Name: culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis
Uploaded: 2020-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis at JoVE.com

Detta arbete stöddes av fakulteten utvecklingsfonden och Summer Research Program bidrag vid Saint Mary's College of California. Författarna vill också tacka Dr Pamela Lein vid University of California i Davis och Dr Anthony Iavarone på UC Berkeley Mass spektrometri anläggning för deras råd under utvecklingen av dessa protokoll. Författarna vill också tacka Haley Nelson i Office of College Communications vid Saint Mary's College of California för hennes hjälp med videoproduktion och redigering.

Alla förfaranden som utförts i studier med djur godkändes av institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Saint Mary's College of California. Riktlinjerna för djurvård och användning vid Saint Mary's College har utvecklats utifrån de riktlinjer som tillhandahålls av Office of Laboratory Animal Welfare vid National Institute for Health (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf och https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).</p...

<ol>
	<li>Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+Changes+in+the+neuritic+growth+cone+and+target+neuron+during+synaptic+junction+development+in+culture.">Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture.</a> Journal of Cell Biology. 9, (1976).</li><li>Chandrasekaran, V., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Dendritogenesis+in+Sympathetic+Neurons.">Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons.</a> Autonomic Nervous System. , (2018).</li><li>Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neuronal+polarity.">Mechanisms of neuronal polarity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).</li><li>Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Extracellular+Matrix+And+Osteogenic+Protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons.">The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).</li><li>Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-2+and+retinoic+acid+induce+neurotrophin-3+responsiveness+in+developing+rat+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons.</a> Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).</li><li>Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+the+survival+and+response+to+nerve+growth+factor+of+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons.</a> Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).</li><li>Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlstr&#246;m, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+light+chain+and+synaptotagmin+I+in+rat+sympathetic+neurons.">Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).</li><li>Harris, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Guidance+by+a+Decellularized+Fibroblast+Extracellular+Matrix.">Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix.</a> Matrix Biology. , 176-189 (2017).</li><li>Wingerd, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4+integrins+and+vascular+cell+adhesion+molecule-1+play+a+role+in+sympathetic+innervation+of+the+heart.">&#945;4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart.</a> Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+autonomic+neurons.">Tissue culture of autonomic neurons.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture.</a> Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).</li><li>Voyvodic, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+dendrites+in+the+rat+superior+cervical+ganglion.">Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).</li><li>Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Responses+of+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons+during+BMP-7-Induced+Dendritic+Growth.">Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth.</a> PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).</li><li>Pravoverov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+Necessary+for+BMP-7-induced+Dendritic+Growth+in+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons.">MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).</li><li>Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitative+analyses+of+microRNAs+located+in+the+distal+axons+of+sympathetic+neurons.">Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons.</a> RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).</li><li>Aschrafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+mediates+the+axonal+trafficking+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+&#946;-hydroxylase+mRNAs+and+enhances+norepinephrine+synthesis+in+primary+sympathetic+neurons.">Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine &#946;-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).</li><li>Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).</li><li>Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+is+localized+to+the+dendrites+of+hippocampal+neurons+which+develop+in+culture.">MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture.</a> Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).</li><li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER+version+11:+Expanded+annotation+data+from+Gene+Ontology+and+Reactome+pathways,+and+data+analysis+tool+enhancements.">PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).</li><li>Chandrasekaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+the+morphological+development+of+sympathetic+neurons.">Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons.</a> Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).</li><li>Courter, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7-induced+dendritic+growth+in+sympathetic+neurons+requires+p75+NTR+signaling.">BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling.</a> Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).</li><li>Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+Autonomic+and+Enteric+Neurons.">Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+isolation+and+culture+of+mouse+embryonic+motoneurons.">Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+device+for+co-culture+of+sympathetic+neuron+and+iPS-derived+cardiomyocytes.">Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes.</a> Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).</li><li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+semi-separated+co-culture+system+of+sympathetic+neuron+and+cardiomyocyte.">Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte.</a> Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).</li><li>Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+are+involved+in+BMP-induced+dendritic+growth+in+cultured+rat+sympathetic+neurons.">Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).</li><li>Kim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+decrease+dendritic+arborization+in+rat+sympathetic+neurons+by+blocking+RhoA+activation.">Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+Primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Szpara, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+during+neurite+outgrowth+and+regeneration.">Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration.</a> BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).</li><li>Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rapigest+efficacy+for+the+digestion+of+proteins+from+cell+cultures+and+heart+tissue.">Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue.</a> Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).</li><li>Vit, O., Petrak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+proteins+in+proteomics.+How+to+break+open+the+black+box.">Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box.</a> Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).</li></ol>

