbidez y la menor calidad del agua47. El plancton de alimentación de filtros, como Oikopleura,puede ser especialmente susceptible a estos cambios debido a su modo de alimentación y movilidad limitada. En tal circunstancia, recomendamos posponer el muestreo durante unos días hasta que las condiciones locales vuelvan a la normalidad.
La introducción de un sistema de filtro de varios pasos es esencial para mantener pequeños organismos de alimentación de filtros como O. dioica. Usando agua de mar mal filtrada (por ejemplo, una malla de 25 m en el sistema de cultivo anterior), el cultivo era a menudo inestable especialmente durante el verano, potencialmente debido a la mayor abundancia de fitoplancton. Aunque algunos fitoplancton son beneficiosos para el crecimiento de O. dioica, otros producen biotoxinas que pueden causar el desarrollo anormal de embriones O. dioica 48. Además, una alta concentración de diatomeas como Chaetoceros spp. son potencialmente perjudiciales para el crecimiento de O. dioica, ya que pueden poseer largas setas que pueden obstruir la casa y evitar la alimentación eficiente49. Con frecuencia observamos casas de animales pequeños obstruidos por C. calcitrans setae; por lo tanto, ahora alimentamos C. calcitrans sólo a los animales en el día 2 y mayores(Tabla 3).
Aunque no era un problema aquí, el cultivo a largo plazo a pequeña escala de O. dioica puede experimentar caídas repentinas en el tamaño de la población debido a un cuello de botella genético; en tales casos, Martí-Solans et al.29 recomiendan agregar nuevos individuos salvajes a la cultura cada 20 generaciones.
El sistema de cultivo Oikopleura es flexible. Una cultura estable se puede establecer dentro de una semana. El cultivo a largo plazo de O. dioica es posible con un presupuesto modesto con equipos no especializados. El esfuerzo diario requerido para el mantenimiento de 5-10 vasos de Oikopleura es generalmente menos de 2 horas con 2 personas. O. dioica también se puede mantener en agua de mar artificial, lo que es beneficioso para aquellos que no tienen acceso al agua de mar natural28. El almacenamiento a largo plazo de alimentos de algas es posible utilizando la criopreservación y la criopreservación29. Además, los espermatozoides O. dioica pueden ser crioconservados y permanecer viables durante más de un año50. Todos estos factores significan que las culturas pueden ser fácilmente restablecidas. Finalmente, experiencia pasada con el cultivo accidental de Pleurobrachia sp. puede sugerir que el sistema de cultivo desarrollado para Oikopleura podría extenderse potencialmente a una comunidad más amplia de organismos pelágicos frágiles.
O. dioica continúa proporcionando una poderosa visión de varios campos biológicos. Una comprensión de la estacionalidad local, un sistema de cultura meticuloso y algunos individuos dedicados permiten que la cultura efectiva se establezca con poco esfuerzo. El sistema de cultivo de Oikopleura proporciona los recursos básicos para investigar una amplia gama de campos biológicos relacionados con la ecología, el desarrollo, la genómica y la evolución de este acordeato marino único.

