Name: culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis
Uploaded: 2020-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis at JoVE.com

この研究は、カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの教員開発基金とサマーリサーチプログラム助成金によって支援されました。著者らはまた、カリフォルニア大学デービス校のパメラ・レイン博士とUCバークレー質量分析施設のアンソニー・イアバロン博士に、これらのプロトコルの開発中に助言を求めて感謝したいと考えています。著者らはまた、ビデオ制作と編集に関する彼女の助けのためにカリフォルニア州セントメアリーズカレッジのカレッジコミュニケーションズオフィスのヘイリー・ネルソンに感謝したいと思います。

動物を含む研究で行われたすべての手順は、カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。セントメアリーズカレッジの動物ケアと使用ガイドラインは、国立衛生研究所(https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdfおよびhttps://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf)の動物福祉研究所が提供するガイドラ...

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	<li>Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+Changes+in+the+neuritic+growth+cone+and+target+neuron+during+synaptic+junction+development+in+culture.">Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture.</a> Journal of Cell Biology. 9, (1976).</li><li>Chandrasekaran, V., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Dendritogenesis+in+Sympathetic+Neurons.">Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons.</a> Autonomic Nervous System. , (2018).</li><li>Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neuronal+polarity.">Mechanisms of neuronal polarity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).</li><li>Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Extracellular+Matrix+And+Osteogenic+Protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons.">The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).</li><li>Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-2+and+retinoic+acid+induce+neurotrophin-3+responsiveness+in+developing+rat+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons.</a> Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).</li><li>Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+the+survival+and+response+to+nerve+growth+factor+of+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons.</a> Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).</li><li>Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlstr&#246;m, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+light+chain+and+synaptotagmin+I+in+rat+sympathetic+neurons.">Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).</li><li>Harris, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Guidance+by+a+Decellularized+Fibroblast+Extracellular+Matrix.">Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix.</a> Matrix Biology. , 176-189 (2017).</li><li>Wingerd, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4+integrins+and+vascular+cell+adhesion+molecule-1+play+a+role+in+sympathetic+innervation+of+the+heart.">&#945;4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart.</a> Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+autonomic+neurons.">Tissue culture of autonomic neurons.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture.</a> Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).</li><li>Voyvodic, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+dendrites+in+the+rat+superior+cervical+ganglion.">Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).</li><li>Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Responses+of+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons+during+BMP-7-Induced+Dendritic+Growth.">Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth.</a> PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).</li><li>Pravoverov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+Necessary+for+BMP-7-induced+Dendritic+Growth+in+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons.">MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).</li><li>Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitative+analyses+of+microRNAs+located+in+the+distal+axons+of+sympathetic+neurons.">Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons.</a> RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).</li><li>Aschrafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+mediates+the+axonal+trafficking+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+&#946;-hydroxylase+mRNAs+and+enhances+norepinephrine+synthesis+in+primary+sympathetic+neurons.">Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine &#946;-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).</li><li>Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).</li><li>Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+is+localized+to+the+dendrites+of+hippocampal+neurons+which+develop+in+culture.">MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture.</a> Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).</li><li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER+version+11:+Expanded+annotation+data+from+Gene+Ontology+and+Reactome+pathways,+and+data+analysis+tool+enhancements.">PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).</li><li>Chandrasekaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+the+morphological+development+of+sympathetic+neurons.">Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons.</a> Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).</li><li>Courter, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7-induced+dendritic+growth+in+sympathetic+neurons+requires+p75+NTR+signaling.">BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling.</a> Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).</li><li>Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+Autonomic+and+Enteric+Neurons.">Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+isolation+and+culture+of+mouse+embryonic+motoneurons.">Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+device+for+co-culture+of+sympathetic+neuron+and+iPS-derived+cardiomyocytes.">Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes.</a> Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+semi-separated+co-culture+system+of+sympathetic+neuron+and+cardiomyocyte.">Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte.</a> Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).</li><li>Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+are+involved+in+BMP-induced+dendritic+growth+in+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).</li><li>Kim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+decrease+dendritic+arborization+in+rat+sympathetic+neurons+by+blocking+RhoA+activation.">Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+Primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Szpara, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+during+neurite+outgrowth+and+regeneration.">Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration.</a> BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).</li><li>Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rapigest+efficacy+for+the+digestion+of+proteins+from+cell+cultures+and+heart+tissue.">Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue.</a> Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).</li><li>Vit, O., Petrak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+proteins+in+proteomics.+How+to+break+open+the+black+box.">Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box.</a> Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).</li></ol>

本論文では、胚性ラットの上位脳神経節から交感神経を培養するためのプロトコルについて述べている。このモデルシステムを用いる利点は、成長因子に対して同様の応答を提供するニューロンの均質集団を得ることができることであり、またこれらのニューロンに対する成長因子要件が十分に特徴付けられているため、これらのニューロンを定義された培地において、無血清?...

