Name: culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis
Uploaded: 2020-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Faculty Development Fund og Summer Research Program stipend ved Saint Mary's College of California. Forfatterne vil også takke Dr. Pamela Lein ved University of California ved Davis og Dr. Anthony Iavarone ved UC Berkeley Mass spektrometri anlegget for deres råd under utviklingen av disse protokollene. Forfatterne vil også takke Haley Nelson i Office of College Communications ved Saint Mary's College of California for hennes hjelp med videoproduksjon og redigering.

Alle prosedyrer utført i studier som involverte dyr ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Saint Mary's College of California. Retningslinjene for dyrepleie og bruk ved Saint Mary's College ble utviklet basert på retningslinjene fra Office of Laboratory Animal Welfare ved National Institute for Health (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf and https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).
<p class="jove_tit...

<ol>
	<li>Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+Changes+in+the+neuritic+growth+cone+and+target+neuron+during+synaptic+junction+development+in+culture.">Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture.</a> Journal of Cell Biology. 9, (1976).</li><li>Chandrasekaran, V., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Dendritogenesis+in+Sympathetic+Neurons.">Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons.</a> Autonomic Nervous System. , (2018).</li><li>Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neuronal+polarity.">Mechanisms of neuronal polarity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).</li><li>Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Extracellular+Matrix+And+Osteogenic+Protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons.">The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).</li><li>Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-2+and+retinoic+acid+induce+neurotrophin-3+responsiveness+in+developing+rat+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons.</a> Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).</li><li>Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+the+survival+and+response+to+nerve+growth+factor+of+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons.</a> Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).</li><li>Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlstr&#246;m, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+light+chain+and+synaptotagmin+I+in+rat+sympathetic+neurons.">Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).</li><li>Harris, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Guidance+by+a+Decellularized+Fibroblast+Extracellular+Matrix.">Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix.</a> Matrix Biology. , 176-189 (2017).</li><li>Wingerd, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4+integrins+and+vascular+cell+adhesion+molecule-1+play+a+role+in+sympathetic+innervation+of+the+heart.">&#945;4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart.</a> Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+autonomic+neurons.">Tissue culture of autonomic neurons.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture.</a> Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).</li><li>Voyvodic, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+dendrites+in+the+rat+superior+cervical+ganglion.">Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).</li><li>Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Responses+of+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons+during+BMP-7-Induced+Dendritic+Growth.">Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth.</a> PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).</li><li>Pravoverov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+Necessary+for+BMP-7-induced+Dendritic+Growth+in+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons.">MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).</li><li>Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitative+analyses+of+microRNAs+located+in+the+distal+axons+of+sympathetic+neurons.">Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons.</a> RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).</li><li>Aschrafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+mediates+the+axonal+trafficking+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+&#946;-hydroxylase+mRNAs+and+enhances+norepinephrine+synthesis+in+primary+sympathetic+neurons.">Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine &#946;-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).</li><li>Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).</li><li>Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+is+localized+to+the+dendrites+of+hippocampal+neurons+which+develop+in+culture.">MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture.</a> Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).</li><li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER+version+11:+Expanded+annotation+data+from+Gene+Ontology+and+Reactome+pathways,+and+data+analysis+tool+enhancements.">PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).</li><li>Chandrasekaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+the+morphological+development+of+sympathetic+neurons.">Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons.</a> Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).</li><li>Courter, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7-induced+dendritic+growth+in+sympathetic+neurons+requires+p75+NTR+signaling.">BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling.</a> Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).</li><li>Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+Autonomic+and+Enteric+Neurons.">Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+isolation+and+culture+of+mouse+embryonic+motoneurons.">Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+device+for+co-culture+of+sympathetic+neuron+and+iPS-derived+cardiomyocytes.">Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes.</a> Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+semi-separated+co-culture+system+of+sympathetic+neuron+and+cardiomyocyte.">Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte.</a> Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).</li><li>Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+are+involved+in+BMP-induced+dendritic+growth+in+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).</li><li>Kim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+decrease+dendritic+arborization+in+rat+sympathetic+neurons+by+blocking+RhoA+activation.">Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+Primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Szpara, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+during+neurite+outgrowth+and+regeneration.">Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration.</a> BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).</li><li>Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rapigest+efficacy+for+the+digestion+of+proteins+from+cell+cultures+and+heart+tissue.">Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue.</a> Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).</li><li>Vit, O., Petrak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+proteins+in+proteomics.+How+to+break+open+the+black+box.">Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box.</a> Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).</li></ol>