Detta papper beskriver protokollen för odling sympatisk nervceller från överlägsen livmoderhalscancer ganglier av embryonala råtta valpar. Fördelarna med att använda denna modell system är att det är möjligt att få en homogen population av nervceller ger ett liknande svar på tillväxtfaktorer, och eftersom tillväxtfaktorn kraven för dessa nervceller har varit väl -karakteriseras, är det möjligt att växa dessa nervceller in vitro i definierade medier, under serum-fria förhållanden10</...

Sympatiska nervceller som härrör från embryonala överlägsen livmoderhalscancer ganglier (SCG) har använts i stor utsträckning som en primär neuronal kultur system för att studera många aspekter av neuronal utveckling inklusive tillväxtfaktor beroende, neuron-target interaktioner, signalsignalering av signalsubstanser, axonal tillväxt, dendritutveckling och plasticitet, synaptogenes och signalmekanismer underliggande nerv-target/neuron-glia interaktioner1,2,3,4,5,6,77,8,9. Trots deras lilla storlek (runt 10000 nervceller/ganglier), det finns tre huvudsakliga skäl för utveckling och omfattande användning av detta kultursystem är i) är den första ganglierna i den sympatiska kedjan, de är större, och därför lättare att isolera, än resten av de sympatiska ganglierna10; ii) till skillnad från centrala nervceller, nervceller i SCG är ganska homogen med alla nervceller som härrör från neurala krönet, med en liknande storlek, beroende av nervtillväxtfaktor och är inte heller adrenerga. Detta gör dem till en värdefull modell för morfologiska och genomiskastudier 10,11 och iii) dessa nervceller kan bibehållas i ett definierat serumfritt medium som innehåller nervtillväxtfaktor i över en månad10,12. Perinatala SCG nervceller har använts i stor utsträckning för att studera de mekanismer som ligger till grund för inledande och underhåll av dendrites2. Detta beror främst på, även om SCG nervceller har en omfattande dendritisk arbor in vivo, de inte förlänga dendriter in vitro i avsaknad av serum men kan induceras att växa dendriter i närvaro av vissa tillväxtfaktorer såsom ben morfogenetiska proteiner2,12,13.
Detta dokument beskriver protokollet för att isolera och culturing embryonala råtta SCG nervceller. Under de senaste 50 åren har primära neuronala kulturer från SCG främst använts för morfologiska studier med ett begränsat antal studier som undersöker de storskaliga genomiska eller proteomiska förändringarna. Detta beror främst på liten vävnadsstorlek som resulterar i isolering av låga mängder DNA eller protein, vilket gör det svårt att utföra genomiska och proteomiska analyser på dessa nervceller. Under senare år har dock ökad detektionskänslighet möjliggjort utveckling av metoder för att undersöka genomet, miRNom och proteom i SCG-neuronerna under dendritisk tillväxtutveckling14,15,16,17. Detta dokument kommer också att beskriva metoden för morfologisk analys av dessa nervceller med hjälp av immuncytokemi och ett protokoll för att erhålla neuronal protein extrakt för masspektrometrisk analys.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2D nanoACQUITY</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>354-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Alumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200, 140675, 142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine- &#946;- D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126609</td>
			<td>20 mg/mL stock in low glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps Dumont no.4 and no.5</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>5621, 5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps and Scissors for Dissection</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1328, 1329, 5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverlips - 12mm</td>
			<td>Neuvitro Corporation</td>
			<td>GG-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Selenium-Transferrin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media for glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36931, P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor</td>
			<td>Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)</td>
			<td>BT5017</td>
			<td>Stock 125 &#956;g/mL in 0.2% Prionex in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehye</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>P1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prionex</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>529600</td>
			<td>10% solution, 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest SF</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001861</td>
			<td>5 X 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro acetic acid - Sequencing grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td>10 X 1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega or NEB</td>
			<td>V511A, P8101S</td>
			<td>100 &#956;g or 5 X 20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186000385c</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing rat sympathetic neurons from embryonic superior cervical ganglia for morphological and proteomic analysis

