Name: culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis
Uploaded: 2020-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Desenvolvimento da Faculdade e pelo Programa de Pesquisa de Verão do Saint Mary's College of California. Os autores também gostariam de agradecer à Dra. Os autores também gostariam de agradecer Haley Nelson no Escritório de Comunicações Universitárias do Saint Mary's College of California por sua ajuda na produção e edição de vídeo.

Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Saint Mary's College of California. As diretrizes de cuidado e uso de animais no Colégio Santa Maria foram desenvolvidas com base nas diretrizes fornecidas pelo Escritório de Bem-Estar Animal Laboratorial do Instituto Nacional de Saúde (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf e https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-L...

<ol>
	<li>Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+Changes+in+the+neuritic+growth+cone+and+target+neuron+during+synaptic+junction+development+in+culture.">Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture.</a> Journal of Cell Biology. 9, (1976).</li><li>Chandrasekaran, V., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Dendritogenesis+in+Sympathetic+Neurons.">Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons.</a> Autonomic Nervous System. , (2018).</li><li>Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neuronal+polarity.">Mechanisms of neuronal polarity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).</li><li>Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Extracellular+Matrix+And+Osteogenic+Protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons.">The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).</li><li>Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-2+and+retinoic+acid+induce+neurotrophin-3+responsiveness+in+developing+rat+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons.</a> Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).</li><li>Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+the+survival+and+response+to+nerve+growth+factor+of+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons.</a> Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).</li><li>Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlstr&#246;m, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+light+chain+and+synaptotagmin+I+in+rat+sympathetic+neurons.">Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).</li><li>Harris, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Guidance+by+a+Decellularized+Fibroblast+Extracellular+Matrix.">Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix.</a> Matrix Biology. , 176-189 (2017).</li><li>Wingerd, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4+integrins+and+vascular+cell+adhesion+molecule-1+play+a+role+in+sympathetic+innervation+of+the+heart.">&#945;4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart.</a> Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+autonomic+neurons.">Tissue culture of autonomic neurons.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture.</a> Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).</li><li>Voyvodic, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+dendrites+in+the+rat+superior+cervical+ganglion.">Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).</li><li>Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Responses+of+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons+during+BMP-7-Induced+Dendritic+Growth.">Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth.</a> PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).</li><li>Pravoverov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+Necessary+for+BMP-7-induced+Dendritic+Growth+in+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons.">MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).</li><li>Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitative+analyses+of+microRNAs+located+in+the+distal+axons+of+sympathetic+neurons.">Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons.</a> RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).</li><li>Aschrafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+mediates+the+axonal+trafficking+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+&#946;-hydroxylase+mRNAs+and+enhances+norepinephrine+synthesis+in+primary+sympathetic+neurons.">Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine &#946;-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).</li><li>Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).</li><li>Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+is+localized+to+the+dendrites+of+hippocampal+neurons+which+develop+in+culture.">MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture.</a> Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).</li><li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER+version+11:+Expanded+annotation+data+from+Gene+Ontology+and+Reactome+pathways,+and+data+analysis+tool+enhancements.">PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).</li><li>Chandrasekaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+the+morphological+development+of+sympathetic+neurons.">Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons.</a> Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).</li><li>Courter, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7-induced+dendritic+growth+in+sympathetic+neurons+requires+p75+NTR+signaling.">BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling.</a> Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).</li><li>Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+Autonomic+and+Enteric+Neurons.">Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+isolation+and+culture+of+mouse+embryonic+motoneurons.">Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+device+for+co-culture+of+sympathetic+neuron+and+iPS-derived+cardiomyocytes.">Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes.</a> Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+semi-separated+co-culture+system+of+sympathetic+neuron+and+cardiomyocyte.">Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte.</a> Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).</li><li>Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+are+involved+in+BMP-induced+dendritic+growth+in+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).</li><li>Kim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+decrease+dendritic+arborization+in+rat+sympathetic+neurons+by+blocking+RhoA+activation.">Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+Primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Szpara, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+during+neurite+outgrowth+and+regeneration.">Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration.</a> BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).</li><li>Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rapigest+efficacy+for+the+digestion+of+proteins+from+cell+cultures+and+heart+tissue.">Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue.</a> Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).</li><li>Vit, O., Petrak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+proteins+in+proteomics.+How+to+break+open+the+black+box.">Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box.</a> Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).</li></ol>

Este artigo descreve os protocolos para cultivar neurônios simpáticos de gânglios cervicais superiores de filhotes de ratos embrionários. As vantagens de utilizar esse sistema modelo são que é possível obter uma população homogênea de neurônios fornecendo uma resposta semelhante aos fatores de crescimento, e como os requisitos do fator de crescimento para esses neurônios têm sido bem caracterizados, é possível cultivar esses neurônios in vitro em meios definidos, sob condições livres de soro<sup class="...