Dette papiret beskriver protokollene for å dyrke sympatiske nevroner fra overlegne cervical ganglia av embryonale rottevalper. Fordelene ved å bruke dette modellsystemet er at det er mulig å oppnå en homogen populasjon av nevroner som gir en lignende respons på vekstfaktorer, og siden vekstfaktorkravene for disse nevronene har blitt godt karakterisert, er det mulig å vokse disse nevronene in vitro i definerte medier, under serumfrie forhold10. Selv om protokollen beskriver prosessen for å i...

Sympatiske nevroner avledet fra embryonale overlegne cervical ganglia (SCG) har blitt mye brukt som et primært nevronalt kultursystem for å studere mange aspekter av nevronal utvikling, inkludert vekstfaktoravhengighet, neuron-mål interaksjoner, nevrotransmitter signalering, aksonal vekst, dendritt utvikling og plastisitet, synaptogenesis og signalmekanismer underliggende nerve-mål/ neuron-glia interaksjoner1,2,3,4,5,6,7,8,9. Til tross for sin lille størrelse (rundt 10000 nevroner / ganglia), er det tre hovedgrunner til utvikling og utstrakt bruk av dette kultursystemet er i) å være de første gangliaene i den sympatiske kjeden, de er større, og derfor lettere å isolere, enn resten av de sympatiske ganglia10; ii) i motsetning til sentrale nevroner, nevronene i SCG er ganske homogene med alle nevronene blir avledet fra nevrale crest, har en lignende størrelse, avhengighet av nerve vekstfaktor og være nor-adrenerge. Dette gjør dem til en verdifull modell for morfologiske og genomiskestudier 10,,11 og iii) disse nevronene kan opprettholdes i et definert serumfritt medium som inneholder nervevekstfaktor i over en måned10,12. Perinatal SCG nevroner har blitt mye brukt til å studere mekanismene som ligger til grunn for initiering og vedlikehold av dendritt2. Dette skyldes hovedsakelig, selv om SCG-nevroner har en omfattende dendrittisk arbor in vivo, utvider de ikke dendritt in vitro i fravær avserum,men kan induseres til å vokse dendritter i nærvær av visse vekstfaktorer som beinmorfogenetiske proteiner2,12,,13.
Dette papiret beskriver protokollen for å isolere og kultivere embryonale rotte SCG nevroner. I løpet av de siste 50 årene har primære nevronale kulturer fra SCG hovedsakelig blitt brukt til morfologiske studier med et begrenset antall studier som undersøker de store genomiske eller proteomiske endringene. Dette skyldes hovedsakelig liten vevstørrelse som resulterer i isolering av lave mengder DNA eller protein, noe som gjør det vanskelig å utføre genomiske og proteomiske analyser på disse nevronene. Men de siste årene har økt deteksjonsfølsomhet gjort det mulig å utvikle metoder for å undersøke genomet, miRNome og proteome i SCG-nevronene under dendrittisk vekstutvikling14,,15,,16,,17. Dette papiret vil også beskrive metoden for morfologisk analyse av disse nevronene ved hjelp av immunocytochemistry og en protokoll for å oppnå nevronale proteinekstrakter for massespektrologisk analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2D nanoACQUITY</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>354-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200, 140675, 142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine- &#946;- D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126609</td>
			<td>20 mg/mL stock in low glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps Dumont no.4 and no.5</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>5621, 5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and Scissors for Dissection</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1328, 1329, 5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverlips - 12mm</td>
			<td>Neuvitro Corporation</td>
			<td>GG-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media for glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36931, P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor</td>
			<td>Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)</td>
			<td>BT5017</td>
			<td>Stock 125 &#956;g/mL in 0.2% Prionex in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>P1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prionex</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>529600</td>
			<td>10% solution, 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001861</td>
			<td>5 X 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro acetic acid - Sequencing grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td>10 X 1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega or NEB</td>
			<td>V511A, P8101S</td>
			<td>100 &#956;g or 5 X 20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186000385c</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis

