Name: culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis
Uploaded: 2020-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Fakultetets Udviklingsfond og Summer Research Program tilskud på Saint Mary's College of California. Forfatterne vil også gerne takke Dr. Pamela Lein ved University of California i Davis og Dr. Anthony Iavarone på UC Berkeley Mass spektrometri facilitet for deres råd under udviklingen af disse protokoller. Forfatterne vil også gerne takke Haley Nelson i Office of College Communications på Saint Mary's College of California for hendes hjælp med videoproduktion og redigering.

Alle forsøg udført i undersøgelser, der involverer dyr blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Saint Mary's College of California. Retningslinjerne for dyrepleje og -anvendelse på Saint Mary's College blev udviklet på grundlag af de retningslinjer, der blev fastsat af Office of Laboratory Animal Welfare ved National Institute for Health (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf and https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laborato...

<ol>
	<li>Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+Changes+in+the+neuritic+growth+cone+and+target+neuron+during+synaptic+junction+development+in+culture.">Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture.</a> Journal of Cell Biology. 9, (1976).</li><li>Chandrasekaran, V., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Dendritogenesis+in+Sympathetic+Neurons.">Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons.</a> Autonomic Nervous System. , (2018).</li><li>Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neuronal+polarity.">Mechanisms of neuronal polarity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).</li><li>Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Extracellular+Matrix+And+Osteogenic+Protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons.">The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).</li><li>Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-2+and+retinoic+acid+induce+neurotrophin-3+responsiveness+in+developing+rat+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons.</a> Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).</li><li>Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+the+survival+and+response+to+nerve+growth+factor+of+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons.</a> Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).</li><li>Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlstr&#246;m, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+light+chain+and+synaptotagmin+I+in+rat+sympathetic+neurons.">Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).</li><li>Harris, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Guidance+by+a+Decellularized+Fibroblast+Extracellular+Matrix.">Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix.</a> Matrix Biology. , 176-189 (2017).</li><li>Wingerd, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4+integrins+and+vascular+cell+adhesion+molecule-1+play+a+role+in+sympathetic+innervation+of+the+heart.">&#945;4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart.</a> Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+autonomic+neurons.">Tissue culture of autonomic neurons.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture.</a> Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).</li><li>Voyvodic, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+dendrites+in+the+rat+superior+cervical+ganglion.">Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).</li><li>Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Responses+of+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons+during+BMP-7-Induced+Dendritic+Growth.">Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth.</a> PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).</li><li>Pravoverov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+Necessary+for+BMP-7-induced+Dendritic+Growth+in+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons.">MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).</li><li>Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitative+analyses+of+microRNAs+located+in+the+distal+axons+of+sympathetic+neurons.">Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons.</a> RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).</li><li>Aschrafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+mediates+the+axonal+trafficking+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+&#946;-hydroxylase+mRNAs+and+enhances+norepinephrine+synthesis+in+primary+sympathetic+neurons.">Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine &#946;-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).</li><li>Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).</li><li>Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+is+localized+to+the+dendrites+of+hippocampal+neurons+which+develop+in+culture.">MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture.</a> Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).</li><li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER+version+11:+Expanded+annotation+data+from+Gene+Ontology+and+Reactome+pathways,+and+data+analysis+tool+enhancements.">PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).</li><li>Chandrasekaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+the+morphological+development+of+sympathetic+neurons.">Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons.</a> Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).</li><li>Courter, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7-induced+dendritic+growth+in+sympathetic+neurons+requires+p75+NTR+signaling.">BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling.</a> Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).</li><li>Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+Autonomic+and+Enteric+Neurons.">Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+isolation+and+culture+of+mouse+embryonic+motoneurons.">Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+device+for+co-culture+of+sympathetic+neuron+and+iPS-derived+cardiomyocytes.">Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes.</a> Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+semi-separated+co-culture+system+of+sympathetic+neuron+and+cardiomyocyte.">Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte.</a> Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).</li><li>Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+are+involved+in+BMP-induced+dendritic+growth+in+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).</li><li>Kim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+decrease+dendritic+arborization+in+rat+sympathetic+neurons+by+blocking+RhoA+activation.">Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+Primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Szpara, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+during+neurite+outgrowth+and+regeneration.">Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration.</a> BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).</li><li>Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rapigest+efficacy+for+the+digestion+of+proteins+from+cell+cultures+and+heart+tissue.">Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue.</a> Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).</li><li>Vit, O., Petrak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+proteins+in+proteomics.+How+to+break+open+the+black+box.">Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box.</a> Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).</li></ol>