Neurônios simpáticos derivados de gânglios cervicais superiores embrionários (SCG) têm sido amplamente utilizados como um sistema de cultura neuronal primária para estudar muitos aspectos do desenvolvimento neuronal, incluindo a dependência do fator de crescimento, interações neurônio-alvo, sinalização neurotransmissor, crescimento axonal, desenvolvimento de dendrite e plasticidade, sinápsogênese e mecanismos de sinalização subjacentes às interações nervo-alvo/neurônio-glia1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9. Apesar de seu pequeno tamanho (cerca de 10000 neurônios/gânglios), existem três razões principais para o desenvolvimento e uso extensivo desse sistema cultural serem i) sendo o primeiro gânglio na cadeia simpática, eles são maiores e, portanto, mais fáceis de isolar, do que o resto da gânglio simpático10; ii) ao contrário dos neurônios centrais, os neurônios no SCG são bastante homogêneos com todos os neurônios sendo derivados da crista neural, tendo um tamanho semelhante, dependência do fator de crescimento nervoso e sendo nor-adrenérgico. Isso os torna um modelo valioso para estudos morfológicos e genômicos10,,11 e iii) esses neurônios podem ser mantidos em um meio definido sem soro contendo fator de crescimento nervoso por mais de um mês10,12. Os neurônios SCG perinatal têm sido amplamente utilizados para estudar os mecanismos subjacentes à iniciação e manutenção dos dendritos2. Isso ocorre principalmente porque, embora os neurônios SCG tenham uma extensa arbor ndrítica in vivo, eles não estendem dendritos in vitro na ausência de soro, mas podem ser induzidos a cultivar dendritos na presença de certos fatores de crescimento, como proteínas morfogenéticas ósseas2,,12,,13.
Este artigo descreve o protocolo para isolar e culminar neurônios SCG de ratos embrionários. Nos últimos 50 anos, as culturas neuronais primárias do SCG têm sido utilizadas principalmente para estudos morfológicos com um número limitado de estudos examinando as mudanças genômicas ou proteômicas em larga escala. Isso se deve principalmente ao pequeno tamanho do tecido, resultando no isolamento de baixas quantidades de DNA ou proteína, o que dificulta a realização de análises genômicas e proteômicas nesses neurônios. No entanto, nos últimos anos, o aumento da sensibilidade à detecção permitiu o desenvolvimento de métodos para examinar o genoma, o miRNome e o proteome nos neurônios SCG durante o desenvolvimento do crescimento dendrítico14,,15,,16,17. Este artigo também descreverá o método de análise morfológica desses neurônios usando a imunocitoquímica e um protocolo para obter extratos de proteína neuronal para análise espectrométrica de massa.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2D nanoACQUITY</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>354-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200, 140675, 142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine- &#946;- D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126609</td>
			<td>20 mg/mL stock in low glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps Dumont no.4 and no.5</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>5621, 5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and Scissors for Dissection</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1328, 1329, 5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverlips - 12mm</td>
			<td>Neuvitro Corporation</td>
			<td>GG-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media for glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36931, P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor</td>
			<td>Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)</td>
			<td>BT5017</td>
			<td>Stock 125 &#956;g/mL in 0.2% Prionex in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>P1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prionex</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>529600</td>
			<td>10% solution, 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001861</td>
			<td>5 X 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro acetic acid - Sequencing grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td>10 X 1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega or NEB</td>
			<td>V511A, P8101S</td>
			<td>100 &#956;g or 5 X 20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186000385c</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis

Neurônios simpáticos da gânglio cervical superior de rato embrionário (SCG) têm sido usados como um sistema modelo in vitro para neurônios periféricos estudarem crescimento axonal, tráfico axonal, sinápgeno, crescimento dendrático, plasticidade dendrítica e interações de alvo nervoso em sistemas de cocultura. Este protocolo descreve o isolamento e dissociação de neurônios da gânglio cervical superior dos embriões de ratos E21, seguido pela preparação e manutenção de culturas neuronais puras em meio livre de soro. Como os neurônios não aderem ao plástico não revestido, os neurônios serão cultivados em tampas de vidro de 12 mm ou em placas de 6 poços revestidas com poli-D-lisina. Após o tratamento com um agente antimitotico (Ara-C, citose β-D-arabinofuranoside), este protocolo gera culturas neuronais saudáveis com menos de 5% de células não neuronais, que podem ser mantidas por mais de um mês in vitro. Embora os neurônios SCG de ratos embrionários sejam multipolares com dendritos de 5-8 in vivo; sob condições livres de soro, esses neurônios estendem apenas um único axônio na cultura e continuam a ser unipolares durante a duração da cultura. No entanto, esses neurônios podem ser induzidos a estender dendritos na presença de extrato de membrana do porão, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), ou 10% de soro fetal da panturrilha. Essas culturas neuronais homogêneas podem ser utilizadas para coloração imunocitológica e para estudos bioquímicos. Este artigo também descreve o protocolo otimizado para coloração imunocitômica para microtúbulos associados à proteína-2 (MAP-2) nesses neurônios e para a preparação de extratos neuronais para espectrometria de massa.

