Name: culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis
Uploaded: 2020-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Faculty Development Fund en Summer Research Program subsidie aan Saint Mary's College of California. De auteurs willen ook dr. Pamela Lein aan de Universiteit van Californië in Davis en Dr. Anthony Iavarone aan de UC Berkeley Mass spectrometrie faciliteit bedanken voor hun advies tijdens de ontwikkeling van deze protocollen. De auteurs willen haley Nelson ook bedanken in het Office of College Communications aan het Saint Mary's College of California voor haar hulp bij videoproductie en -bewerking.

Alle procedures uitgevoerd in studies met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) op Saint Mary's College of California. De richtlijnen voor dierverzorging en -gebruik van het Saint Mary's College zijn ontwikkeld op basis van de richtlijnen van het Office of Laboratory Animal Welfare van het National Institute for Health (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf en https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-La...

<ol>
	<li>Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+Changes+in+the+neuritic+growth+cone+and+target+neuron+during+synaptic+junction+development+in+culture.">Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture.</a> Journal of Cell Biology. 9, (1976).</li><li>Chandrasekaran, V., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Dendritogenesis+in+Sympathetic+Neurons.">Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons.</a> Autonomic Nervous System. , (2018).</li><li>Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neuronal+polarity.">Mechanisms of neuronal polarity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).</li><li>Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Extracellular+Matrix+And+Osteogenic+Protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons.">The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).</li><li>Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-2+and+retinoic+acid+induce+neurotrophin-3+responsiveness+in+developing+rat+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons.</a> Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).</li><li>Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+the+survival+and+response+to+nerve+growth+factor+of+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons.</a> Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).</li><li>Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlstr&#246;m, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+light+chain+and+synaptotagmin+I+in+rat+sympathetic+neurons.">Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).</li><li>Harris, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Guidance+by+a+Decellularized+Fibroblast+Extracellular+Matrix.">Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix.</a> Matrix Biology. , 176-189 (2017).</li><li>Wingerd, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4+integrins+and+vascular+cell+adhesion+molecule-1+play+a+role+in+sympathetic+innervation+of+the+heart.">&#945;4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart.</a> Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+autonomic+neurons.">Tissue culture of autonomic neurons.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture.</a> Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).</li><li>Voyvodic, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+dendrites+in+the+rat+superior+cervical+ganglion.">Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).</li><li>Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Responses+of+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons+during+BMP-7-Induced+Dendritic+Growth.">Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth.</a> PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).</li><li>Pravoverov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+Necessary+for+BMP-7-induced+Dendritic+Growth+in+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons.">MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).</li><li>Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitative+analyses+of+microRNAs+located+in+the+distal+axons+of+sympathetic+neurons.">Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons.</a> RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).</li><li>Aschrafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+mediates+the+axonal+trafficking+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+&#946;-hydroxylase+mRNAs+and+enhances+norepinephrine+synthesis+in+primary+sympathetic+neurons.">Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine &#946;-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).</li><li>Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).</li><li>Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+is+localized+to+the+dendrites+of+hippocampal+neurons+which+develop+in+culture.">MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture.</a> Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).</li><li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER+version+11:+Expanded+annotation+data+from+Gene+Ontology+and+Reactome+pathways,+and+data+analysis+tool+enhancements.">PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).</li><li>Chandrasekaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+the+morphological+development+of+sympathetic+neurons.">Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons.</a> Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).</li><li>Courter, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7-induced+dendritic+growth+in+sympathetic+neurons+requires+p75+NTR+signaling.">BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling.</a> Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).</li><li>Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+Autonomic+and+Enteric+Neurons.">Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+isolation+and+culture+of+mouse+embryonic+motoneurons.">Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+device+for+co-culture+of+sympathetic+neuron+and+iPS-derived+cardiomyocytes.">Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes.</a> Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+semi-separated+co-culture+system+of+sympathetic+neuron+and+cardiomyocyte.">Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte.</a> Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).</li><li>Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+are+involved+in+BMP-induced+dendritic+growth+in+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).</li><li>Kim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+decrease+dendritic+arborization+in+rat+sympathetic+neurons+by+blocking+RhoA+activation.">Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+Primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Szpara, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+during+neurite+outgrowth+and+regeneration.">Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration.</a> BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).</li><li>Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rapigest+efficacy+for+the+digestion+of+proteins+from+cell+cultures+and+heart+tissue.">Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue.</a> Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).</li><li>Vit, O., Petrak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+proteins+in+proteomics.+How+to+break+open+the+black+box.">Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box.</a> Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).</li></ol>