胚性優子宮頸神経膠小(SCG)由来,の交感神経細胞は、成長因子依存、神経標的相互作用、神経伝達物質シグナル伝達、軸索成長、樹状突起の発達および可塑性、神経標的/神経グリアと神経グリア相互作用の基礎となるシナプス形成およびシグナル伝達機構を,2,3,4,5,6,7含む、神経発達の多くの側面を研究するための主要な神経細胞培養システムとして広く用いられている。,8その小さなサイズ(約10000ニューロン/神経節)にもかかわらず、この培養系の開発と広範な使用の3つの主な理由は、交感神経鎖の最初の神経節であり、交感神経節10の残りの部分よりも大きく、したがって分離しやすいです。ii)中央ニューロンとは異なり、SCGのニューロンはかなり均質で、すべてのニューロンは神経堤に由来し、同様の大きさを有し、神経成長因子に依存し、またアドレナリン症である。これにより、形態学的およびゲノム学的研究のための貴重なモデル,となる10、11,11およびiii)これらのニューロンは、10、12ヶ月以上の神経成長因子を含む定義された無血清培地で維持することができる。12周産期SCGニューロンは、樹状突起2の開始および維持の根底にあるメカニズムを研究するために広く使用されてきた。これは主に、SCGニューロンは生体内に広範な樹状樹状樹状の樹状樹状のアーバーを有するが、血清の不在時にインビトロで樹状突起を拡張しないが、骨形態形成タンパク質2、12、1312,のような2特定の成長因子の存在下で樹状突起を成長させることが誘導され得るからである。13
本論文では、胚性ラットSCGニューロンを単離・培養するためのプロトコルについて述べる。過去50年間、SCGの主要な神経細胞培養は、主に大規模なゲノムまたはプロテオミクスの変化を調べる研究の限られた数で形態学的研究に使用されてきました。これは主に組織サイズが小さく、少量のDNAまたはタンパク質の単離が原因であり、これらのニューロンにゲノムおよびプロテオミクス分析を行うことが困難です。しかしながら、近年、検出感度の上昇により、樹状成長発達14、15、16、17,15の間にSCGニューロンにおけるゲノム、miRNomeおよび16プロテオームを調べる方法の開発が可能になっている。また、免疫細胞化学を用いたこれらのニューロンの形態学的解析方法と、質量分析のためのニューロンタンパク質抽出物を得るためのプロトコルについても述べる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2D nanoACQUITY</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>354-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200, 140675, 142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine- &#946;- D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126609</td>
			<td>20 mg/mL stock in low glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps Dumont no.4 and no.5</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>5621, 5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and Scissors for Dissection</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1328, 1329, 5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverlips - 12mm</td>
			<td>Neuvitro Corporation</td>
			<td>GG-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media for glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36931, P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor</td>
			<td>Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)</td>
			<td>BT5017</td>
			<td>Stock 125 &#956;g/mL in 0.2% Prionex in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>P1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prionex</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>529600</td>
			<td>10% solution, 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001861</td>
			<td>5 X 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro acetic acid - Sequencing grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td>10 X 1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega or NEB</td>
			<td>V511A, P8101S</td>
			<td>100 &#956;g or 5 X 20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186000385c</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis

胚性ラットの優れた子宮頸神経節(SCG)の交感神経ニューロンは、軸索成長、軸索密化、シナプトジェネシス、樹状増進、樹状可塑性および共培養系における神経標的相互作用を研究するための末梢ニューロンのインビトロモデルシステムとして使用されてきた。このプロトコルは、E21ラット胚の優れた子宮頸神経節からのニューロンの分離および解離、続いて無血清培地における純粋な神経細胞培養の調製および維持について説明する。ニューロンはコーティングされていないプラスチックに付着しないため、ニューロンは12mmのガラスカバーリップまたはポリD-リジンでコーティングされた6ウェルプレートのいずれかで培養されます。抗ミトキ薬(Ara-C、シトシンβ-D-アラビノフラノシド)による治療後、このプロトコルは、5%未満の非神経細胞を有する健康な神経培養を生成し、1ヶ月以上インビトロで維持することができる。胚性ラットSCGニューロンは生体内で5〜8デンドライトを有する多極であるが、;無血清条件下では、これらのニューロンは培養中の単一の軸索のみを拡張し、培養期間中はユニポーラであり続ける。しかし、これらのニューロンは、膜内抽出物、骨形態形成タンパク質(BMP)、または10%の胎児子牛血清の存在下でデンドライトを拡張するように誘導することができる。これらの均質な神経培養は、免疫細胞化学的染色および生化学的研究に使用することができる。また、これらのニューロンにおける微小管関連タンパク質-2(MAP-2)の免疫細胞化学的染色および質量分析用のニューロン抽出物の調製に対する最適化されたプロトコルについても説明する。

胚性SCGニューロンの神経培養の分離と維持 ラット胚SCGからの解離細胞は、ポリD-リジン被覆板またはカバースリップでめっきし、b神経成長因子を含む血清遊離培養培地中に維持した。ニューロンとグリア細胞の混合物を含む解解化細胞は、めっき時に円形に見える(図1A)。めっきの24時間以内に、ニューロンは位相コントラスト顕微鏡の下で位相暗くグリ?...

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Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

本論文では、上方の頸神経節からの胚性ラット交感神経の単離と培養について述べている。また、免疫細胞化学染色や質量分析のためのニューロン抽出物の準備のための詳細なプロトコルも提供します。