Los organismos modelo han sido fundamentales para abordar muchas cuestiones biológicas, incluidas las relacionadas con el desarrollo, la genética y la fisiología. Además, los organismos modelo adicionales facilitan nuevos descubrimientos y, por lo tanto, son cruciales para lograr una mayor comprensión de la naturaleza1,2. El zooplancton marino son diversos grupos de organismos que desempeñan un papel importante en los ecosistemas oceánicos3,,4,,5,,6. A pesar de su abundancia e importancia ecológica, organismos gelatinosos como los tunicados planctónicos a menudo están subrepresentados en los estudios de biodiversidad de plancton porque su transparencia y fragilidad hacen que la recolección e identificación de campo desafien7,,8. Las técnicas de muestreo adaptadas y el cultivo de laboratorio permiten una observación más estrecha de los animales in vitro, lo que ha favorecido el conocimiento en la biología de los tunicados planctónicos9,,10,,11,,12.
Los larvanos (Apéndices) son una clase de tunicados marinos de natación libre que comprenden alrededor de 70 especies descritas en todo el mundo8,13. Como son uno de los grupos más abundantes dentro de las comunidades de zooplancton14,15,16,17, larvasans representan una fuente de alimento primaria para organismos planctónicos más grandes como larvas de peces18,,19. A diferencia de los ascidios, los tunicados sésiles-larvaceanos conservan una morfología similar al renacuajo y permanecen planctónicos a lo largo de sus vidas20. Cada animal vive dentro de una estructura autoconstruta e intrincada de alimentación de filtros conocida como casa. Acumulan partículas en sus casas creando corrientes de agua a través del movimiento ondulado de sus colas21. Las casas obstruidas se desechan durante todo el día, algunas de las cuales forman agregados de carbono y finalmente se hunden en el fondo marino22; por lo tanto, los larvas desempeñan un papel importante en el flujo de carbono global23. Se informa que la mayoría de las especies viven en la zona pelágica dentro de los 100 m superiores de la columna de agua13; sin embargo, el bathochordaeus larvado gigante es conocido por habitar las profundidades de 300 m24. Un estudio sobre Bathochordaeus en Monterey Bay, California reveló que los animales también sirven como vector biológico de microplásticos, lo que sugiere una importancia potencial en la comprensión del papel de los apéndices en el transporte vertical y la distribución de microplásticos en los océanos25.
Oikopleura dioica,una especie de larvaceano, ha atraído la atención en los últimos años como organismo modelo debido a varias características notables. Se reporta comúnmente en todos los océanos del mundo. Es especialmente abundante en aguas costeras26,lo que permite un fácil muestreo desde la orilla. El cultivo estable a largo plazo es posible con agua de mar natural y artificial27,,28,,29. Los tiempos de generación dependientes de la temperatura son tan cortos como 4-9 días en condiciones de laboratorio. Tiene una alta fecundidad con cada hembra capaz de producir >300 huevos durante todo el año. Como tunicado, ocupa una importante posición filogenética para entender la evolución de los acordes30,,31. A 70 Mb, O. dioica tiene el genoma identificado más pequeño entre todos los acordes32. Entre los larvanos, O. dioica es la única especie no hermafrodita descrita hasta ahora33.
El primer cultivo exitoso de O. dioica con microalgas cultivadas en laboratorio fue reportado por Paffenh-fer34. El protocolo de cultivo original utilizando motores y paletas síncronos fue desarrollado por Fenaux y Gorsky35 y más tarde adoptado por múltiples laboratorios. Más recientemente, Fujii et al.36 informaron que O. dioica cultivaba el cultivo en agua de mar artificial, un sistema de cultivo robusto y la recolección de campo fueron descritos por Bouquet et al.27 y Marti-Solans et al.29informó de un protocolo optimizado para un sistema simplificado y asequible. Aparte del sistema de cultivo tradicional de Oikopleura, un diseño recién reportado con un tanque de cría de doble tubo también tiene el potencial de cultivar Oikopleura sp. 37.
Presentamos un protocolo detallado para iniciar un monocultivo O. dioica basado en una combinación de protocolos desarrollados por los principales grupos de investigación de Oikopleura en el Centro Internacional Sars de Biología Molecular Marina27,la Universidad de Barcelona29,la Universidad de Osaka28y nuestras propias observaciones. En los protocolos de cultivo publicados anteriormente, la información detallada sobre la composición de los medios de algas, las técnicas de muestreo en tierra y la identificación de Oikopleura sólo se describieron aproximadamente, dejando una gran cantidad de ambiguedad. Aquí, con la ayuda de la información visual en el protocolo de vídeo, hemos reunido toda la información crítica necesaria para establecer una cultura O. dioica desde cero de una manera sencilla y paso a paso. Describimos cómo distinguir O. dioica de otra especie comúnmente reportada, O. longicauda, que es uno de los pasos más desafiantes. Aunque los sistemas de cultivo existentes son aplicables para el cultivo de O. dioica en todo el mundo, destacamos la importancia del ajuste del protocolo basado en las condiciones ambientales locales. La información presentada combina datos ampliamente publicados, así como conocimientos adquiridos a través de la experiencia. El protocolo actual es ideal para investigadores interesados en establecer una cultura desde cero.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Activated charcoal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2764-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alluminum pulley</td>
			<td>Rainbow Products</td>
			<td>10604-10607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalamin (B12)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-03682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>039-04412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium edetate hydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexagon wrench</td>
			<td>Anex</td>
			<td>No.6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>091-00872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jebao programmable auto dosing pump</td>
			<td>Jebao</td>
			<td>DP-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet pump</td>
			<td>REI-SEA</td>
			<td>RMD-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>134-15302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene wound cartridge filter</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>TCW-10N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-5N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCW-1N-PPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screwless terminal block</td>
			<td>SATO PARTS</td>
			<td>SL4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple plankton net</td>
			<td>RIGO, Japan</td>
			<td>5512-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metasilicate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>307815-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-02545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6501-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synchronous electric motor</td>
			<td>Servo</td>
			<td>D5N6Z15M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamin hydrochloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV sterilizer</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>UVF-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194858</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined sampling and cultivation of the pelagic cosmopolitan larvacean, oikopleura dioica