Dit artikel beschrijft de protocollen voor het kweken van sympathische neuronen van superieure cervicale ganglia van embryonale rattenpups. De voordelen van het gebruik van dit model systeem zijn dat het mogelijk is om een homogene populatie van neuronen die een vergelijkbare reactie op groeifactoren te verkrijgen, en aangezien de groeifactor eisen voor deze neuronen is goed gekarakteriseerd, is het mogelijk om deze neuronen groeien in vitro in gedefinieerde media, onder serum-vrije omstandigheden10</su...

Sympathische neuronen afgeleid van embryonale superieure cervicale ganglia (SCG) zijn op grote schaal gebruikt als een primaire neuronale cultuur systeem voor het bestuderen van vele aspecten van de neuronale ontwikkeling, waaronder groeifactor afhankelijkheid, neuron-target interacties, neurotransmitter signalering, axonale groei, dendriet ontwikkeling en plasticiteit, synaptogenese en signalering mechanismen die ten grondslag liggen aan nerve-target / neuron-glia interacties1,2,3,,4,5,6,7,8,9. Ondanks hun kleine omvang (ongeveer 10000 neuronen / ganglia), zijn er drie belangrijke redenen voor de ontwikkeling en uitgebreid gebruik van dit cultuursysteem zijn i) zijn de eerste ganglia in de sympathieke keten, ze zijn groter, en dus gemakkelijker te isoleren, dan de rest van de sympathieke ganglia10; ii) in tegenstelling tot centrale neuronen, de neuronen in de SCG zijn vrij homogeen met alle neuronen worden afgeleid van de neurale kam, met een vergelijkbare grootte, afhankelijkheid van zenuwgroei factor en wordt noch-adrenerge. Dit maakt ze een waardevol model voor morfologische en genomische studies10,11 en iii) deze neuronen kunnen worden gehandhaafd in een gedefinieerd serum-vrij medium met zenuwgroeifactor voor meer dan een maand10,12. Perinatale SCG neuronen zijn op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de initiatie en het onderhoud van dendrieten2. Dit komt vooral omdat, hoewel SCG neuronen hebben een uitgebreide dendritische prieel in vivo, ze niet uit te breiden denndrites in vitro in de afwezigheid van serum, maar kan worden geïnduceerd om denndrites groeien in aanwezigheid van bepaalde groeifactoren zoals bot morfogenetische eiwitten2,12,13.
Dit artikel beschrijft het protocol voor het isoleren en kweken van embryonale rat SCG neuronen. In de afgelopen 50 jaar zijn primaire neuronale culturen van de SCG voornamelijk gebruikt voor morfologische studies met een beperkt aantal studies die de grootschalige genomische of proteomische veranderingen onderzoeken. Dit is voornamelijk te wijten aan kleine weefselgrootte resulterend in de isolatie van lage hoeveelheden DNA of eiwit, waardoor het moeilijk is om genomische en proteomische analyses uit te voeren op deze neuronen. In de afgelopen jaren heeft de toegenomen detectiegevoeligheid echter de ontwikkeling van methoden mogelijk gemaakt om het genoom, miRNome en proteoom in de SCG-neuronen te onderzoeken tijdens de dendritische groeiontwikkeling14,15,16,17. Dit document zal ook de methode beschrijven voor morfologische analyse van deze neuronen met behulp van immunocytochemie en een protocol om neuronale eiwitextracten te verkrijgen voor massaspectrometrische analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2D nanoACQUITY</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>354-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200, 140675, 142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine- &#946;- D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126609</td>
			<td>20 mg/mL stock in low glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps Dumont no.4 and no.5</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>5621, 5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and Scissors for Dissection</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1328, 1329, 5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverlips - 12mm</td>
			<td>Neuvitro Corporation</td>
			<td>GG-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media for glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36931, P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor</td>
			<td>Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)</td>
			<td>BT5017</td>
			<td>Stock 125 &#956;g/mL in 0.2% Prionex in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>P1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prionex</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>529600</td>
			<td>10% solution, 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001861</td>
			<td>5 X 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro acetic acid - Sequencing grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td>10 X 1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega or NEB</td>
			<td>V511A, P8101S</td>
			<td>100 &#956;g or 5 X 20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186000385c</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis

