Name: culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis
Uploaded: 2020-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la beca del Fondo de Desarrollo Docente y del Programa de Investigación de Verano en el Saint Mary's College of California. Los autores también quieren agradecer a la Dra. Pamela Lein de la Universidad de California en Davis y al Dr. Anthony Iavarone en la instalación de espectrometría de masas de UC Berkeley por sus consejos durante el desarrollo de estos protocolos. Los autores también quieren agradecer a Haley Nelson en la Oficina de Comunicaciones Universitarias del Saint Mary's College of California por su ayuda con la producción y edición de videos.

Todos los procedimientos realizados en estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Saint Mary's College of California. Las pautas de cuidado y uso de animales en Saint Mary's College se desarrollaron sobre la base de las directrices proporcionadas por la Oficina de Bienestar Animal de Laboratorio en el Instituto Nacional de Salud (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf y https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care...

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	<li>Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+Changes+in+the+neuritic+growth+cone+and+target+neuron+during+synaptic+junction+development+in+culture.">Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture.</a> Journal of Cell Biology. 9, (1976).</li><li>Chandrasekaran, V., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Dendritogenesis+in+Sympathetic+Neurons.">Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons.</a> Autonomic Nervous System. , (2018).</li><li>Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neuronal+polarity.">Mechanisms of neuronal polarity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).</li><li>Lein, P., Guo, X., Hedges, A. 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C., Magal, E., Varon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+the+survival+and+response+to+nerve+growth+factor+of+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons.</a> Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).</li><li>Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlstr&#246;m, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+light+chain+and+synaptotagmin+I+in+rat+sympathetic+neurons.">Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).</li><li>Harris, G. 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A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture.</a> Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).</li><li>Voyvodic, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+dendrites+in+the+rat+superior+cervical+ganglion.">Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).</li><li>Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Responses+of+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons+during+BMP-7-Induced+Dendritic+Growth.">Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth.</a> PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).</li><li>Pravoverov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+Necessary+for+BMP-7-induced+Dendritic+Growth+in+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons.">MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).</li><li>Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).</li><li>Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+is+localized+to+the+dendrites+of+hippocampal+neurons+which+develop+in+culture.">MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture.</a> Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).</li><li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER+version+11:+Expanded+annotation+data+from+Gene+Ontology+and+Reactome+pathways,+and+data+analysis+tool+enhancements.">PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).</li><li>Chandrasekaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+the+morphological+development+of+sympathetic+neurons.">Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons.</a> Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).</li><li>Courter, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7-induced+dendritic+growth+in+sympathetic+neurons+requires+p75+NTR+signaling.">BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling.</a> Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).</li><li>Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+Autonomic+and+Enteric+Neurons.">Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+isolation+and+culture+of+mouse+embryonic+motoneurons.">Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+device+for+co-culture+of+sympathetic+neuron+and+iPS-derived+cardiomyocytes.">Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes.</a> Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+semi-separated+co-culture+system+of+sympathetic+neuron+and+cardiomyocyte.">Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte.</a> Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).</li><li>Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+are+involved+in+BMP-induced+dendritic+growth+in+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).</li><li>Kim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+decrease+dendritic+arborization+in+rat+sympathetic+neurons+by+blocking+RhoA+activation.">Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+Primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Szpara, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+during+neurite+outgrowth+and+regeneration.">Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration.</a> BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).</li><li>Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rapigest+efficacy+for+the+digestion+of+proteins+from+cell+cultures+and+heart+tissue.">Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue.</a> Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).</li><li>Vit, O., Petrak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+proteins+in+proteomics.+How+to+break+open+the+black+box.">Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box.</a> Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).</li></ol>

Este artículo describe los protocolos para el cultivo de neuronas simpáticas de ganglios cervicales superiores de cachorros de rata embrionaria. Las ventajas de utilizar este sistema modelo son que es posible obtener una población homogénea de neuronas proporcionando una respuesta similar a los factores de crecimiento, y dado que los requisitos del factor de crecimiento para estas neuronas ha sido bien caracterizado, es posible crecer estas neuronas in vitro en medios definidos, en condiciones libres de suero<sup cla...