Oikopleura dioica es un acordeado planctónico con una capacidad excepcional de alimentación del filtro, tiempo de generación rápida, desarrollo temprano conservado y un genoma compacto. Por estas razones, se considera un organismo modelo útil para estudios ecológicos marinos, biología del desarrollo evolutivo y genómica. Como la investigación a menudo requiere un suministro constante de recursos animales, es útil establecer un sistema de cultivo confiable y de bajo mantenimiento. Aquí describimos un método paso a paso para establecer una cultura O. dioica. Describimos cómo seleccionar posibles sitios de muestreo, métodos de recolección, identificación de animales objetivo y la configuración del sistema de cultivo. Proporcionamos consejos de solución de problemas basados en nuestras propias experiencias. También destacamos los factores críticos que ayudan a sostener un sistema de cultivo sólido. Aunque el protocolo de cultivo proporcionado aquí está optimizado para O. dioica,esperamos que nuestra técnica de muestreo y configuración de cultivo inspire nuevas ideas para mantener otros invertebrados pelágicos frágiles.

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Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica es un organismo modelo de tunicado en diversos campos de la biología. Describimos métodos de muestreo, identificación de especies, configuración de cultivo y protocolos de cultivo para los animales y piensos de algas. Destacamos los factores clave que ayudaron a fortalecer el sistema de cultura y discutir los posibles problemas y resoluciones.

Muestreo y cultivo simplificados del larvato y cordorágico cosmopolitan, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