Sympatiske nevroner fra embryonale rotte overlegne cervical ganglia (SCG) har blitt brukt som et in vitro-modellsystem for perifere nevroner for å studere aksonal vekst, aksonal smugling, synaptogenesis, dendrittisk vekst, dendrittisk plastisitet og nervemålinteraksjoner i co-kultursystemer. Denne protokollen beskriver isolasjon og dissosiasjon av nevroner fra de overlegne livmorhalsgangene til E21 rotteembryoer, etterfulgt av preparat og vedlikehold av rene nevronale kulturer i serumfritt medium. Siden nevroner ikke holder seg til ubestrøket plast, vil nevroner bli dyrket på enten 12 mm glassdeksler eller 6-brønns plater belagt med poly-D-lysin. Etter behandling med et antimitotisk middel (Ara-C, cytosin β-D-arabinofuranoside), genererer denne protokollen sunne nevronale kulturer med mindre enn 5% ikke-nevronale celler, som kan opprettholdes i over en måned in vitro. Selv om embryonale rotte SCG nevroner er multipolar med 5-8 dendritt in vivo; under serumfrie forhold strekker disse nevronene bare en enkelt axon i kultur og fortsetter å være unipolar i løpet av kulturen. Imidlertid kan disse nevronene induseres til å utvide dendrittene i nærvær av kjellermembranekstrakt, beinmorfogenetiske proteiner (BMPs), eller 10% føtal kalveserum. Disse homogene nevronale kulturene kan brukes til immunocytokjemisk farging og til biokjemiske studier. Dette papiret beskriver også optimalisert protokoll for immunocytokjemisk farging for mikrotubuli assosiert protein-2 (MAP-2) i disse nevronene og for fremstilling av nevronale ekstrakter for massespektrometri.

Isolere og vedlikeholde nevronale kulturer av embryonale SCG-nevroner Dissosierte celler fra rotte embryonale SCG ble belagt i en poly-D-lysinbelagt plate eller dekklips og opprettholdt i serumfrie kulturmedier som inneholder b-nervevekstfaktor. De dissosierte cellene som inneholder en blanding av nevroner og glialceller ser sirkulære ut på plating (figur 1A). Innen 24 timer etter plating utvider nevronene små aksonale prosesser med glialceller som flater ut og vises f...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis at JoVE.com

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Dette papiret beskriver isolasjon og dyrking av embryonale rotte sympatiske nevroner fra de overlegne cervical ganglia. Det gir også detaljerte protokoller for immunocytokjemisk farging og for å forberede nevronale ekstrakter for massespektrometrisk analyse.

Culturing Rotte sympatiske nevroner fra embryonale overlegen cervical ganglia for morfologisk og proteomisk analyse