Isolar e manter culturas neuronais de neurônios SCG embrionários As células dissociadas do SCG embrionário de rato foram banhadas em uma placa revestida de poli-D-lisina ou deslizamento de cobertura e mantidas em meios de cultura livre de soro contendo fator de crescimento b-nervo. As células dissociadas contendo uma mistura de neurônios e células gliais parecem circulares sobre o revestimento(Figura 1A). Dentro de 24 horas após o revestimento, os neurônios esten...

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Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Este artigo descreve o isolamento e a culminação de neurônios simpáticos de ratos embrionários da gânglio cervical superior. Também fornece protocolos detalhados para coloração imunocitoquímica e para preparação de extratos neuronais para análise espectrométrica em massa.

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

Neste vídeo, estaremos demonstrando a culminação da gânglio cervical superior de ratos embrionários para análise morfológica e proteômica. Antes de iniciar a dissecção, prepare o controle e a dissecação dos meios de comunicação. O meio de controle contém F-12 e DMEM de baixa glicose suplementado com uma mistura de insulina-selênio-transferrina, glutamina, fator de crescimento nervoso e BSA.O meio de dissecção contém L-15 complementado com pen-estreptococos e BSA. Consulte o manuscrito para obter protocolos detalhados para preparação da mídia. Preparação de placas para os neurônios de cultivo.Diluir um miligrama por mililitro de poli-D-lysine a 100 microgramas por mililitro com água destilada estéril. Para análise proteômica ou genômica, de um a dois dias antes da dissecção, cubra placas de seis poços com aproximadamente dois mililitros de 100 gramas estéreis por mililitro de poli-D-lysine. Isso é necessário para garantir a adesão celular ao poço.Enrole as placas com filme agarrado e armazene as placas durante a noite a quatro graus Celsius. No dia da dissecção, antes do início da dissecção, remova a solução de poli-D-lysine dos poços e enxágue os poços cinco vezes com água destilada estéril, seguida por uma vez com DMEM de baixa glicose. Durante a digestão enzimática do gânglio, aproximadamente uma hora antes de emplacamento das células, aspire o DMEM das placas e substitua-o por 0,3 mililitros de meio de controle.Armazene as placas a 35 graus Celsius abaixo de 5% de CO2 em uma câmara umidificada. No capô, configure os seguintes itens para dissecção. Quatro tubos cônicos estéreis de 50 mililitros com cerca de 20 mililitros de mídia de dissecção em cada tubo.Quatro pratos estéreis de 35 milímetros com 1,5 mililitros de mídia de dissecção. Um tubo cônico estéril de 50 mililitros com 20 mililitros de mídia de dissecção para centrifugação. Um tubo cônico estéril de 15 mililitros para centrifugar o gânglio, um tubo estéril de 10 mililitros para coletar as células dissociadas.Use um esterilizador de contas secas para esterilizar um par de fórceps finos por pelo menos um minuto. Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Saint Mary's College of California. As diretrizes de cuidado e uso de animais no Saint Mary's College of California foram desenvolvidas com base em diretrizes fornecidas pelo Escritório de Bem-Estar Animal Laboratorial dos Institutos Nacionais de Saúde.Remoção de embriões E21 da rato grávida. Observe que a remoção da buzina uterina pode ser realizada fora do capô se a área circundante estiver completamente esterilizada. Eutanize um rato grávida com inalação de CO2.Tesourar a pele da região abdominal e limpar a pele na área com 70% de álcool para esterilizá-la. Usando um conjunto fresco de tesouras estéreis e fórceps, corte a pele e, em seguida, o músculo para expor os chifres uterinos contendo os embriões. Remova o chifre uterino com os embriões, utilizando um novo conjunto de tesouras e fórceps, tomando cuidado para não danificar os intestinos no processo.Transfira o chifre uterino com os embriões em placa de Petri estéril de 150 milímetros e transfira-os para o capô. Usando um novo conjunto de fórceps e tesouras, remova os embriões do chifre uterino e separe os embriões das membranas amnióticas e da placenta. Para eutanásia dos embriões, corte a medula espinhal dos embriões ao longo da linha média sob o braço direito.Isso reduzirá o sangramento da artéria carótida durante a remoção do SCG. Transfira esses embriões para os tubos cônicos preparados de 50 