Sympathische neuronen van de embryonale rat superieure cervicale ganglia (SCG) zijn gebruikt als een in vitro model systeem voor perifere neuronen om axonale groei, axonale handel, synaptogenese, dendritische groei, dendritische plasticiteit en zenuw-doel interacties in co-cultuur systemen te bestuderen. Dit protocol beschrijft de isolatie en dissociatie van neuronen van de superieure cervicale ganglia van E21 rat embryo's, gevolgd door de voorbereiding en het onderhoud van zuivere neuronale culturen in serum-vrij medium. Aangezien neuronen zich niet houden aan ongecoat plastic, neuronen zullen worden gekweekt op 12 mm glazen coverslips of 6-well platen bekleed met poly-D-lysine. Na behandeling met een antimitotisch middel (Ara-C, cytosine β-D-arabinofuranoside), genereert dit protocol gezonde neuronale culturen met minder dan 5% niet-neuronale cellen, die meer dan een maand in vitro kunnen worden gehandhaafd. Hoewel embryonale rat SCG neuronen multipolair zijn met 5-8 dendrieten in vivo; onder serumvrije omstandigheden breiden deze neuronen slechts één axon in de cultuur uit en blijven unipolair voor de duur van de cultuur. Echter, deze neuronen kunnen worden geïnduceerd om dendrieten uit te breiden in de aanwezigheid van kelder membraan extract, bot morfogenetische eiwitten (BMPs), of 10% foetale kalf serum. Deze homogene neuronale culturen kunnen worden gebruikt voor immunocytochemische kleuring en voor biochemische studies. Dit artikel beschrijft ook geoptimaliseerd protocol voor immunocytochemische kleuring voor microtubuli geassocieerde eiwit-2 (MAP-2) in deze neuronen en voor de voorbereiding van neuronale extracten voor massaspectrometrie.

Het isoleren en onderhouden van neuronale culturen van embryonale SCG-neuronen Gescheiden cellen van de rat embryonale SCG werden verguld in een poly-D-lysine gecoate plaat of coverslip en onderhouden in serum vrije kweekmedia met b-zenuw groeifactor. De gescheiden cellen met een mengsel van neuronen en gliacellen zien er cirkelvormig uit op beplating(figuur 1A). Binnen 24 uur na beplating breiden de neuronen kleine axonale processen uit met gliacellen die afvlakken en fa...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis at JoVE.com

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Dit artikel beschrijft de isolatie en het kweken van embryonale rat sympathische neuronen van de superieure cervicale ganglia. Het biedt ook gedetailleerde protocollen voor immunocytochemische kleuring en voor de voorbereiding van neuronale extracten voor massaspectrometrische analyse.

Culturing Rat Sympathische Neuronen van Embryonale Superior Cervicale Ganglia voor morfologische en proteomische analyse