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

I denne videoen vil vi demonstrere kulteringen av embryonale rotters overlegne cervical ganglia for morfologiske og proteomiske analyser. Før du begynner disseksjonen, forberede kontroll og disseksjon media. Kontrollmediet inneholder F-12 og lav glukose DMEM supplert med en insulin-selen-transferrin blanding, glutamin, nerve vekstfaktor, og BSA.Disseksjonsmediet inneholder L-15 supplert med penne-strep og BSA. Se manuskriptet for detaljerte protokoller for medieforberedelse. Forberedelse av plater for å kultere nevroner.Fortynn et ett mg per milliliter lager av poly-D-lysin til 100 mikrogram per milliliter med sterilt destillert vann. For proteomisk eller genomisk analyse, en til to dager før disseksjonen, belegge seks-brønnplater med ca. to milliliter sterile 100 gram per milliliter poly-D-lysin. Dette er nødvendig for å sikre celle vedheft til brønnen.Pakk platene med plastfolie og lagre platene over natten på fire grader Celsius. På disseksjonsdagen, før disseksjonsstart, fjerner du poly-D-lysinløsningen fra brønnene og skylle brønnene fem ganger med sterilt destillert vann, etterfulgt av en gang med lav glukose DMEM. Under den enzymatiske fordøyelsen av ganglia, omtrent en time før plating cellene, aspirere DMEM fra platene og erstatte den med 0,3 milliliter kontrollmedium.Oppbevar platene ved 35 grader Celsius under 5% CO2 i et fuktet kammer. Sett opp følgende elementer for disseksjon i panseret. Fire 50 milliliter sterile koniske rør med ca 20 milliliter disseksjonsmedier i hvert rør.Fire sterile 35 millimeter retter med 1,5 milliliter disseksjonsmedier. En steril 50 milliliter konisk rør med 20 milliliter av disseksjonsmedier for sentrifugering. En 15 milliliter sterilt konisk rør for sentrifuging ganglia, en steril 10 milliliter rør for å samle dissosierte celler.Bruk en tørr perler sterilisator for å sterilisere et par fine tang i minst ett minutt. Alle prosedyrer utført i studier som involverer dyr ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Saint Mary's College of California. Retningslinjene for dyrepleie og bruk ved Saint Mary's College of California ble utviklet basert på retningslinjer fra Office of Laboratory Animal Welfare ved National Institutes for Health.Fjerning av E21 embryoer fra den gravide rotten. Vær oppmerksom på at fjerning av livmorhornet kan utføres utenfor panseret hvis det omkringliggende området er grundig sterilisert. Euthanize en gravid rotte med CO2 innånding.Skjær pelsen fra bukregionen og tørk huden i området med 70% alkohol for å sterilisere den. Ved hjelp av et nytt sett med steril saks og tang, kutt gjennom huden og deretter muskelen for å avsløre livmorhornene som inneholder embryoene. Fjern livmorhornet med embryoene, ved hjelp av et nytt sett med saks og tang, og ta vare på å ikke skade tarmene i prosessen.Overfør livmorhornet med embryoene til 150 millimeter steril petriskål og overfør dem til panseret. Bruk et nytt sett med tang og saks, fjern embryoene fra livmorhornet og skill embryoene fra fostervannsmembranene og morkaken. For å euthanize embryoene, kutt ryggmargen til embryoene langs midtlinjen under høyre arm.Dette vil redusere blødningen fra halspulsåren under fjerning av SCG. Overfør disse embryoene til de tilberedte 50 milliliter koniske rørene som inneholder disseksjonsmedier. Kontroller at embryoene er nedsenket i media.Hvert rør kan holde opptil tre embryoer. Isolering av den overlegne cervical ganglion fra embryoet. Overfør en valp fra disseksjonsmediet til en steril 150 millimeter petriskål halvfylt med solid substrat med sin dorsale overflate på underlaget.Bruk tre sterile 23 gauge nåler, pin puben til parabolen med en nål under hver arm og en tredje nål gjennom munnen for å forsiktig hyperextend halsen. Skjær gjennom huden i nakkeområdet ved hjelp av sterile fine tang for å eksponere spyttkjertlene under. Fjern disse kjertlene ved hjelp av fine tang.Finn sternocleidomastoid og omohyoid muskler nær kragebenet og luftrøret henholdsvis. Først kutte tverrgående sternocleidomastoid muskler. Og deretter forsiktig kutte den tynne