Dette papir beskriver protokollerne for dyrkning sympatiske neuroner fra overlegen livmoderhalskræft ganglier af embryonale rotte hvalpe. Fordelene ved at bruge denne model system er, at det er muligt at opnå en homogen population af neuroner giver en lignende reaktion på vækstfaktorer, og da vækstfaktoren krav til disse neuroner har været godt karakteriseret, er det muligt at dyrke disse neuroner in vitro i definerede medier, under serum-fri betingelser10. Selv om protokollen beskriver proc...

Sympatiske neuroner afledt af embryonale overensne cervikale ganglier (SCG) har været meget udbredt som en primær neuronal kultur system til at studere mange aspekter af neuronal udvikling, herunder vækstfaktor afhængighed, neuron-target interaktioner, neurotransmitter signalering, axonal vækst, dendrite udvikling og plasticitet, synaptogenesis og signalering mekanismer underliggende nerve-target/neuron-glia interaktioner1,,2,,3,4,5,6,7,8,9. På trods af deres lille størrelse (ca. 10000 neuroner/ ganglier), er der tre hovedårsager til udviklingen og omfattende brug af dette kultursystem er i) er den første ganglier i den sympatiske kæde, de er større, og derfor lettere at isolere, end resten af den sympatiske ganglia10; ii) i modsætning til centrale neuroner, neuroner i SCG er temmelig homogen med alle de neuroner, der stammer fra den neurale våbenskjold, der har en lignende størrelse, afhængighed af nerve vækstfaktor og er heller ikke-adrenerge. Dette gør dem til en værdifuld model for morfologiske og genomiskeundersøgelser 10,11 og iii) disse neuroner kan opretholdes i et defineret serumfrit medium, der indeholder nervevækstfaktor i over enmåned 10,12. Perinatal SCG neuroner er blevet flittigt brugt til at studere de mekanismer, der ligger til grund for initiering og vedligeholdelse af dendritter2. Dette skyldes primært, selv om SCG neuroner har en omfattende dendritisk arbor in vivo, de ikke udvide dendritter in vitro i mangel af serum, men kan induceres til at vokse dendritter i nærvær af visse vækstfaktorer såsom knogle morfoogenetiske proteiner2,12,13.
Dette papir beskriver protokollen for isolering og dyrkning embryonale rotte SCG neuroner. I løbet af de sidste 50 år har primære neuronale kulturer fra SCG hovedsagelig været anvendt til morfologiske undersøgelser med et begrænset antal undersøgelser, der undersøger de store genomiske eller proteomiske forandringer. Dette skyldes hovedsagelig lille vævsstørrelse, hvilket resulterer i isolering af små mængder DNA eller protein, hvilket gør det vanskeligt at udføre genomiske og proteomiske analyser af disse neuroner. Men i de seneste år, øget påvisning følsomhed har gjort det muligt at udvikle metoder til at undersøge genom, miRNome og proteome i SCG neuroner under dendritisk vækst udvikling14,15,16,17. Dette papir vil også beskrive metoden til morfologisk analyse af disse neuroner ved hjælp af immunokytokemi og en protokol til at opnå neuronal protein ekstrakter til massespektrometrisk analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2D nanoACQUITY</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>354-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200, 140675, 142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine- &#946;- D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126609</td>
			<td>20 mg/mL stock in low glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps Dumont no.4 and no.5</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>5621, 5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and Scissors for Dissection</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1328, 1329, 5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverlips - 12mm</td>
			<td>Neuvitro Corporation</td>
			<td>GG-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media for glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36931, P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor</td>
			<td>Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)</td>
			<td>BT5017</td>
			<td>Stock 125 &#956;g/mL in 0.2% Prionex in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>P1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prionex</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>529600</td>
			<td>10% solution, 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001861</td>
			<td>5 X 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro acetic acid - Sequencing grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td>10 X 1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega or NEB</td>
			<td>V511A, P8101S</td>
			<td>100 &#956;g or 5 X 20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186000385c</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis

Sympatiske neuroner fra embryonale rotte overlegen cervikal ganglier (SCG) er blevet brugt som en in vitro model system for perifere neuroner til at studere axonal vækst, axonal handel, synaptogenesis, dendritisk vækst, dendritisk plasticitet og nerve-target interaktioner i co-kultur systemer. Denne protokol beskriver isolering og dissociation af neuroner fra den overlegne cervikale ganglier af E21 rotte embryoner, efterfulgt af forberedelse og vedligeholdelse af ren neuronal kulturer i serum-fri medium. Da neuroner ikke overholder ubestrøget plast, neuroner vil blive dyrket på enten 12 mm glas coverslips eller 6-brønd plader belagt med poly-D-lysin. Efter behandling med et antimitotisk middel (Ara-C, cytosin β-D-arabinofuranoside) genererer denne protokol sunde neuronale kulturer med mindre end 5% ikke-neuronale celler, som kan vedligeholdes i over en måned in vitro. Selv om embryonale rotte SCG neuroner er multipolære med 5-8 dendrites in vivo; under serumfrie forhold strækker disse neuroner kun en enkelt aknoson i kulturen og fortsætter med at være unipolar under hele kulturen. Men, disse neuroner kan induceres til at udvide dendritter i overværelse af kælderen membran ekstrakt, knogle morfoogenetiske proteiner (BMPPs), eller 10% føtal kalv serum. Disse homogene neuronale kulturer kan anvendes til immunokokemisk farvning og til biokemiske undersøgelser. Dette papir beskriver også optimeret protokol for immunokyokemisk farvning for mikrotubule associeret protein-2 (MAP-2) i disse neuroner og til fremstilling af neuronal ekstrakter til massespektrometri.

Isolering og vedligeholdelse af neuronale kulturer af embryonale SCG neuroner Dissocierede celler fra rotte embryonale SCG blev belagt i en poly-D-lysin belagt plade eller coverslip og vedligeholdes i serum fri kultur medier, der indeholder b-nerve vækstfaktor. De dissocierede celler, der indeholder en blanding af neuroner og gliaceller, ser cirkulære ud ved plettering (figur 1A). Inden for 24 timer efter plating, neuronerne udvide små axonale processer med gliaceller ...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis at JoVE.com

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Dette papir beskriver isolation og dyrkning af embryonale rotte sympatiske neuroner fra den overlegne livmoderhalskræft ganglier. Det giver også detaljerede protokoller for immunokytokemiske farvning og til forberedelse af neuronale ekstrakter til massespektrometrisk analyse.

Culturing Rotte sympatiske neuroner fra Embryonic Superior Cervical Ganglia for morfologisk og proteomisk analyse