Las neuronas simpáticas derivadas de los ganglios cervicales superiores embrionarios (SCG) se han utilizado ampliamente como un sistema de cultivo neuronal primario para estudiar muchos aspectos del desarrollo neuronal, incluida la dependencia del factor de crecimiento, interacciones neuron-target, señalización de neurotransmisores, crecimiento axonal, desarrollo de dendrita y plasticidad, sinaptogénesis y mecanismos de señalización subyacentes a las interacciones nervio-objetivo/neurona-glia1,2,3,4,5,6,7,8,9. A pesar de su pequeño tamaño (alrededor de 10000 neuronas/ganglia), hay tres razones principales para el desarrollo y el uso extensivo de este sistema de cultivo son i) siendo los primeros ganglios en la cadena simpática, son más grandes, y por lo tanto más fáciles de aislar, que el resto de los ganglios simpáticos10; ii) a diferencia de las neuronas centrales, las neuronas en el SCG son bastante homogéneas con todas las neuronas que se derivan de la cresta neural, teniendo un tamaño similar, dependencia del factor de crecimiento nervioso y ser no-adrenergic. Esto los convierte en un modelo valioso para los estudios morfológicos y genómicos10,,11 y iii) estas neuronas se pueden mantener en un medio sin suero definido que contiene factor de crecimiento nervioso durante más de un mes10,,12. Las neuronas SCG perinatales se han utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos subyacentes a la iniciación y mantenimiento de dendritas2. Esto se debe principalmente a que, aunque las neuronas SCG tienen un árbol pródrico extenso in vivo, no extienden las dendritas in vitro en ausencia de suero, sino que pueden ser inducidas a crecer dendritas en presencia de ciertos factores de crecimiento como las proteínas morfogenéticas óseas2,,12,,13.
Este artículo describe el protocolo para aislar y cultivar las neuronas DE SCG de rata embrionaria. En los últimos 50 años, las culturas neuronales primarias del SCG se han utilizado principalmente para estudios morfológicos con un número limitado de estudios que examinan los cambios genómicos o proteómicos a gran escala. Esto se debe principalmente al pequeño tamaño del tejido que resulta en el aislamiento de bajas cantidades de ADN o proteína, lo que dificulta la realización de análisis genómicos y proteómicos en estas neuronas. Sin embargo, en los últimos años, el aumento de la sensibilidad de detección ha permitido el desarrollo de métodos para examinar el genoma, miRNome y proteoma en las neuronas SCG durante el desarrollo del crecimiento dendrítico14,,15,,16,,17. Este artículo también describirá el método para el análisis morfológico de estas neuronas utilizando inmunocitoquímica y un protocolo para obtener extractos de proteína neuronal para el análisis espectrométrico de masas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2D nanoACQUITY</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>354-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200, 140675, 142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine- &#946;- D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126609</td>
			<td>20 mg/mL stock in low glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps Dumont no.4 and no.5</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>5621, 5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and Scissors for Dissection</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1328, 1329, 5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverlips - 12mm</td>
			<td>Neuvitro Corporation</td>
			<td>GG-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media for glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36931, P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor</td>
			<td>Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)</td>
			<td>BT5017</td>
			<td>Stock 125 &#956;g/mL in 0.2% Prionex in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>P1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prionex</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>529600</td>
			<td>10% solution, 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001861</td>
			<td>5 X 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro acetic acid - Sequencing grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td>10 X 1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega or NEB</td>
			<td>V511A, P8101S</td>
			<td>100 &#956;g or 5 X 20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186000385c</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis

Las neuronas simpáticas de los ganglios cervicales superiores de rata embrionaria (SCG) se han utilizado como un sistema modelo in vitro para las neuronas periféricas para estudiar el crecimiento axonal, el tráfico de axonales, la sinaptogénesis, el crecimiento dendrítico, la plasticidad dendrítica y las interacciones nervio-objetivo en los sistemas de cultivo cooperativo. Este protocolo describe el aislamiento y la disociación de las neuronas de los ganglios cervicales superiores de los embriones de rata E21, seguido de la preparación y el mantenimiento de cultivos neuronales puros en medio libre de suero. Dado que las neuronas no se adhieren al plástico sin recubrimiento, las neuronas se cultivarán en cubiertas de vidrio de 12 mm o placas de 6 pocillos recubiertas con poli-D-lisina. Después del tratamiento con un agente antimitotico (Ara-C, citosina-D-arabinofuranoside), este protocolo genera cultivos neuronales saludables con menos del 5% de células no neuronales, que se pueden mantener durante más de un mes in vitro. Aunque las neuronas de SCG de rata embrionaria son multipolares con 5-8 dendritas in vivo; en condiciones libres de suero, estas neuronas extienden sólo un axón en el cultivo y continúan siendo unipolares durante el cultivo. Sin embargo, estas neuronas se pueden inducir para extender las dendritas en presencia de extracto de membrana del sótano, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), o 10% suero de ternera fetal. Estos cultivos neuronales homogéneos se pueden utilizar para la tinción inmunocitoquímica y para estudios bioquímicos. Este artículo también describe el protocolo optimizado para la tinción inmunocitoquímica para la proteína asociada a microtúbulos-2 (MAP-2) en estas neuronas y para la preparación de extractos neuronales para espectrometría de masas.

Aislamiento y mantenimiento de cultivos neuronales de neuronas de SCG embrionarias Las células disociadas del SCG embrionario de rata fueron chapadas en una placa o cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina y mantenidas en medios de cultivo libres de suero que contienen factor de crecimiento del nervio b. Las células disociadas que contienen una mezcla de neuronas y células gliales se ven circulares sobre el chapado (Figura 1A). Dentro de las 24 horas posteriores al en...

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Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Este artículo describe el aislamiento y el cultivo de las neuronas simpatizantes de ratas embrionarias de los ganglios cervicales superiores. También proporciona protocolos detallados para la tinción inmunocitoquímica y para la preparación de extractos neuronales para el análisis espectrométrico de masas.

Cultivar neuronas simpáticas de ratas de Ganglia cervical superior embrionario para análisis morfológico y proteómico