形態学およびプロテオーム解析のための胚性子宮頸部神経節からのラット交感神経の培養

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

本ビデオでは、形態学的およびプロテオミクス解析のための胚性ラットの優れた子宮頸神経節の培養を実証する。解剖を始める前に、制御と解剖メディアを準備してください。コントロール培地には、インスリンセレントランスフェリン混合物、グルタミン、神経成長因子、およびBSAを添加したF-12および低グルコースDMEMが含まれています。解剖媒体はペンストレップおよびBSAと補足されるL-15を含んでいる。メディアの準備のための詳細なプロトコルについては、原稿を参照してください。ニューロンを培養するためのプレートの調製ポリD-リジンの1ミリリットルのストックあたり1ミリグラムを滅菌蒸留水で1ミリリットル当たり100マイクログラムに希釈する。解剖の1~2日前に、解剖の1~2日前に、ポリD-リジン1ミリリットル当たり約2ミリリットルの無菌100グラムで6ウェルプレートをコーティングします。これは、ウェルへの細胞接着を確保するために必要です.プレートをしがみつくフィルムで包み、プレートを摂氏4度で一晩保管します。解剖の日には、解剖が始まる前に、ポリD-リジン溶液を井戸から取り出し、滅菌蒸留水で井戸を5回リンスし、続いて低グルコースDMEMで1回ずつすすがします。神経節の酵素消化中、細胞をめっきする約1時間前に、DMEMをプレートから吸引し、0.3ミリリットルの制御培地に置き換える。5%CO2以下で35°Cのプレートを加湿したチャンバーに保管してください。フード内で、解剖用に以下の項目を設定します。各チューブに約20ミリリットルの解剖媒体を有する4つの50ミリリットルの無菌の円錐管。解剖媒体の1.5ミリリットルと4つの無菌35ミリメートルの皿。1つの無菌50ミリリットル円錐管と20ミリリットルの解剖媒体を遠心分離する。神経節を遠心分離するための15ミリリットルの無菌円錐管1本、解約細胞を回収するための1つの無菌10ミリリットルチューブ。乾燥ビーズ滅菌器を使用して、1対の細かい鉗子を少なくとも1分間殺菌します。動物を含む研究で行われたすべての手順は、カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの制度動物ケアと使用委員会によって承認されました。カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの動物ケアと使用ガイドラインは、国立衛生研究所の動物福祉研究所が提供するガイドラインに基づいて開発されました。妊娠中のラットからのE21胚の除去。なお、周囲の領域が完全に殺菌されれば、子宮ホーンの除去はフードの外側で行うことができる。妊娠中のラットをCO2吸入で安楽死させる。腹部の領域から毛皮を剪断し、それを殺菌するために70%アルコールで領域内の皮膚を拭きます。無菌ハサミと鉗子の新鮮なセットを使用して、皮膚を切断し、次に筋肉を切断し、胚を含む子宮の角を露出させる。胚で子宮角を取り除き、新しいハサミと鉗子を使用して、その過程で腸に損傷を与えないように注意してください。胚を持つ子宮ホーンを150ミリメートルの無菌ペトリ皿に移し、フードに移します。鉗子とはさみの新しいセットを使用して、子宮の角から胚を取り除き、羊膜と胎盤から胚を分離する。胚を安楽死させるために、右腕の下の正中線に沿って胚の脊髄を切断する。これは、SCGの除去中に頸動脈からの出血を減少させる。これらの胚を解剖培地を含む調製された50ミリリットルの円錐管に移す。胚がメディアに沈んでいるか確認してください。各チューブは、最大3つの胚を保持することができます。胚からの上頸神経節の分離。解剖培地から1つの子犬を、基板上の後ろ面を持つ固体基板で半分充填された無菌150ミリメートルのペトリ皿に移します。3つの無菌23ゲージ針を使用して、各腕の下に1本の針を持ち、口を通して3本目の針でパブを皿に固定し、首を慎重に伸ばします。下の唾液腺を露出させるために無菌の細かい鉗子を使用して首の領域の皮膚を切断します。細かい鉗子を使用してこれらの腺を取り除きます。鎖骨と気管の近くに胸骨筋とオモヨイドの筋肉をそれぞれ見つけます。まず、横断性胸骨筋筋を切断する。そして、細いオモヨイド筋を細い鉗子で丁寧に切ります。これらの筋肉が取り除かれると、前側端の頸動脈の分岐は、頸動脈のこのフォークの下に位置するSCGを有する気管の両側に見える。閉じた鉗子を使用して、頸動脈を静かに持ち上げてSCGを視覚化する。SCGの両側に1つの鉗子を使用して、頸動脈を引き出し、準備された無菌35ミリメートルの皿に移す。この組織は、頸動脈を有するSCG、無用量神経節を有する迷走神経、ならびに領域内の筋肉または脂肪の他のセグメントを含む可能性が最も高い。反対側で解剖プロセスを繰り返します。概説された残りの解剖ステップを続行する前に、すべての胚からSCGを取り除きます。組織サンプルの処理を容易にするために、35ミリメートルの皿のうちの2つの間で単離された組織を分配する。SCGの後処理。SCGを解剖組織から分離するには、まず細かい鉗子を使用して筋肉や脂肪などの余分な組織を取り除き、頸動脈分岐の近くの領域を避けるように注意する。これらの組織が取り除かれると、2つの神経節が見える。SCGがアーモンド状である間、無用量ガングリオンは小さく円形である。迷走神経を優しく引っ張って迷走神経と無用量神経節を頸動脈から分離し、頸動脈からSCGを分離する。SCGを取り囲むカプセルを取り除くために細かい鉗子を使用してください。SCGを新しい35ミリメートルの培養皿に移します。解剖された組織サンプルをすべて使用して、このプロセスを繰り返します。滅菌された綿製のガラスピペットに解剖媒体をコーティングし、組織がピペットの壁に付着するのを防ぎます。