Sympatisk nervceller från embryonala råtta överlägsen livmoderhalscancer ganglier (SCG) har använts som en in vitro-modell system för perifera nervceller att studera axonal tillväxt, axonal trafficking, synaptogenesis, dendritisk tillväxt, dendritisk plasticitet och nerv-mål interaktioner i co-kultur system. Detta protokoll beskriver isolering och dissociation av nervceller från den överlägsna massundersökning ganglier av E21 råtta embryon, följt av beredning och underhåll av rena neuronala kulturer i serum-fri medium. Eftersom nervceller inte följer obestruken plast, nervceller kommer att odlas på antingen 12 mm glas coverslips eller 6-brunnsplattor belagda med poly-D-lysin. Efter behandling med ett antimitotic-medel (Ara-C, cytosin β-D-arabinofuranoside), genererar detta protokoll friska neuronala kulturer med mindre än 5% icke-neuronala celler, som kan upprätthållas i över en månad in vitro. Även om embryonala råtta SCG nervceller är multipolär med 5-8 dendrites in vivo; under serumfria förhållanden sträcker sig dessa nervceller endast en enda axon i kulturen och fortsätter att vara unipolär under den tid som kulturen pågår. Dessa nervceller kan dock induceras att förlänga dendrites i närvaro av källaren membran extrakt, ben morphogenetic proteiner (BMPs), eller 10% fetala kalv serum. Dessa homogena neuronala kulturer kan användas för immunocytochemical färgning och för biokemiska studier. Detta papper beskriver också optimerat protokoll för immunocytochemical färgning för microtubule associerade protein-2 (MAP-2) i dessa nervceller och för utarbetandet av neuronal extrakt för masspektrometri.

Isolera och underhålla neuronala kulturer av embryonala SCG nervceller Dissociated celler från råtta embryonala SCG var pläterade i en poly-D-lysin belagda platta eller täckslip och underhålls i serum fri kultur media som innehåller b-nerv growth factor. De dissocierade cellerna som innehåller en blandning av nervceller och gliaceller ser cirkulära vid plätering (Figur 1A). Inom 24 timmar efter plätering, nervcellerna förlänga små axonal processer med gliace...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis at JoVE.com

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Detta dokument beskriver isolering och odling av embryonala råtta sympatisk nervceller från den överlägsna livmoderhalscancer ganglier. Det ger också detaljerade protokoll för immunocytochemical färgning och för att förbereda neuronal extrakt för masspektrometrisk analys.

Culturing Rat Sympatiska nervceller från embryonala Superior Cervical Ganglier för morfologiska och proteomisk analys