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

En este video, estaremos demostrando el cultivo de ganglios cervicales superiores a ratas embrionarias para el análisis morfológico y proteómico. Antes de comenzar la disección, prepare los medios de control y disección. Medio de control contiene F-12 y baja glucosa DMEM complementado con una mezcla de insulina-selenio-transferrina, glutamina, factor de crecimiento nervioso, y BSA.El medio de disección contiene L-15 complementado con estreptococo y BSA. Consulte el manuscrito para obtener protocolos detallados para la preparación de los medios. Preparación de placas para el cultivo de neuronas.Diluir un stock de un miligramo por mililitro de poli-D-lisina a 100 microgramos por mililitro con agua destilada estéril. Para el análisis proteómico o genómico, uno a dos días antes de la disección, recubrir placas de seis pocillos con aproximadamente dos mililitros de 100 gramos estériles por mililitro de poli-D-lisina. Esto es necesario para asegurar la adhesión celular al pozo.Envuelva los platos con película de aferramiento y guarde los platos durante la noche a cuatro grados centígrados. El día de la disección, antes del inicio de la disección, retire la solución de poli-D-lisina de los pozos y enjuague los pozos cinco veces con agua destilada estéril, seguida de una vez con DMEM de baja glucosa. Durante la digestión enzimática de los ganglios, aproximadamente una hora antes de encoar las células, aspirar el DMEM de las placas y reemplazarlo con 0,3 mililitros de medio de control.Almacene las placas a 35 grados centígrados bajo 5% CO2 en una cámara humidificada. En el capó, configure los siguientes elementos para la disección. Cuatro tubos cónicos estériles de 50 mililitros con unos 20 mililitros de medios de disección en cada tubo.Cuatro platos estériles de 35 milímetros con 1,5 mililitros de medios de disección. Un tubo cónico estéril de 50 mililitros con 20 mililitros de medios de disección para centrifugación. Un tubo cónico estéril de 15 mililitros para centrifugar los ganglios, un tubo estéril de 10 mililitros para recoger las células disociadas.Utilice un esterilizador de perlas secas para esterilizar un par de fórceps finos durante al menos un minuto. Todos los procedimientos realizados en estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Saint Mary's College de California. Las pautas de cuidado y uso de animales en el Saint Mary's College of California se desarrollaron sobre la base de las directrices proporcionadas por la Oficina de Bienestar Animal de Laboratorio en los Institutos Nacionales de Salud.Extirpación de embriones E21 de la rata embarazada. Tenga en cuenta que la eliminación de la bocina uterina se puede realizar fuera de la campana si el área circundante está completamente esterilizada. Eutanasiar una rata embarazada con inhalación de CO2.Corta el pelaje de la región abdominal y limpia la piel de la zona con 70% de alcohol para esterilizarlo. Usando un nuevo conjunto de tijeras estériles y fórceps, cortar a través de la piel y luego el músculo para exponer los cuernos uterinos que contienen los embriones. Retire el cuerno uterino con los embriones, utilizando un nuevo conjunto de tijeras y fórceps, teniendo cuidado de no dañar los intestinos en el proceso.Transfiera el cuerno uterino con los embriones en una placa Petri estéril de 150 milímetros y transfiéralas a la capucha. Usando un nuevo conjunto de fórceps y tijeras, retire los embriones del cuerno uterino y separe los embriones de las membranas amnióticas y la placenta. Para eutanasiar los embriones, corte la médula espinal de los embriones a lo largo de la línea media bajo el brazo derecho.Esto reducirá el sangrado de la arteria carótida durante la extracción del SCG. Transfiera estos embriones a los tubos cónicos de 50 mililitros preparados que contienen medios de disección. Asegúrese de que los embriones estén sumergidos en los medios.Cada tubo puede contener hasta tres embriones. Aislamiento del ganglio cervical superior del embrión. Transfiera un cachorro del medio de disección a un plato estéril de 150 milímetros de Petri medio lleno de sustrato sólido con su superficie dorsal en el sustrato.Usando tres agujas estériles de calibre 23, coloque el pub en el plato con una aguja debajo de cada brazo y una tercera aguja a través de la boca para hiperextender cuidadosamente el cuello. Corte a través de la piel en la región del cuello usando fórceps finos estériles para exponer las glándulas salivales debajo. Retire estas glándulas usando fórceps finos.Localice los músculos esternocleidomastoide y omohyoid cerca de la clavícula y la tráquea