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

I denne video vil vi demonstrere dyrkning af embryonale rotter'superior cervikale ganglier for morfologiske og proteomic analyse. Før dissektionen påbegyndes, skal du forberede kontrol- og dissektionsmedier. Kontrolmedium indeholder F-12 og lavglose DMEM suppleret med en insulin-selen-transferrin blanding, glutamin, nerve vækstfaktor, og BSA.Dissektion medium indeholder L-15 suppleret med pen-strep og BSA. Se manuskriptet til detaljerede protokoller til medieforberedelse. Forberedelse af plader til dyrkning neuroner.En lak fra poly-D-lysin fortyndes med 100 mikrogram pr. milliliter med sterilt destilleret vand. Til proteomisk eller genomisk analyse, en til to dage før dissektion, pels seks-brønd plader med ca. to milliliter sterile 100 gram pr. milliliter poly-D-lysin. Dette er nødvendigt for at sikre celle vedhæftning til brønden.Wrap pladerne med plastfolie og opbevar pladerne natten over ved fire grader Celsius. På dissektionsdagen fjernes poly-D-lysinopløsningen fra brøndene, før dissektionens begyndelse påbegyndes, og brøndene skylles fem gange med sterilt destilleret vand efterfulgt af dmem med lavt glukose. Under enzymatisk fordøjelse af ganglier, cirka en time før plating cellerne, aspirere DMEM fra pladerne og erstatte det med 0,3 milliliter kontrol medium.Opbevar pladerne ved 35 grader Celsius under 5% CO2 i et befugtet kammer. I hætten, oprette følgende elementer til dissektion. Fire 50 milliliter sterile koniske rør med omkring 20 milliliter dissektionsmedier i hvert rør.Fire sterile 35 millimeter retter med 1,5 milliliter dissektionsmedier. Et sterilt 50 milliliter konisk rør med 20 milliliter dissektionsmedier til centrifugering. Et 15 milliliter sterilt konisk rør til centrifugering af ganglier, et sterilt 10 milliliterrør til opsamling af de dissocierede celler.Brug en tør perler sterilisator til at sterilisere et par fine kraftforstænder i mindst et minut. Alle procedurer udført i undersøgelser, der involverer dyr blev godkendt af Den Institutionelle Animal Care and Use Udvalg på Saint Mary's College of California. De dyrepleje og brug retningslinjer på Saint Mary's College of California blev udviklet baseret på retningslinjer fra Office of Laboratory Animal Welfare på National Institutes for Health.Fjernelse af E21-embryoner fra den drægtige rotte. Bemærk, at fjernelse af livmoderhornet kan udføres uden for hætten, hvis det omgivende område er grundigt steriliseret. Aflive en drægtige rotte med CO2 indånding.Forskydning pelsen fra maveregionen og tør huden i området med 70% alkohol for at sterilisere det. Ved hjælp af et nyt sæt sterile saks og scepinter, skæres gennem huden og derefter musklen til at udsætte livmoderhorn, der indeholder embryoner. Fjern livmodershornet med embryonerne ved hjælp af et nyt sæt saks og spinces, og pas på ikke at beskadige tarmene i processen.Overfør livmoderhornet med embryonerne i 150 millimeter steril petriskål og overfør dem i emhætten. Ved hjælp af et nyt sæt af snævler og saks, fjerne embryoner fra livmoderen horn og adskille embryoner fra fosterhinderne og moderkagen. For at aflive embryonerne skal embryonerne skæres i rygmarven langs midterlinjen under højre arm.Dette vil reducere blødningen fra halspulsåren under fjernelse af SCG. Disse embryoner overføres til de tilberedte koniske rør med 50 milliliter, der indeholder dissektionsmedier. Sørg for, at embryonerne er nedsænket i medierne.Hvert rør kan rumme op til tre embryoner. Isolering af den overlegne cervikal ganglion fra fosteret. Overfør en hvalp fra dissektionsmediet på en steril 150 millimeter petriskål, der er halvt fyldt med massivt underlag med dens dorsale overflade på underlaget.Brug tre sterile 23 gauge nåle, pin pubben til fadet med en nål under hver arm og en tredje nål gennem munden til omhyggeligt hyperextend halsen. Skær gennem huden i halsregionen ved hjælp af sterile fine hændebånd til at udsætte spytkirtlerne nedenunder. Fjern disse kirtler ved hjælp af fine stakt.Find sternocleidomastoid og omohyoid muskler nær kravebenet og luftrør henholdsvis. Først skæres de tværgående sternocleidomastoid muskler. Og derefter omhyggeligt skære den tynde omohyoid muskel