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

In deze video zullen we de culturing van de superieure cervicale ganglia van embryonale ratten demonstreren voor morfologische en proteomische analyse. Bereid de controle- en ontledingsmedia voor voordat u met de dissectie begint. Controlemedium bevat F-12 en lage glucose DMEM aangevuld met een insuline-selenium-transferrine mengsel, glutamine, zenuwgroeifactor, en BSA.Dissectiemedium bevat L-15 aangevuld met pen-strep en BSA. Raadpleeg het manuscript voor gedetailleerde protocollen voor de voorbereiding van de media. Voorbereiding van platen voor het kweken van neuronen.Verdun een milligram per milliliter voorraad poly-D-lysine tot 100 microgram per milliliter met steriel gedestilleerd water. Voor proteomische of genomische analyse, een tot twee dagen voor de dissectie, jas zes-put platen met ongeveer twee milliliter steriele 100 gram per milliliter van poly-D-lysine. Dit is nodig om te zorgen voor celhechting aan de put.Wikkel de platen met plakfolie en bewaar de platen 's nachts op vier graden Celsius. Op de dag van de dissectie, vóór het begin van de dissectie, verwijder de poly-D-lysineoplossing uit de putten en spoel de putten vijf keer af met steriel gedestilleerd water, gevolgd door één keer met een lage glucose DMEM. Tijdens de enzymatische vertering van de ganglia, ongeveer een uur voor het platbeteren van de cellen, de DMEM van de platen aanzuigen en vervangen door 0,3 milliliter controlemedium.Bewaar de platen op 35 graden Celsius onder 5%CO2 in een bevochtigde kamer. In de kap, het opzetten van de volgende items voor dissectie. Vier 50 milliliter steriele conische buizen met ongeveer 20 milliliter dissectiemedia in elke buis.Vier steriele 35 millimeter schotels met 1,5 milliliter dissectiemedia. Een steriele 50 milliliter conische buis met 20 milliliter dissectie media voor centrifugatie. Een 15 milliliter steriele conische buis voor het centrifugeren van de ganglia, een steriele 10 milliliter buis voor het verzamelen van de gescheiden cellen.Gebruik een droge kralen sterilisator om een paar fijne tangen steriliseren voor ten minste een minuut. Alle procedures uitgevoerd in studies met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee op Saint Mary's College of California. De richtlijnen voor dierverzorging en -gebruik van het Saint Mary's College of California zijn ontwikkeld op basis van richtlijnen van het Office of Laboratory Animal Welfare van de National Institutes for Health.Verwijdering van E21 embryo's van de zwangere rat. Merk op dat het verwijderen van de baarmoeder hoorn kan worden uitgevoerd buiten de kap als de omgeving grondig wordt gesteriliseerd. Euthanaseer een zwangere rat met CO2-inademing.Schuif de vacht uit de buikstreek en veeg de huid in het gebied af met 70% alcohol om het te steriliseren. Met behulp van een verse set steriele scharen en tangen, snijd door de huid en vervolgens de spier om de baarmoeder hoorns met de embryo's bloot te stellen. Verwijder de baarmoederhoorn met de embryo's, met behulp van een nieuwe set schaar en tangen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de darmen in het proces niet worden beschadigd.Breng de baarmoederhoorn met de embryo's in 150 millimeter steriele petrischaal en breng ze over in de kap. Verwijder met behulp van een nieuwe set tangen en scharen de embryo's uit de baarmoederhoorn en scheid de embryo's van de vruchtwatermembranen en de placenta. Om de embryo's te euthanaseren, snijd het ruggenmerg van de embryo's langs de middellijn onder de rechterarm.Dit vermindert het bloeden van de halsslagader tijdens het verwijderen van de SCG. Breng deze embryo's over in de bereide 50 milliliter conische buizen met dissectiemedia. Zorg ervoor dat de embryo's in de media worden ondergedompeld.Elke buis kan maximaal drie embryo's bevatten. Isolatie van het superieure cervicale ganglion van het embryo. Breng een pup van de dissectiemedia over op een steriele petrischaal van 150 millimeter half gevuld met massief substraat met zijn dorsale oppervlak op het substraat.Met behulp van drie steriele 23 meter naalden, pin de pub aan de schotel met een naald onder elke arm en een derde naald door de mond om zorgvuldig hyperextend de nek. Snijd door de huid in het nekgebied met behulp van steriele fijne tangen om de speekselklieren eronder bloot te leggen. Verwijder deze klieren met behulp van fijne tangen.Zoek de sternocleidomastoïde en omohyoïde spieren in de buurt van respectievelijk het sleutelbeen en de luchtpijp. Snijd eerst de dwarse sternocleidomastoïde spieren door. En snijd vervolgens voorzichtig de dunne omohyoïde spier met fijne tangen.Zodra