respectivamente. Primero, corta los músculos esternocleidomastoideos transversales. Y luego cortar cuidadosamente el músculo omohyoid delgado usando fórceps finos.Una vez que se retiran estos músculos, la bifurcación en la arteria carótida en el extremo anterior, será visible a ambos lados de la tráquea con el SCG situado debajo de esta horquilla en la arteria carótida. Con fórceps cerrados, levante suavemente la arteria carótida para visualizar el SCG. Usando un fórceps a cada lado del SCG, extraiga la carótida y transfiérala a los platos estériles preparados de 35 milímetros.Lo más probable es que este tejido contenga el SCG con la arteria carótida, el nervio vago con los ganglios nodosos, así como otros segmentos de músculo o grasa en la zona. Repita el proceso de disección en el otro lado. Retire los SG de todos los embriones antes de continuar con los pasos de disección restantes descritos.Distribuir los tejidos aislados entre dos de los platos de 35 milímetros para facilitar el procesamiento de las muestras de tejido. Post-procesamiento del SCG. Para separar el SCG del tejido diseccionado, primero use fórceps finos para extraer cualquier tejido extraño, como músculo o grasa, teniendo cuidado de evitar el área cerca de la bifurcación carótida.Una vez que estos tejidos han sido retirados, dos ganglios son visibles. El ganglio nodoso es más pequeño y circular, mientras que el SCG tiene forma de almendra. Tire suavemente del nervio vago para separar el nervio vago y los ganglios nodosos de la carótida y luego separe el SCG de la arteria carótida.Utilice fórceps finos para extraer la cápsula que rodea el SCG. Transfiera el SCG a un nuevo plato de cultivo de 35 milímetros. Repita este proceso con todas las muestras de tejido diseccionado.Recubrir una pipeta de vidrio esterilizada, enchufada con algodón, con medios de disección para evitar que el tejido se adhire a las paredes de la pipeta. Utilice la pipeta para reemplazar el medio de disección por dos mililitros estériles de colágeno tipo II, dispase tipo II en HBSS libre de calcio y magnesio e incubar durante 50 minutos a 37 grados Celsius para ayudar a descomponer los tejidos. Tenga en cuenta que los tiempos de incubación pueden necesitar ser optimizados con diferentes lotes de colagenasa / dispase y por lo general oscila entre 40 minutos a una hora.Después de la incubación, transfiera los SG y la colagenasa/disase a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Utilice el soporte de disección para enjuagar las placas y transferir la solución al tubo. Agregue suficientes medios de disección para llevar el volumen a aproximadamente 10 mililitros.Centrifugar a 200 x g, 1.000 a 1.200 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente para peletizar la muestra. Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no desalojar el pellet. Resuspender el pellet con 10 mililitros de medios de disección, repetir la centrifugación y desechar el sobrenadante.Reemplace con uno o dos mililitros de medio de cultivo. Usando una pipeta Pasteur estéril de punta estrecha y doblada, precubre con un medio de cultivo, disocia mecánicamente los grumos triturando suavemente de cinco a seis veces. Deje que los grumos más grandes se conformen durante aproximadamente un minuto y transfieran la suspensión de la célula sobrenadante a un nuevo tubo de 10 mililitros.Repita este proceso tres veces más con una fuerza creciente de trituración cada vez para asegurar la disociación casi completa de los SCG. Transfiera el sobrenadante después de cada ronda de trituración al tubo de 10 mililitros con el sobrenadante de la primera trituración. Agregue suficientes medios de cultivo para llevar el volumen a ocho a 10 mililitros.Mezclar suavemente una suspensión celular y cuantificar la densidad celular con un hemocitoómetro. Distribuya la suspensión celular en los pozos con la densidad celular adecuada para los experimentos. Mezclar la suspensión celular continuamente durante el proceso de chapado para asegurar una distribución uniforme de las células en los pozos.Para el análisis morfológico, placar las células alrededor de 8.000 células por pozo en una placa de 24 pozos. Y para los protocolos genómicos y proteómicos, placa las células tan altas como 30.000 células por pozo. Transfiera las placas a un desecador de vidrio con agua estéril en la parte inferior para crear una cámara humidificada.Inyectar suficiente CO2, alrededor de 120 mililitros, para obtener un entorno de 5% CO2 en el desecador, antes del sellado. Mantenga las placas a 35,5 grados centígrados. Esto se conoce como día cero en el protocolo.Estas placas también se pueden mantener