mililitros contendo mídia de dissecção. Certifique-se de que os embriões estão submersos na mídia.Cada tubo pode conter até três embriões. Isolamento do gânglio cervical superior do embrião. Transfira um filhote da mídia de dissecção para uma placa de Petri estéril de 150 milímetros meio cheia de substrato sólido com sua superfície dorsal no substrato.Usando três agulhas estéreis de calibre 23, fixe o pub no prato com uma agulha sob cada braço e uma terceira agulha através da boca para hiperextendar cuidadosamente o pescoço. Corte a pele na região do pescoço usando fórceps finos estéreis para expor as glândulas salivares por baixo. Remova essas glândulas usando fórceps finos.Localize os músculos estenicleidomastoide e omoidóides perto da clavícula e traqueia, respectivamente. Primeiro, corte os músculos estenicleidomastoides transversais. E então corte cuidadosamente o músculo omomóide fino usando fórceps finos.Uma vez removidos esses músculos, a bifurcação na artéria carótida na extremidade anterior, será visível em ambos os lados da traqueia com o SCG localizado sob este garfo na artéria carótida. Usando fórceps fechados, levante suavemente a artéria carótida para visualizar o SCG. Usando um fórceps em ambos os lados do SCG, retire a carótida e transfira-a para os pratos estéreis preparados de 35 milímetros.Este tecido provavelmente conterá o SCG com a artéria carótida, o nervo vago com o gânglios de nodose, bem como outros segmentos de músculo ou gordura na área. Repita o processo de dissecção do outro lado. Remova os SCGs de todos os embriões antes de continuar com as etapas de dissecção restantes descritas.Distribua os tecidos isolados entre dois dos pratos de 35 milímetros para facilitar o processamento das amostras de tecido. Pós-processamento do SCG. Para separar o SCG do tecido dissecado, primeiro utilize fórceps finos para remover qualquer tecido ínteo, como músculo ou gordura, tomando cuidado para evitar a área próxima à bifurcação carótida.Uma vez que esses tecidos foram removidos, dois gânglios são visíveis. O gânglio de nodose é menor e circular, enquanto o SCG tem forma de amêndoa. Puxe suavemente o nervo vago para separar o nervo vago e o gânglio nodose da carótida e, em seguida, separar o SCG da artéria carótida.Use fórceps finos para remover a cápsula que circunda o SCG. Transfira o SCG para um novo prato de cultura de 35 milímetros. Repita este processo com todas as amostras de tecido dissecado.Cubra uma pipeta de vidro esterilizada e plugada de algodão com mídia de dissecção para evitar que o tecido adque nas paredes da pipeta. Use a pipeta para substituir a mídia de dissecção por dois mililitros estéreis de colagenase tipo II, dispase tipo II em HBSS sem cálcio e magnésio e incubar por 50 minutos a 37 graus Celsius para ajudar a quebrar os tecidos. Observe que os tempos de incubação podem precisar ser otimizados com diferentes lotes de colagenase/dispase e geralmente varia de 40 minutos a uma hora.Após a incubação, transfira os SCGs e a colagem/dispase para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Use a mídia de dissecção para enxaguar as placas e transferir a solução para o tubo. Adicione mídia de dissecção suficiente para levar o volume a aproximadamente 10 mililitros.Centrifugar a 200 x g, 1.000 a 1.200 rpm por cinco minutos em temperatura ambiente para pelotar a amostra. Aspire o supernatante, tomando o cuidado de não desalojar a pelota. Resuspenque a pelota com 10 mililitros de mídia de dissecção, repita a centrifugação e descarte o supernatante.Substitua por um a dois mililitros de meio de cultura. Usando uma pipeta pasteur estéril de furo estreito, pré-revestida com meio de cultura, dissociar mecanicamente as moitas triturando suavemente cinco a seis vezes. Deixe os aglomerados maiores se contentarem por cerca de um minuto e transfira a suspensão celular supernacante para um novo tubo de 10 mililitros.Repita este processo mais três vezes com força crescente de trituração cada vez para garantir a dissociação quase completa dos SCGs. Transfira o supernante após cada rodada de trituração para o tubo de 10 mililitros com o sobrenante da primeira trituração. Adicione mídia cultural suficiente para trazer o volume para oito a 10 mililitros.Misture suavemente uma suspensão celular e quantifique a densidade celular com um hemótmetro. Distribua a suspensão celular nos poços na densidade celular apropriada para os experimentos. Misture