ved hjælp af fine scet.Når disse muskler er fjernet, bifurcation i halspulsåren på den forreste ende, vil være synlig på begge sider af luftrøret med SCG placeret under denne gaffel i halspulsåren. Ved hjælp af lukkede snæv, løft forsigtigt halspulsåren for at visualisere SCG. Brug en kraftbecer på hver side af SCG, trække sig ud carotis og overføre den til den forberedte sterile 35 millimeter retter.Dette væv vil højst sandsynligt indeholde SCG med halspulsåren, vagus nerve med løkken ganglier, samt andre segmenter af muskler eller fedt i området. Gentag dissektionsprocessen på den anden side. Fjern SKUL'er fra alle embryoner, før du fortsætter med de resterende beskrevne dissektionstrin.Fordel det isolerede væv mellem to af de 35 millimeter retter for at lette behandlingen af vævsprøverne. Efterbehandling af SCG. For at adskille SCG fra det dissekerede væv skal du først bruge fine kraftafføringer til at fjerne uvedkommende væv, såsom muskel eller fedt, idet du skal passe på at undgå området nær carotisbifurcation.Når disse væv er blevet fjernet, to ganglier er synlige. Den nodose ganglion er mindre og cirkulær, mens SCG er mandel formet. Træk forsigtigt i vagusnerven for at adskille vagusnerven og de nye ganglier fra halspulsen og derefter adskille SCG fra halspulsåren.Brug fine vicess til at fjerne kapslen, der omgiver SCG. Overfør SCG til en ny 35 millimeter kulturret. Gentag denne proces med alle de dissekeret vævsprøver.Coat en steriliseret, bomuld-tilsluttet glas pipette med dissektion medier for at forhindre vævet i at holde sig til pipetten vægge. Brug pipetten til at erstatte dissektionsmediet med sterile to milliliter kollagentype II, dispase type II i calcium- og magnesiumfri HBSS og inkuberes i 50 minutter ved 37 grader Celsius for at hjælpe med at nedbryde vævene. Bemærk, at inkubationstider kan være nødvendigt at optimere med forskellige partier af kollagenase / dispase og normalt spænder fra 40 minutter til en time.Efter inkubationen overføres SKG'erne og kollagen/dispase til et sterilt konisk rør på 15 milliliter. Brug dissektionsmediet til at skylle pladerne og overføre opløsningen til røret. Tilsæt nok dissektionsmedier til at bringe lydstyrken op på ca. 10 milliliter.Centrifuge ved 200 x g, 1, 000 til 1, 200 omdr./min. i fem minutter ved stuetemperatur for at pille prøven. Inspirer supernatanten, og pas på ikke at løsne pellet. Opsplit pellet med 10 milliliter dissektionsmedier, gentag centrifugering og kassér supernatanten.Udskift med en til to milliliter kulturmedium. Ved hjælp af en smal-boring, bøjet-tip steril Pasteur pipette, pre-coat det med kultur medium, mekanisk adskille klumper ved forsigtigt triturating fem til seks gange. Lad de større klumper nøjes med ca. et minut og overfør supernatantcelleaffjedringen til et nyt 10 milliliterrør.Gentag denne proces tre gange mere med stigende kraft af trituration hver gang for at sikre næsten fuldstændig dissociation af S SCGs. Overfør supernatanten efter hver runde af triturationen til 10 milliliterrøret med supernatanten fra den første trituration. Tilføj nok kultur medier til at bringe lydstyrken til otte til 10 milliliter.Bland forsigtigt en celle suspension og kvantificere celletætheden med et hæmocytometer. Fordel cellesuspensionen i brøndene ved den relevante celletæthed for forsøgene. Bland celleaffjedringen kontinuerligt under plating-processen for at sikre en jævn fordeling af cellerne i brøndene.Til morfologisk analyse plade cellerne omkring 8, 000 celler pr. brønd i en 24-brønd plade. Og for genomiske og proteomiske protokoller, plade cellerne så højt som 30, 000 celler per brønd. Overfør pladerne til en glaseksiccator med sterilt vand i bunden for at skabe et befugtet kammer.Der skal injiceres nok CO2, ca. 120 milliliter, til at opnå et 5 % CO2-miljø i ekssiccatoren, før der forsegles. Vedligehold pladerne ved 35,5 grader Celsius. Dette kaldes dag nul i protokollen.Disse plader kan også vedligeholdes i en almindelig 5% CO2 inkubator. Den metode, der er beskrevet ovenfor, minimerer temperatur- og pH-ændringer og hjælper også med at forhindre krydskontaminering. Vedligeholdelse af de kultiverede SCG neuroner og behandlinger.Disse billeder viser dissociated