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

I den här videon kommer vi att demonstrera odling av embryonala råttor överlägsna livmoderhalscancer ganglier för morfologiska och proteomic analys. Innan du börjar dissekering, förbereda kontroll och dissektion media. Kontroll medium innehåller F-12 och låg glukos DMEM kompletteras med en insulin-selen-transferrin blandning, glutamin, nerv tillväxtfaktor, och BSA.Dissektionsmedium innehåller L-15 kompletterat med pen-strep och BSA. Se manuskriptet för detaljerade protokoll för medieberedning. Beredning av plattor för culturing nervceller.Späd ett milligram per milliliter lager av poly-D-lysin till 100 mikrogram per milliliter med sterilt destillerat vatten. För proteomisk eller genomisk analys, en till två dagar före dissektionen, belägga sex-brunnsplattor med cirka två milliliter sterila 100 gram per milliliter poly-D-lysin. Detta är nödvändigt för att säkerställa celladhesion till brunnen.Linda plattorna med plastfolie och förvara plattorna över natten i fyra grader Celsius. På dagen för dissektionen, innan dissektionen börjar, avlägsna poly-D-lysinlösningen från brunnarna och skölj brunnarna fem gånger med sterilt destillerat vatten, följt av en gång med lågglukos-DMEM. Under den enzymatiska matsmältningen av ganglierna, ungefärligt en timme, för att plätering cellerna, aspirate DMEMEN från pläterar och byter ut den med 0.3 milliliters av kontrollerar medelmedium.Förvara plattorna i 35 grader Celsius under 5 %CO2 i en befuktad kammare. I huven, ställa in följande objekt för dissektion. Fyra 50 milliliter sterila koniska rör med ca 20 milliliter dissektionsmedia i varje rör.Fyra sterila 35 millimeters rätter med 1,5 milliliter dissekeringsmedia. Ett sterilt koniskt rör på 50 milliliter med 20 milliliter dissektionsmedia för centrifugeringen. Ett 15 milliliter sterilt koniskt rör för centrifugering av ganglierna, ett sterilt 10 milliliterrör för att samla upp de dissocierade cellerna.Använd en torr pärlor sterilisator för att sterilisera ett par fina tång i minst en minut. Alla förfaranden som utförs i studier med djur godkändes av institutionella Animal Care and Use Committee vid Saint Mary's College of California. Den djurvård och användning riktlinjer vid Saint Mary's College of California har utvecklats baserat på riktlinjer som tillhandahålls av Office of Laboratory Animal Welfare vid National Institutes for Health.Avlägsnande av E21 embryon från den dräktiga råttan. Observera att avlägsnandet av livmoderhornet kan utföras utanför huven om omgivningen är noggrant steriliserad. Avliva en dräktig råtta med CO2 inandning.Skjår pälsen från bukregionen och torka huden i området med 70%alkohol för att sterilisera den. Med hjälp av en ny uppsättning av steril sax och tlyktor, skär genom huden och sedan muskeln för att exponera livmoderhorn som innehåller embryona. Ta bort livmoderhornet med embryona, med hjälp av en ny uppsättning saxar och tlyktor, var noga med att inte skada tarmarna i processen.Överför livmoderhornet med embryona i 150 millimeters steril petriskål och överför dem i huven. Med hjälp av en ny uppsättning tlysen och saxar, ta bort embryona från livmoderhornet och separera embryona från fosterhinnorna och moderkakan. För att avliva embryona, skär ryggmärgen av embryona längs mittlinjen under höger arm.Detta kommer att minska blödningen från halspulsådern under avlägsnande av SCG. Överför dessa embryon i de beredda konditorirören på 50 milliliter som innehåller dissektionsmedia. Se till att embryona är nedsänkta i media.Varje rör kan rymma upp till tre embryon. Isolering av den överlägsna cervikala ganglion från embryot. Överför en valp från dissekeringsmediet på en steril 150 millimeter petriskål halvfylld med fast substrat med sin ryggyta på substratet.Med hjälp av tre sterila 23 gauge nålar, stift puben till skålen med en nål under varje arm och en tredje nål genom munnen för att noggrant hyperextend halsen. Skär genom huden i nacken regionen med hjälp av sterila fina tärna för att exponera spottkörtlarna under. Ta bort dessa körtlar med hjälp av fina tröpningar.Lokalisera sternocleidomastoid och omohyoid muskler nära nyckelbenet och luftstrupen respektive. Först, skär tvärgående sternocleidomastoid muskler. Och sedan försiktigt skära den tunna omohyoid muskeln med hjälp av fina tärningar.När dessa muskler tas bort, kommer bifurkation i halspulsådern