Este protocolo demuestra visualmente cómo establecer un sistema de cultivo fiable a largo plazo para la tunicada pelágica marina Oikopleura dioica. El sistema de cultivo de Oikopleura proporciona los recursos básicos para investigar una amplia gama de campos biológicos relacionados con la ecología, el desarrollo, la genómica y la evolución. Esta especie tiene un ciclo de vida corto, alta fecundidad, y se puede recoger fácilmente de la orilla, por lo que es un excelente organismo modelo.Aunque este protocolo está optimizado para O.dioica, esperamos que se pueda aplicar a otros organismos planctónicos. Para empezar, inicie alimentos de algas para mantener el cultivo de Oikopleura, comenzando por el autoclaving de agua de mar filtrada. Para iniciar un cultivo de Chaetoceros calcitrans, 60 milésimas de agua de mar autoclaved se complementaron con los siguientes: 30 microlitros de vitaminas, 30 microlitros de solución A, 15 microlitros de silicato de sodio y 60 microlitros de estreptomicina.Finalmente, se añadieron 30 microlitros de C.calcitrans de un cultivo de stock anterior como inoculante. Consulte la tabla dos del manuscrito con respecto a los volúmenes de suplemento e inoculación para las otras especies de algas y tipos de cultivo. Después de la inoculación, el stock y las subculturas se mantienen en una incubadora a 17 grados Centígrados con iluminación continua.Después de aproximadamente 10 días, el crecimiento de algas se confirma por los matraces que se colorean. Cuando esto ocurra, mueva las culturas de stock a un almacenamiento a largo plazo a cuatro grados centígrados durante un mes mientras mantiene la subcultura en la misma incubadora. Para crear un cultivo de trabajo, añadir los suplementos necesarios a 400 mils de agua de mar autoclavada e inocular con 100 mils de la subcultura anterior.Selle el matraz con una tapa de goma, inserte una pipeta desechable de un mil y muévalos a una estación de algas y mantenlos a temperatura ambiente con un fotoperiodo de ocho horas y una aireación constante. Remolino manualmente cultivos de algas dos veces al día para evitar la agregación en la parte inferior del matraz. Una vez que se hayan establecido los cultivos de algas, recoja muestras de campo en un sitio local.Lanzar una red de plancton, y permitir que el extremo del bacalao se hunda de uno a dos metros por debajo de la superficie. Remolque de la red a una velocidad de aproximadamente 5 a un medidor por segundo. Continúe remolcando de ida y vuelta durante entre dos y cinco minutos.El tiempo de remolque debe ajustarse de acuerdo con la abundancia de plancton en el lugar. Después del remolque, levante cuidadosamente la red y transfiera lentamente el contenido del extremo del bacalao a una botella de vidrio de 500 mil. Llene la botella hasta el borde para evitar burbujas de aire que podrían causar estrés a los animales durante el transporte.En esta etapa, la presencia de Oikopleura se puede confirmar viendo las botellas de muestra sobre un fondo oscuro. Sin embargo, se requiere una observación microscópica para la identificación a nivel de especie. Repita este proceso hasta que se hayan recogido tres botellas de 500 mil.Recoja el agua de mar superficial para registrar la salinidad, la temperatura y la concentración de clorofila con un perfilador CTD. Además, recoger de 10 a 15 litros de agua de mar en el lugar para ayudar a aclimatar a los animales a las condiciones de laboratorio. Para aclimatar a los animales, prepare una relación uno a uno de agua de mar superficial del sitio de la muestra y el agua de mar filtrada mantenida en el laboratorio.El volumen final debe ajustarse a entre cinco y 10 litros, dependiendo de la concentración de la muestra de plancton. Agregue cuidadosamente la muestra de 500 mil al vaso de precipitados preparado. Usando una paleta unida a un motor síncrono girando a 15 RPM, mantenga el plancton en suspensión durante la noche.A la mañana siguiente, compruebe la presencia de Oikopleura a simple vista. Transfiera a los animales a un plato de Petri, y observe bajo un microscopio de campo oscuro establecido entre aumento de 20 a 40 veces para una identificación positiva. Oikopleura se caracterizan por animales en forma de renacuajo ondulando sus colas dentro de una casa translúcida.Para confirmar O.dioica, busca machos completamente maduros con gónadas amarillas o hembras con huevos. Si los animales son inmaduros, busque la presencia de dos células subchorálticas en la mitad distal de la cola. Estos están presentes en animales maduros e inmaduros.Una vez confirmada la especie, transfiéralas a un nuevo plato de Petri. Repita este proceso hasta que se hayan confirmado entre 10 y 20 individuos a nivel de especie. Si no se encuentra O.dioica, mantenga el vaso de precipitados revolviendo durante uno o dos días más.Los pequeños O.dioica que inicialmente no eran observables seguirán creciendo y serán más fáciles de ver. Si no aparece ninguno después de una semana, deseche la muestra e intente tomar el muestreo de nuevo. Para establecer un monocultivo, aísle 120 O.dioica de una muestra de campo en cinco litros de agua de mar filtrada.A la mañana siguiente, busca machos completamente maduros identificados por gónadas amarillas y hembras con huevos que aparezcan como esferas doradas brillantes. Preparar un vaso de precipitados mediante la transferencia suave de 15 machos y 30 hembras con una pipeta de cinco mil de punta roma a un vaso de precipitados que contiene 2,5 litros de agua de mar filtrada. Para minimizar el estrés físico durante la