ピペットを使用して、解剖培地をコラゲターゼII型の無菌2ミリリットル、カルシウムとマグネシウムフリーHBSSのディスパーゼII型に置き換え、37°Cで50分間インキュベートして組織を分解します。インキュベーション時間は、コラゲラーゼ/ディスパーゼの異なるバッチで最適化する必要があり、通常は40分から1時間の範囲であることに注意してください。インキュベーションに続いて、SCGとコラゲナーゼ/ディスパーゼを無菌15ミリリットル円錐形チューブに移します。解剖培地を使用してプレートをすすい、チューブに溶液を移します。約10ミリリットルにボリュームを持って来るために十分な解剖媒体を追加します。200xgで遠心分離機、1,000〜1、200rpmを室温で5分間、試料をペレットする。上清を吸引し、ペレットを外さないよう注意する。ペレットを10ミリリットルの解剖培地で再懸濁し、遠心分離を繰り返し、上清を捨てます。1~2ミリリットルの培養培地に交換してください。狭孔、曲げ先端滅菌パスツールピペットを使用して、培養培地で事前にコーティングし、5〜6回穏やかに三度引きすることによって塊を機械的に解別する。大きな塊を約1分間落ち着かせ、上清細胞懸濁液を新しい10ミリリットルチューブに移します。SCGのほぼ完全な解離を確実にするために、毎回トリアーレーションの力を増やすとこのプロセスをさらに3回繰り返します。8〜10ミリリットルにボリュームをもたらすのに十分な培養培地を追加します。細胞懸濁液を軽く混合し、ヘモサイトメーターで細胞密度を定量化します。実験に適した細胞密度で細胞懸濁液をウェルに分配する。めっきプロセス中に細胞懸濁液を継続的に混合し、ウェルへの細胞の均等な分布を確保します。形態学的分析のために、24ウェルプレートにウェルあたり8,000個の細胞の周りをプレートします。ゲノムおよびプロテオミクスプロトコルの場合、細胞を1ウェルあたり30,000個の細胞にプレートします。プレートを下部に滅菌水を入ったガラスデシケーターに移し、加湿チャンバーを作ります。十分なCO2を注入し、約120ミリリットル、封止前にデシケータで5%のCO2環境を得る。プレートを摂氏35.5度に保つ。これは、プロトコルではゼロ日と呼ばれます。これらのプレートは、通常の5%CO2インキュベーターで維持することもできます。上記の方法は、温度とpHの変化を最小限に抑え、また、クロス汚染を防ぐのに役立ちます。培養されたSCGニューロンおよび治療の維持。これらの写真は、ゼロ日目、1日目、5日目に解約された優れた子宮頸神経細胞を示しています。ゼロ画像は、めっき時の細胞を示しています。ゼロ日目にメッキされた細胞には、神経細胞と非神経細胞の両方の混合物が含まれています。めっきの24時間後の1日目に、培養培地の半分を慎重に取り出し、2つのミクロモルAra-C、シトシンD-アラビノフラノシド、抗ミトティック剤に置き換えます。48時間細胞に治療を残します。通常、この治療期間は、培養中の非神経細胞を排除するのに十分である。3日目には、培地の半分を軽く吸い込み、制御媒体に交換します。4日目、細胞は実験的治療の準備ができています。適切な培地で一日おきに培養を供給する。井戸の中の半分を新鮮な媒体にそっと置き換えます。5日目の画像は、樹状突起の成長が観察されていない広範な軸索成長を示しています。樹状成長を誘導するために、ニューロンはマトリゲル上で増殖させるか、骨形態形成タンパク質-7の1ミリリットル当たり10%血清または50ナノグラムで処理することができる。図2は、BMP-7による治療後のE21ラットSCGニューロンの神経形態の変化を示す。10 X倍率の代表的な位相コントラスト顕微鏡写真は、パネルAの対照ニューロンに軸索を持つ円形ニューロン細胞体と、パネルB.Cultured SCGニューロンの矢印で示されたBMP-7で処理された複数の短い樹状突起様プロセスを有するニューロンを示し、適切な治療に続く適切な治療に続く形態学的分析に使用することができる。などのプロテオミクス分析用。プロテオミクス分析のための免疫染色およびサンプル調製のための詳細なプロトコルについては、原稿を参照してください。図3は、培養胚性ラット交感ニューロンにおけるMAP-2タンパク質からの免疫染色を示す。パネルAからDは、制御メディアとHを介してパネルEで治療された培養SCGニューロンを示し、5日間1ミリリットル当たり50ナノグラムでBMP-7で処理されたニューロンを示す。CおよびGにおける微小管関連タンパク質-2を有するニューロンの免疫細胞化学的染色を示す代表的な顕微鏡写真、 BおよびFの位相コントラスト顕微鏡写真を有するDおよびHの核染色、および微小管関連タンパク質−2からの免疫細胞化学的染色の3つのチャネルの出現は、パネルCの対照ニューロンの細胞体および近位軸索に存在し、細胞体内のMAP-2タンパク質から染色する、およびBMP-7処理ニューロンの樹状突起は、パネルGにあるコントロールメディアで処理された優れた子宮頸神経節のサンプルランであり、1,100個のタンパク質を検出した。パンサーデータベースを使用した遺伝子オントロジーは、タンパク質のほとんどが細胞質であることを発見しました。しかし、サンプル中の細胞接合部には膜結合タンパク質とタンパク質が存在していた。この分析は、広範囲の神経シグナル伝達経路に関与するタンパク質がサンプル中に検出されたことも明らかにした。結論として、このビデオを見た後、形態学的およびプロテオミクス分析のためにラット胚性優れた子宮頸神経節ニューロンを分離し培養することができるはずです。この研究は、カリフォルニア州セントメアリーズカレッジの教員開発基金と夏の研究プログラムによって資金提供されました。

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