på främre änden, vara synlig på vardera sidan av luftstrupen med SCG ligger under denna gaffel i halspulsådern. Med hjälp av slutna tång, lyft försiktigt halspulsådern för att visualisera SCG. Med hjälp av en tärna på vardera sidan av SCG, dra ut halspulsådern och överföra den till den beredda sterila 35 millimeter rätter.Denna vävnad kommer troligen att innehålla SCG med halspulsådern, vagusnerven med nodose ganglierna, liksom andra segment av muskler eller fett i området. Upprepa dissekeringsprocessen på andra sidan. Ta bort SCGs från alla embryon innan du fortsätter med de återstående dissekering steg beskrivs.Fördela de isolerade vävnaderna mellan två av de 35 millimeters diskarna för att underlätta bearbetningen av vävnadsproverna. Efterbearbetning av SCG. För att skilja SCG från den dissekerade vävnaden, använd först fina tövråkar för att avlägsna eventuell ovidkommande vävnad, såsom muskel eller fett, var noga med att undvika området nära halspulsådern bifurkation.När dessa vävnader har tagits bort, två ganglier är synliga. Den nodose ganglion är mindre och cirkulär medan SCG är mandel formad. Dra försiktigt på vagusnerven för att separera vagusnerven och nodose ganglierna från halspulsådern och sedan separera SCG från halspulsådern.Använd fina tyfningar för att ta bort kapseln som omger SCG. Överför SCG till en ny 35 millimeter kultur skålen. Upprepa denna process med alla dissekerade vävnadsprover.Belägga en steriliserad, bomullspluggad glaspilett med dissection media för att förhindra att vävnaden från att hålla sig till pipetten väggar. Använd pipetten för att ersätta dissektmediet med sterila två milliliter av kollagenastyp II, dispase typ II i kalcium och magnesiumfri HBSS och inkubera i 50 minuter vid 37 grader Celsius för att hjälpa till att bryta ner vävnaderna. Observera att inkubationstiderna kan behöva optimeras med olika partier av kollagenas/dispase och vanligtvis varierar från 40 minuter till en timme.Efter inkubationen överför du SCGs och collagenas/dispase till ett sterilt koniskt rör på 15 milliliter. Använd dissektionsmediet för att skölja plattorna och överföra lösningen till röret. Lägg till tillräckligt med dissektionsmedia för att få volymen till cirka 10 milliliter.Centrifugera vid 200 x g, 1, 000 till 1, 200 rpm i fem minuter vid rumstemperatur för att pelleta provet. Aspirera supernatanten, var noga med att inte rubba pelleten. Resuspend pelleten med 10 milliliter av dissekeringsmedia, upprepa centrifugeringen och kassera supernatanten.Ersätt med en till två milliliter odlingsmedium. Med hjälp av en smal-bore, böjda sterila Pasteur pipett, pre-coat det med kultur medium, mekaniskt separera klumpar genom att försiktigt triturating fem till sex gånger. Låt de större klumparna nöja sig med ungefär en minut och överför den supernatant cellupphängningen till ett nytt 10 milliliterrör.Upprepa denna process tre gånger till med ökande kraft trituration varje gång för att säkerställa nästan fullständig dissociation av SCGs. Överför supernatanten efter varje omgång trituration till 10 milliliterröret med supernatanten från den första triturationen. Lägg till tillräckligt med kulturmedier för att få volymen till åtta till tio milliliter.Blanda försiktigt en cellfjädring och kvantifiera celltätheten med en hemocytometer. Fördela cellupphängningen i brunnarna vid lämplig celltäthet för experimenten. Blanda cellupphängningen kontinuerligt under pläteringsprocessen för att säkerställa jämn fördelning av celler i brunnarna.För morfologisk analys, platta cellerna runt 8, 000 celler per brunn i en 24-brunnsplatta. Och för genomiska och proteomiska protokoll, platta cellerna så högt som 30, 000 celler per brunn. Överför plattorna till en glasutsikator med sterilt vatten i botten för att skapa en befuktad kammare.Injicera tillräckligt med CO2, cirka 120 milliliter, för att få en 5%CO2-miljö i exsiccatorn, före försegling. Underhåll plattorna vid 35,5 grader Celsius. Detta kallas för dag noll i protokollet.Dessa plattor kan också underhållas i en vanlig 5%CO2 inkubator. Den ovan beskrivna metoden minimerar temperatur- och pH-förändringar och hjälper även till att förhindra korskontaminering. Underhåll av de odlade SCG nervceller och behandlingar.Dessa bilder visar de dissocierade överlägsna livmoderhalscancer ganglierna celler på dag noll, dag ett, och dag fem. Dagen noll bilden visar cellerna vid plätering. Cellerna