omohyoid muskelen ved hjelp av fine tang.Når disse musklene er fjernet, vil bifurcation i halspulsåren på den fremre enden være synlig på hver side av luftrøret med SCG plassert under denne gaffelen i halspulsåren. Bruk lukkede tang, løft forsiktig halspulsåren for å visualisere SCG. Bruk en tang på hver side av SCG, trekk ut halspulsen og overfør den til de tilberedte sterile 35 millimeterretter.Dette vevet vil mest sannsynlig inneholde SCG med halspulsåren, vagusnerven med nodosegangliaene, samt andre segmenter av muskel eller fett i området. Gjenta disseksjonsprosessen på den andre siden. Fjern SCGs fra alle embryoer før du fortsetter med de gjenværende disseksjonstrinnene skissert.Fordel det isolerte vevet mellom to av de 35 millimeter rettene for å lette behandlingen av vevsprøvene. Etterbehandling av SCG. For å skille SCG fra det dissekerte vevet, bruk først fine tang for å fjerne overflødig vev, for eksempel muskel eller fett, og vær forsiktig for å unngå området i nærheten av carotisbifurcation.Når disse vevene er fjernet, er to ganglia synlige. Nodose ganglion er mindre og sirkulær mens SCG er mandelformet. Trekk forsiktig på vagusnerven for å skille vagusnerven og nodosegangene fra halspulsen og deretter skille SCG fra halspulsåren.Bruk fine tang for å fjerne kapselen som omgir SCG. Overfør SCG til en ny 35 millimeter kulturrett. Gjenta denne prosessen med alle dissekerte vevsprøver.Coat en sterilisert, bomull-plugget glass pipette med disseksjon media for å hindre vevet fra å følge pipette veggene. Bruk pipetten til å erstatte disseksjonsmediet med sterile to milliliter kollagennase type II, dispase type II i kalsium og magnesiumfri HBSS og inkubere i 50 minutter ved 37 grader Celsius for å bidra til å bryte ned vevet. Vær oppmerksom på at inkubasjonstidene kanskje må optimaliseres med forskjellige grupper av kollagennase /dispase og vanligvis varierer fra 40 minutter til en time.Etter inkubasjonen, overføre SCGs og collagenase / dispase til en steril 15 milliliter konisk rør. Bruk disseksjonsmediet til å skylle platene og overføre løsningen til røret. Tilsett nok disseksjonsmedier for å bringe volumet til ca. 10 milliliter.Sentrifuge ved 200 x g, 1, 000 til 1, 200 rpm i fem minutter ved romtemperatur for å pellet prøven. Aspirer den overnaturlige, ta vare på å ikke løsne pellet. Resuspend pellet med 10 milliliter av disseksjonsmedier, gjenta sentrifugeringen og kast det overnaturlige.Erstatt med en til to milliliter kulturmedium. Bruk en smal-bore, bøyd-tip steril Pasteur pipette, pre-coat den med kultur medium, mekanisk dissosiere klumper ved forsiktig triturating fem til seks ganger. La de større klumpene bosette seg i omtrent ett minutt og overføre den overnaturlige cellefjæringen til et nytt 10 milliliter rør.Gjenta denne prosessen tre ganger til med økende triturasjonskraft hver gang for å sikre nesten fullstendig dissosiasjon av SCGs. Overfør supernatanten etter hver runde med triturasjon til 10 milliliter røret med supernatant fra første triturasjon. Legg til nok kulturmedier til å bringe volumet til åtte til 10 milliliter.Bland forsiktig en cellefjæring og kvantifisere celletettheten med et hemocytometer. Fordel cellesuspensjonen i brønnene ved riktig celletetthet for eksperimentene. Bland cellesuspensjonen kontinuerlig under platingprosessen for å sikre jevn fordeling av celler i brønnene.For morfologisk analyse, plate cellene rundt 8000 celler per brønn i en 24-brønnplate. Og for genomiske og proteomiske protokoller, plate cellene så høyt som 30,000 celler per brønn. Overfør platene til en glassdesiccator med sterilt vann nederst for å skape et fuktet kammer.Injiser nok CO2, rundt 120 milliliter, for å få et 5% CO2-miljø i desiccatoren, før tetning. Vedlikehold platene ved 35,5 grader Celsius. Dette kalles dag null i protokollen.Disse platene kan også vedlikeholdes i en vanlig 5% CO2 inkubator. Metoden som er beskrevet ovenfor, minimerer temperatur- og pH-endringer og bidrar også til å forhindre krysskontaminering. Vedlikehold av de kultiverte SCG nevroner og behandlinger.Disse bildene viser de dissosierte overlegne