en una incubadora regular de 5% de CO2. El método descrito anteriormente minimiza los cambios de temperatura y pH y también ayuda a prevenir la contaminación cruzada. Mantenimiento de las neuronas y tratamientos SCG cultivados.Estas imágenes muestran las células de ganglios cervicales superiores disociadas en el día cero, el primer día y el día cinco. La imagen del día cero muestra las celdas al enchapar. Las células chapadas en el día cero contienen una mezcla de células neuronales y no neuronales.En el primer día, 24 horas después del enchapado, retire cuidadosamente la mitad de los medios de cultivo y reemplazar con dos micromolar Ara-C, citosina D-arabinofuranoside, un agente antimitético. Deje el tratamiento en las celdas durante 48 horas. Por lo general, esta duración del tratamiento es suficiente para eliminar las células no neuronales en el cultivo.En el tercer día, aspira suavemente la mitad del medio y sustituirlo por medio de control. En el cuarto día, las células están listas para tratamientos experimentales. Alimentar cultivos cada dos días con el medio adecuado.Sustitución suave de la mitad del medio en el pozo por un medio fresco. El cuadro del quinto día muestra un crecimiento axonal extenso sin crecimiento dendrítico observado. Para inducir el crecimiento dendrítico, las neuronas pueden cultivarse en Matrigel o tratarse con 10%suero o 50 nanogramos por mililitro de proteína morfogenética ósea-7.La figura dos muestra cambios en la morfología neuronal de las neuronas DE SCG de rata E21 después del tratamiento con BMP-7. Micrografías de contraste de fase representativas a 10 X de aumento muestran el cuerpo celular neuronal circular con axones en las neuronas de control en el panel A, y las neuronas con múltiples procesos cortos similares a la dendrita cuando se tratan con BMP-7 mostrados por las flechas en el panel B.Las neuronas SCG cultivadas siguiendo los tratamientos apropiados se pueden utilizar para el análisis morfológico utilizando la tinción inmunocitatoquímica para el análisis genómico y para estudios bioquímicos , por ejemplo, para análisis proteómicos. Consulte el manuscrito para conocer los protocolos detallados para la inmunosumanidad y la preparación de muestras para el análisis proteómico.La figura tres muestra la inmunosumanción de la proteína MAP-2 en ratas embrionarias cultivadas con neuronas simpáticas. Los paneles A a D muestran neuronas SCG cultivadas tratadas con medios de control y paneles E a H muestran neuronas tratadas con BMP-7 a 50 nanogramos por mililitro durante cinco días. Micrografías representativas que muestran la tinción inmunocitoquímica de las neuronas con proteína asociada a microtúbulos-2 en C y G, una mancha nuclear en D y H con micrografías de contraste de fase en B y F, y emergen de los tres canales en A y D.La tinción inmunocitoquímica de microtúbulo proteína asociada-2 está presente en el cuerpo celular y axones proximales de neuronas de control en el panel C.Y la tinción de la proteína MAP-2 en el cuerpo celular , y las dendritas en las neuronas tratadas con BMP-7 se encuentra en el panel G.Aquí hay una muestra de ganglios cervicales superiores tratados con medios de control, que detectaron 1.100 proteínas.La ontología genética utilizando la base de datos Panther encontró que la mayoría de las proteínas eran citoplasmáticos. Sin embargo, había proteínas y proteínas unidas a la membrana en las uniones celulares de la muestra. Este análisis también reveló que las proteínas que están involucradas en una amplia gama de vías de señalización neuronal se detectaron en la muestra.En conclusión, después de ver este video, usted debe ser capaz de aislar y cultivar las neuronas ganglionares cervicales superiores embrionarias de rata para el análisis morfológico y proteómico. Este trabajo fue financiado por el fondo de desarrollo de la facultad y el programa de investigación de verano en saint Mary's College of California.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Neurociencias

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Caracterización fisiológicas, morfológicas y neuroquímicas de las neuronas modulada por el Movimiento

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Fundición cerebrovascular del ratón adulto de imágenes en 3D y el análisis morfológico

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Inducir el crecimiento dendríticas en las neuronas simpáticas cultivadas

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Producción y aislamiento de los axones de las neuronas sensoriales para el análisis bioquímico Usando porosos Filtros

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