deze spieren zijn verwijderd, zal de splitsing in de halsslagader aan het voorste uiteinde zichtbaar zijn aan weerszijden van de luchtpijp met de SCG onder deze vork in de halsslagader. Til met gesloten tangen voorzichtig de halsslagader op om de SCG te visualiseren. Met behulp van een tang aan weerszijden van de SCG, trek de halsslagader en breng het naar de bereide steriele 35 millimeter gerechten.Dit weefsel zal waarschijnlijk bevatten de SCG met de halsslagader, de nervus vagus met de nodose ganglia, evenals andere segmenten van spier of vet in het gebied. Herhaal het dissectieproces aan de andere kant. Verwijder SGT's uit alle embryo's voordat u verdergaat met de resterende beschreven dissectiestappen.Verdeel de geïsoleerde weefsels over twee van de 35 millimeter schotels om de verwerking van de weefselmonsters te vergemakkelijken. Nabewerking van de SCG. Om de SCG te scheiden van het ontleed weefsel, eerst gebruik maken van fijne tangen om eventuele vreemde weefsels te verwijderen, zoals spier of vet, het verzorgen van het gebied in de buurt van de halsslagader te vermijden.Zodra deze weefsels zijn verwijderd, zijn twee ganglia zichtbaar. De nodose ganglion is kleiner en cirkelvormig, terwijl de SCG amandelvormig is. Trek voorzichtig aan de nervus vagus om de nervus vagus en de nodose ganglia van de halsslagader te scheiden en vervolgens de SCG te scheiden van de halsslagader.Gebruik fijne tangen om de capsule die SCG omringt te verwijderen. Breng de SCG over op een nieuw 35 millimeter kweekschotel. Herhaal dit proces met alle ontleed weefselmonsters.Bedek een gesteriliseerde, met katoen aangesloten glazen pipet met ontledingsmedia om te voorkomen dat het weefsel zich aan de pipetwanden vastkleven. Gebruik de pipet om de dissectiemedia te vervangen door steriele twee milliliter collagenase type II, dispase type II in calcium- en magnesiumvrije HBSS en 50 minuten uit te broeden bij 37 graden Celsius om de weefsels af te breken. Houd er rekening mee dat de incubatietijden mogelijk moeten worden geoptimaliseerd met verschillende batches collagenase/dispase en meestal varieert van 40 minuten tot een uur.Breng na de incubatie de SGT's en collagenase/dispase over naar een steriele conische buis van 15 milliliter. Gebruik de dissectiemedia om de platen te spoelen en de oplossing over te brengen naar de buis. Voeg voldoende dissectiemedia toe om het volume op ongeveer 10 milliliter te brengen.Centrifuge bij 200 x g, 1.000 tot 1, 200 tpm gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om het monster te pelleteren. Aspirate de supernatant, het verzorgen van niet verjagen van de pellet. Resuspend de pellet met 10 milliliter dissectie media, herhaal de centrifugatie en gooi de supernatant.Vervang door een tot twee milliliter cultuurmedium. Met behulp van een smal-bore, gebogen-tip steriele Pasteur pipet, pre-coat het met cultuur medium, mechanisch scheiden van de klonten door zachtjes triturating vijf tot zes keer. Laat de grotere klonten genoegen nemen met ongeveer een minuut en breng de supernatant celsuspensie over naar een nieuwe 10 milliliter buis.Herhaal dit proces nog drie keer met toenemende kracht van trituratie elke keer om te zorgen voor bijna volledige dissociatie van de SCGs. Breng de supernatant na elke ronde van trituratie naar de 10 milliliter buis met de supernatant van de eerste trituratie. Voeg genoeg cultuurmedia toe om het volume op acht tot 10 milliliter te brengen.Meng voorzichtig een celsuspensie en kwantificeer de celdichtheid met een hemocytometer. Verdeel de celsuspensie in de putten bij de aangewezen celdichtheid voor de experimenten. Meng de celsuspensie voortdurend tijdens het beplatingsproces om een gelijkmatige verdeling van cellen in de putten te garanderen.Voor morfologische analyse, plaat de cellen rond 8,000 cellen per put in een 24-put plaat. En voor genomische en proteomische protocollen, plaat de cellen zo hoog als 30,000 cellen per put. Breng de platen over op een glazen desiccator met steriel water aan de onderkant om een bevochtigde kamer te creëren.Injecteer voldoende CO2, ongeveer 120 milliliter, om een 5%CO2-omgeving in de desiccator te verkrijgen, voorafgaand aan het afdichten. Houd de platen op 35,5 graden Celsius. Dit wordt in het protocol dag nul genoemd.Deze platen kunnen ook worden onderhouden in een reguliere 5%CO2 incubator. De hierboven beschreven methode minimaliseert temperatuur- en pH-veranderingen en helpt ook kruisbesmetting te voorkomen. Onderhoud van de gekweekte SCG neuronen en behandelingen.Deze foto's tonen de gescheiden superieure cervicale ganglia cellen op dag nul, dag een, en dag vijf. De dag nul beeld