cervical ganglia cellene på dag null, dag én og dag fem. Dagen null bildet viser cellene ved plating. Cellene belagt på dag null inneholder en blanding av både nevronale og ikke-nevronale celler.På dag én, 24 timer etter plating, fjern forsiktig halvparten av kulturmediene og erstatt med to mikromolar Ara-C, cytosin D-arabinofuranoside, et antimitotisk middel. La behandlingen stå på cellene i 48 timer. Vanligvis er denne lengden av behandlingen tilstrekkelig til å eliminere ikke-nevronale celler i kulturen.På dag tre, forsiktig aspirere halvparten av mediet og erstatte med kontrollmedium. På dag fire er cellene klare for eksperimentelle behandlinger. Mate kulturer annenhver dag med riktig medium.Forsiktig erstatte halvparten av mediet i brønnen med friskt medium. Bildet på dag fem viser omfattende aksonal vekst uten dendrittisk vekst observert. For å indusere dendrittisk vekst, kan nevroner dyrkes på Matrigel eller behandles med 10% serum eller 50 nanogram per milliliter beinmorfogenetisk protein-7.Figur to viser endringer i nevronal morfologi av E21 rotte SCG nevroner etter behandling med BMP-7. Representative fasekontrastmikrografer ved 10 X forstørrelse viser den sirkulære nevronale cellekroppen med aksoner i kontrollnevroner i panel A, og nevroner med flere korte dendrittlignende prosesser når de behandles med BMP-7 vist av pilene i panel B.Cultured SCG-nevroner etter passende behandlinger kan brukes til morfologisk analyse ved hjelp av immunocytokmisk farging for genomisk analyse og for biokjemiske studier , for eksempel for proteomiske analyser. Se manuskriptet for detaljerte protokoller for immunstaining og prøveklargjøring for proteomisk analyse.Figur tre viser immunstaining fra MAP-2 protein i kultiverte embryonale rotter sympatiske nevroner. Panel A til D viser kultiverte SCG-nevroner behandlet med kontrollmedier og paneler E gjennom H viser nevroner behandlet med BMP-7 ved 50 nanogram per milliliter i fem dager. Representative mikrografer som viser immunocytokjemisk farging av nevronene med mikrotubuli assosiert protein-2 i C og G, en kjernefysisk flekk i D og H med fasekontrastmikrografer i B og F, og fremvoksende av de tre kanalene i A og D.Immunocytokjemisk farging fra mikrotubulitilknede protein-2 er tilstede i cellekroppen og proksimale aksoner av kontrollnevroner i panel C.Og farging fra MAP-2 protein i cellekroppen , og dendritt i BMP-7 behandlede nevroner er i panel G.Her er en prøvekjøring av overlegen cervical ganglia behandlet med kontrollmedier, som oppdaget 1100 proteiner.Genontologi ved hjelp av Panther-databasen fant at de fleste proteinene var cytoplasmatiske. Det var imidlertid membranbundne proteiner og proteiner ved cellulære veikryss i prøven. Denne analysen viste også at proteiner som er involvert i et bredt spekter av nevronale signalveier ble oppdaget i prøven.Til slutt, etter å ha sett denne videoen, bør du kunne isolere og kultur rotte embryonale overlegen cervical ganglion nevroner for morfologiske og proteomisk analyse. Dette arbeidet ble finansiert av fakultetets utviklingsfond og sommerforskningsprogram ved Saint Mary's College of California.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Autonomic Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovaskulær Støping av Adult Mouse for 3D Imaging og morfologisk analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Inducing dendrittiske Veksten i dyrkede sympatiske Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Produksjon og Isolering av Axoner fra sensoriske nevroner for Biokjemisk analyse ved hjelp Porøse Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

En Måte Nodose ganglia Injeksjon i Sprague-Dawley Rat

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Diffusjon Imaging i Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Funksjonell og Morfologisk Vurdering av Membran Innervasjon av phrenic motoriske nerveceller

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens og Bioluminesens Imaging av subcellulære Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampus nevroner

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...