superior livmoderhalskræft ganglier celler på dag nul, dag ét, og dag fem. Dags nulbilledet viser cellerne ved plettering. De celler, der er belagt på dag nul, indeholder en blanding af både neuronale og ikke-neuronale celler.På dag et, 24 timer efter plating, forsigtigt fjerne halvdelen af kulturmediet og erstatte med to mikromolar Ara-C, cytosin D-arabinofuranoside, en anti-mitotisk middel. Lad behandlingen være på cellerne i 48 timer. Normalt denne længde af behandlingen er tilstrækkelig til at fjerne ikke-neuronal celler i kulturen.På dag tre, forsigtigt aspirere halvdelen af mediet og erstatte med kontrol medium. På dag fire er cellerne klar til eksperimentelle behandlinger. Feed kulturer hver anden dag med det relevante medie.Forsigtigt erstatte halvdelen af mediet i brønden med frisk medium. Billedet på dag fem viser omfattende axonal vækst uden dendritiske vækst observeret. For at fremkalde dendritisk vækst kan neuroner dyrkes på Matrigel eller behandles med 10% serum eller 50 nanogram pr. milliliter knoglemorfogenetisk protein-7.Figur to viser ændringer i neuronal morfologi af E21 rotte SCG neuroner efter behandling med BMP-7. Repræsentative fase kontrast mikrografer ved 10 X forstørrelse viser den cirkulære neuronale celle krop med axoner i kontrol neuroner i panel A, og neuroner med flere korte dendrite-lignende processer, når de behandles med BMP-7 vist ved pilene i panelet B.Kulturskullede SCG neuroner efter passende behandlinger kan anvendes til morfologisk analyse ved hjælp af immunoktokemisk farvning til genomisk analyse og til biokemiske undersøgelser , f.eks. til proteomiske analyser. Der henvises til manuskriptet for detaljerede protokoller for immunstaining og prøveforberedelse til proteomisk analyse.Figur tre viser immunstaining fra MAP-2 protein i dyrkede embryonale rotter sympatiske neuroner. Paneler A til D viser dyrkede SCG neuroner behandlet med kontrolmedier og paneler E til H viser neuroner behandlet med BMP-7 ved 50 nanogram pr. milliliter i fem dage. Repræsentative mikrografer, der udviser immunokokemisk farvning af neuronerne med mikrotubule associeret protein-2 i C og G en nuklear plet i D og H med fase kontrast mikrografer i B og F, og opstår af de tre kanaler i A og D.Immunocytokemiske farvning fra mikrotubule associeret protein-2 er til stede i cellen kroppen og proksimale axoner af kontrol neuroner i panel C.And farvning fra MAP-2 protein i cellen kroppen , og dendritter i BMP-7 behandlede neuroner er i panel G.Here er en prøve køre af overlegne livmoderhalskræft ganglier behandlet med kontrol medier, som detekterede 1, 100 proteiner.Gen ontologi ved hjælp af Panther databasen fandt, at de fleste af de proteiner var cytoplasmatisk. Der var dog membranbundne proteiner og proteiner ved cellekryds i prøven. Denne analyse afslørede også, at proteiner, der er involveret i en bred vifte af neuronal signalering veje blev påvist i prøven.Afslutningsvis, efter at have set denne video, bør du være i stand til at isolere og kultur rotte embryonale overlegen halsbør neuroner for morfologiske og proteomiske analyse. Dette arbejde blev finansieret af fakultetet udvikling fond og sommer forskningsprogram på Saint Mary's College of California.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Autonomic Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovaskulære Støbning af Voksen Mouse til 3D Imaging og morfologisk analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Fremkalde dendritisvækst i dyrkede sympatiske neuroner

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Produktion og Isolering af Axoner fra sensoriske neuroner for Biokemisk Analyse Brug porøse filtre

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

En Metode til knudrede Ganglier Injection i Sprague-Dawley Rat

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Diffusion Imaging i Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Funktionel og Morfologisk vurdering af Membran innervation af phrenic Motor neuroner

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens og Bioluminescens Imaging af Subcellulær Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampusneuroner

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...