transferencia manual, suelte lentamente los animales bajo la superficie del nuevo agua de mar.Permita que los adultos aislados desoven naturalmente. Después del desove, la fertilización exitosa se puede confirmar extrayendo de cinco a 10 mils de agua de mar del fondo del vaso de precipitados e identificando huevos con escotes bajo un microscopio. En la primera mañana después del desove, primer día, una nueva generación de animales jóvenes con casas infladas debe aparecer en el vaso de precipitados.Utilice un vaso de precipitados portátil de 500 mil para transferir suavemente a los animales a un vaso de precipitados nuevo que contenga 7,5 litros de agua de mar fresca y filtrada. Verter lentamente el contenido en la superficie para minimizar las turbulencias y las fuerzas de cizallamiento. En la segunda mañana después del desove, el segundo día, transfiera manualmente 150 animales a un vaso de precipitados nuevo que contenga cinco litros de agua de mar fresca y filtrada.En la tercera mañana después del desove, día tres, transfiera manualmente 120 animales a un nuevo vaso de precipitados con cinco litros de agua de mar fresca y filtrada. Para el cuarto día, los animales adultos sexualmente maduros deben estar presentes. Recoger 15 machos y 30 hembras para un nuevo vaso de desove con 2,5 litros de agua de mar filtrada para iniciar la próxima generación.Este proceso se repite y se mantiene para la vida de la cultura. Con el fin de mantener un monocultivo de O.dioica, los alimentos de algas se preparan diariamente a partir de las culturas de trabajo. Los animales son alimentados tres veces al día.Preparar alimentos diarios midiendo la absorbancia del cultivo de trabajo utilizando un espectrofotómetro establecido en 660 nanómetros. Los valores de absorción, los volúmenes de cultivo de O.dioica objetivo y la madurez animal se colocan en una hoja de cálculo preparada sobre la base de una curva de crecimiento de algas previamente determinada para calcular el volumen exacto de algas necesarias para la alimentación del día. Pipetear los volúmenes calculados en tubos de 50 mil, y centrifugar a 5.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Lentamente verter sobrenadante, y cuidadosamente pipetear hacia arriba y hacia abajo para resuspender las algas peletadas. Rellene los tubos a su volumen original con agua de mar fresca y filtrada. Basado en la tabla diaria de alimentación de algas de la hoja de cálculo, alimentar la cantidad especificada a cada vaso de precipitados a 9 a.m.12 p.m. y 5 p.m. Se puede configurar una bomba dosificadora automatizada para alimentar a los animales a las 5 p.m.los fines de semana sin la presencia de personal de cultivo. Después de cada alimentación, mantenga los alimentos de algas preparados a cuatro grados centígrados hasta que estén listos para ser utilizados para el próximo alimento. O.dioica se puede recoger de un puerto mediante el suave remolque de una red de plancton modificada equipada con malla de 100 micras y un extremo de bacalao sin filtrado.El muestreo entre 2015 y 19 mostró variación estacional en presencia de O.dioica en los puertos de Okinawa. La temperatura del agua de mar superficial parecía influir en la presencia de los animales. O.dioica dominó cuando la temperatura del agua de mar superficial era de 28 grados o más.O.dioica coexistió con Oikopleura longicauda a temperaturas entre 24 y 27 grados. Sin embargo, O.longicauda dominó a temperaturas inferiores a 23 grados. Los cambios en la salinidad no se correlacionaron con la abundancia de O.dioica.Los tres factores más importantes para establecer sistemas estables de cultivo de O.dioica son el mantenimiento de una alta calidad del agua con un sistema de filtración de varios pasos, identificando un régimen de alimentación óptimo, preferiblemente mediante la creación de curvas estándar de algas, y la preparación de vasos de desove con un número suficiente de machos y hembras. Siguiendo el protocolo proporcionado, el ciclo de vida de O.dioica es de cuatro días a 23 grados. Hemos establecido de forma fiable seis poblaciones independientes de O.dioica, todas las cuales duraron más de 20 generaciones.En conclusión, el establecimiento de una cultura estable de O.dioica se puede hacer de manera rápida y rentable. Con una configuración adecuada, se puede lograr una cultura estable dentro de una semana. Junto con su pequeño genoma y ciclo de vida rápido, esto hace de O.dioica una poderosa especie modelo de acordeado.O.dioica se puede mantener tanto en agua de mar artificial como natural. El almacenamiento a largo plazo de alimentos de algas es posible utilizando cultivo sólido y criopreservación. Además, los espermatozoides O.dioica también pueden ser crioconservados y permanecer viables durante más de un año.O.dioica continúa proporcionando una poderosa visión de varios campos biológicos. Una comprensión de la estacionalidad local, un sistema de cultura meticuloso y algunos individuos dedicados permiten que la cultura efectiva se establezca con poco esfuerzo.

Research

JoVE Journal

Environment

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Lysimetry Integrado de campo y toma de muestras de agua intersticial para la Evaluación de la Movilidad de Química en Suelos y Vegetación Establecido

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Investigación

Medio ambiente

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Muestreo de suelos y aislamiento de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

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