continuamente a suspensão da célula durante o processo de revestimento para garantir a distribuição uniforme das células nos poços.Para análise morfológica, a placa das células em torno de 8.000 células por poço em uma placa de 24 poços. E para protocolos genômicos e proteômicos, assode as células até 30.000 células por poço. Transfira as placas para um desiccador de vidro com água estéril na parte inferior para criar uma câmara umidificada.Injete CO2 suficiente, em torno de 120 mililitros, para obter um ambiente de CO2 de 5% no desiccator, antes da vedação. Mantenha as placas a 35,5 graus Celsius. Isso é referido como o dia zero no protocolo.Essas placas também podem ser mantidas em uma incubadora regular de 5% de CO2. O método descrito acima minimiza as mudanças de temperatura e pH e também ajuda a evitar a contaminação cruzada. Manutenção dos neurônios e tratamentos SCG cultivados.Estas fotos mostram as células gânglios cervicais superiores dissociadas no dia zero, primeiro dia e quinto dia. A imagem do dia zero mostra as células ao chapeamento. As células banhadas no dia zero contêm uma mistura de células neuronais e não neuronais.No primeiro dia, 24 horas após o revestimento, remova cuidadosamente metade da mídia cultural e substitua por dois micromolar Ara-C, citosina D-arabinofuranoside, um agente anti-mitotístico. Deixe o tratamento nas células por 48 horas. Normalmente, esse comprimento de tratamento é suficiente para eliminar células não neuronais na cultura.No terceiro dia, aspire suavemente metade do meio e substitua com meio de controle. No quarto dia, as células estão prontas para tratamentos experimentais. Alimentar culturas a cada dois dias com o meio apropriado.Substituindo suavemente metade do meio no poço por meio fresco. O quadro do quinto dia mostra um crescimento axonal extenso sem crescimento dendrático observado. Para induzir o crescimento dendrítico, os neurônios podem ser cultivados em Matrigel ou tratados com 10% de soro ou 50 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea-7.A figura dois mostra alterações na morfologia neuronal dos neurônios SCG de ratos E21 após o tratamento com BMP-7. Micrografos de contraste de fase representativo em 10 X de ampliação mostram o corpo celular neuronal circular com axônios em neurônios de controle no painel A, e neurônios com múltiplos processos curtos de dendrite quando tratados com BMP-7 mostrados pelas setas no painel B.Neurônios cultivados SCGs após tratamentos apropriados podem ser usados para análise morfológica usando coloração imunocitômica para análise genômica e para estudos bioquímicos , como para análises proteômicas. Consulte o manuscrito para obter protocolos detalhados para imunosstaining e preparação de amostras para análise proteômica.A Figura Três mostra imunossuagem da proteína MAP-2 em ratos embrionários cultivados neurônios simpáticos. Os painéis A a D mostram neurônios SCG cultivados tratados com mídia de controle e painéis E a H mostram neurônios tratados com BMP-7 a 50 nanogramas por mililitro por cinco dias. Micrografos representativos mostrando a coloração imunocitoquímica dos neurônios com proteína associada a microtúbulos-2 em C e G, uma mancha nuclear em D e H com micrografias de contraste de fase em B e F, e emergem dos três canais em A e D.Milímbicos manchas de proteína associada a microtúbulos-2 está presente no corpo celular e axônios proximais de neurônios de controle no painel C.E manchas da proteína MAP-2 no corpo celular , e dendritos em neurônios tratados BMP-7 está no painel G.Aqui está uma amostra de gânglio cervical superior tratado com mídia de controle, que detectou 1.100 proteínas.A ontologia genética usando o banco de dados Panther descobriu que a maioria das proteínas eram citoplasmáticas. No entanto, havia proteínas e proteínas ligadas à membrana nas junções celulares na amostra. Esta análise também revelou que proteínas envolvidas em uma ampla gama de vias de sinalização neuronal foram detectadas na amostra.Em conclusão, depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de isolar e cultivar neurônios de gânglio cervical superior embrionários para análise morfológica e proteômica. Este trabalho foi financiado pelo fundo de desenvolvimento do corpo docente e pelo programa de pesquisa de verão no Saint Mary's College of California.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

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