toont de cellen bij beplating. De cellen verguld op dag nul bevatten een mengsel van zowel neuronale als niet-neuronale cellen.Op dag een, 24 uur na beplating, voorzichtig verwijderen van de helft van de cultuur media en vervangen door twee micromolar Ara-C, cytosine D-arabinofuranoside, een anti-mitotische agent. Laat de behandeling 48 uur op de cellen staan. Meestal is deze lengte van de behandeling voldoende om niet-neuronale cellen in de cultuur te elimineren.Op dag drie, zachtjes aspirate de helft van het medium en vervangen door controlemedium. Op dag vier zijn de cellen klaar voor experimentele behandelingen. Voer culturen om de andere dag met het juiste medium.Voorzichtig vervangen van de helft van het medium in de put met vers medium. Het beeld op dag vijf laat een grote axonale groei zien zonder dendritische groei. Om dendritische groei te induceren, kunnen neuronen worden gekweekt op Matrigel of worden behandeld met 10% serum of 50 nanogram per milliliter botmorfogenetisch eiwit-7.Figuur twee toont veranderingen in neuronale morfologie van E21 rat SCG neuronen na behandeling met BMP-7. Representatieve fase contrastmicrografen bij 10 X vergroting tonen de cirkelvormige neuronale cel lichaam met axonen in de controle neuronen in paneel A, en neuronen met meerdere korte denddrite-achtige processen wanneer behandeld met BMP-7 aangetoond door de pijlen in paneel B.Gekweekt SCG neuronen na passende behandelingen kunnen worden gebruikt voor morfologische analyse met behulp van immunocytochemische vlekken voor genomische analyse en voor biochemische studies , zoals voor proteomische analyses. Raadpleeg het manuscript voor gedetailleerde protocollen voor immunostaining en monstervoorbereiding voor proteomische analyse.Figuur drie toont immunostaining van MAP-2 eiwit in gekweekte embryonale ratten sympathische neuronen. Panelen A tot en met D tonen gekweekte SCG-neuronen behandeld met controlemedia en panelen E via H tonen neuronen behandeld met BMP-7 met 50 nanogram per milliliter gedurende vijf dagen. Representatieve micrografen die immunocytochemische kleuring van de neuronen met microtubuli geassocieerde eiwit-2 in C en G tonen, een nucleaire vlek in D en H met fase contrast micrografen in B en F, en ontstaan van de drie kanalen in A en D.Immunocytochemische kleuring van microtubuli geassocieerde eiwit-2 is aanwezig in het cellichaam en proximale axoons van de controle neuronen in paneel C.And kleuring van MAP-2 eiwit in het cellichaam , en dendrieten in BMP-7 behandelde neuronen is in paneel G.Hier is een monster run van superieure cervicale ganglia behandeld met controle media, die 1, 100 eiwitten gedetecteerd.Gen ontologie met behulp van de Panther database bleek dat de meeste van de eiwitten waren cytoplasmatisch. Er waren echter membraangebonden eiwitten en eiwitten op cellulaire knooppunten in het monster. Deze analyse toonde ook aan dat eiwitten die betrokken zijn bij een breed scala van neuronale signalering trajecten werden gedetecteerd in het monster.Tot slot, na het bekijken van deze video, moet je in staat zijn om te isoleren en cultuur rat embryonale superieure cervicale ganglion neuronen voor morfologische en proteomische analyse. Dit werk werd gefinancierd door het facultaire ontwikkelingsfonds en het zomeronderzoeksprogramma van Saint Mary's College of California.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Autonomic Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Fysiologische, morfologische en neurochemische Karakterisering van neuronen gemoduleerd door Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia Tissue volgende axonale schade

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovasculaire Gieten van de volwassen muis voor 3D Imaging en morfologische analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Het induceren van dendritische groei in gekweekte sympathische neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Productie en isolatie van axonen van sensorische neuronen voor Biochemische analyse met behulp van poreuze filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Een methode van knobbelige ganglia Injectie in Sprague-Dawley rat

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Diffusion Imaging in het Rat ruggenmerg

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Functionele en morfologische beoordeling van Diafragma Innervatie door diafragma Motor Neuronen

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescentie en Bioluminescentie beeldvorming van Subcellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged hippocampus Neuronen

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...