pläterade på dag noll innehåller en blandning av både neuronala och icke-neuronala celler.Dag ett, 24 timmar efter plätering, försiktigt bort hälften av odlingsmedia och ersätta med två mikromolar Ara-C, cytosin D-arabinofuranoside, en anti-mitotiska agent. Låt behandlingen vara kvar på cellerna i 48 timmar. Vanligtvis denna längd av behandlingen är tillräcklig för att eliminera icke-neuronala celler i kulturen.På dag tre, försiktigt aspirera halva mediet och ersätta med kontrollmedium. På dag fyra är cellerna redo för experimentella behandlingar. Mata kulturer varannan dag med lämpligt medium.Försiktigt ersätta hälften av mediet i brunnen med färskt medium. Bilden på dag fem visar omfattande axonal tillväxt med ingen dendritisk tillväxt observerats. För att inducera dendritisk tillväxt, nervceller kan odlas på Matrigel eller behandlas med 10%serum eller 50 nanogram per milliliter ben morphogenetic protein-7.Figur två visar förändringar i neuronal morfologi av E21 råtta SCG nervceller efter behandling med BMP-7. Representativa faskontrastmikrografier vid 10 X förstoring visar den cirkulära neuronala cellkroppen med axoner i styrnerv i panel A, och nervceller med flera korta dendritliknande processer när de behandlas med BMP-7 som visas av pilarna i panel B.Odlade SCG nervceller efter lämpliga behandlingar kan användas för morfologiska behandlingar med hjälp av immuncytokemisk färgning för genomisk analys och för biokemiska studier , såsom för proteomiska analyser. Se manuskriptet för detaljerade protokoll för immunfärgning och provberedning för proteomisk analys.Figur tre visar immunfärgning från MAP-2 protein i odlade embryonala råttor sympatiska nervceller. Panelerna A till D visar odlade SCG nervceller behandlas med kontroll media och paneler E genom H visar nervceller behandlas med BMP-7 på 50 nanogram per milliliter i fem dagar. Representativa mikrografer som visar immuncytokemiska färgning av nervcellerna med mikrotubuli associerat protein-2 i C och G, en nukleär fläck i D och H med fas kontrast mikrografer i B och F, och fram av de tre kanalerna i A och D.Immunocytochemical färgning från mikrotubuli associerade protein-2 är närvarande i cellkroppen och proximala axoner av kontroll nervceller i panel C.And färgning från MAP-2 protein i cellkroppen , och dendrites i BMP-7 behandlade nervceller är i panel G.Here's a sample run of superior cervical ganglia treated with control media, which detected 1, 100 proteiner.Gen ontologi med hjälp av Panther databasen fann att de flesta av proteinerna var cytoplasmatiska. Det fanns dock membranbundna proteiner och proteiner vid cellulära korsningar i provet. Denna analys visade också att proteiner som är involverade i ett brett spektrum av neuronala signalering vägar upptäcktes i provet.Sammanfattningsvis, efter att ha tittat på den här videon, bör du kunna isolera och kultur råtta embryonala överlägsen livmoderhalscancer ganglion nervceller för morfologiska och proteomisk analys. Detta arbete finansierades av fakulteten utvecklingsfonden och sommar forskningsprogram vid Saint Mary's College of California.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Autonomic Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Fysiologiska, morfologiska och neurokemiska karakterisering av nervceller moduleras av Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Kromatin Immunoprecipitation från dorsalrotsganglier vävnad efter axonal skada

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovaskulära Gjutning av de vuxna mus för 3D-avbildning och morfologisk analys

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Induktion Dendritic Tillväxten i Odlade sympatiska nervceller

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Produktion och isolering av Axoner från sensoriska neuroner för biokemisk analys med porösa filter

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

En metod för KNUTIG Ganglia Injektion i Sprague-Dawley-råtta

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Diffusion Imaging i Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Funktionell och morfologisk Bedömning av Membran Innervation av Phrenic motorneuroner

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens och Bioluminescence avbildning av Subcellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampus nervceller

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...