Name: evaluating cell death using cell-free supernatant of probiotics in three-dimensional spheroid cultures of colorectal cancer cells
Uploaded: 2020-06-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

وقد دعم هذا البحث "وضع معايير قياس الكيمياء والإشعاع"، ورقم المنحة KRISS-2020-GP2020-0003، و"تطوير معايير القياس والتكنولوجيا للمواد الحيوية والتقارب الطبي"، ورقم المنحة KRISS-2020-GP2020-0004، بتمويل من المعهد الكوري للبحوث للمعايير والعلوم. كما تم دعم هذا البحث من قبل وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (MSIT)، والمؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF-2019M3A9F3065868)، ووزارة الصحة والرعاية الاجتماعية (MOHW)، والمعهد الكوري لتنمية الصناعة الصحية (KHIDI، HI20C0558)، ووزارة التجارة والصناعة والطاقة (MOTIE)، ومعهد التقييم الكوري للتكنولوجيا الصناعية (KEIT، 20009350). معرف ORCID (هي مين يو: 0000-0002-5951-2137; دوكجين كانغ: 0000-0002-5924-9674; سيل كيم: 0000-0003-3465-7118; جو أون لي: 0000-0002-2495-1439; جينا لي: 0000-0002-3661-3701). نشكر تشانغ وو بارك للمساعدة في التجارب.

1. زراعة الخلايا البكتيرية وإعداد اللاكتوباكيلوس الخالية من الخلايا الفائقة (LCFS)
ملاحظة: يتم إجراء الخطوات 1.2 - 1.9 في غرفة اللاهوائية.
<ol><li>إعداد لوحة أجار MRS ومرق تحتوي على L-السيستين وتعقيمها عن طريق الالاستعباد التلقائي.</li>
	<li>قبل احتضان لوحة أجار MRS في H2 غرفة اللا...

<ol>
	<li>Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+molecular+insights+into+the+interaction+between+probiotics+and+the+host+intestinal+mucosa.">Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).</li><li>Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., S&#225;nchez, B., Margolles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacteria+and+their+molecular+communication+with+the+immune+system.">Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).</li><li>Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+prebiotics+in+intestinal+health+and+disease:+from+biology+to+the+clinic.">Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).</li><li>Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics,+prebiotics+and+synbiotics-+a+review.">Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review.</a> Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).</li><li>Harish, K., Varghese, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+in+humans-evidence+based+review.">Probiotics in humans-evidence based review.</a> Calicut Medical Journal. 4 (4), 3 (2006).</li><li>Routy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+influences+anticancer+immunosurveillance+and+general+health.">The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+of+the+cell-based+data-harvesting+efforts+that+drive+the+integration+of+cell+biology.">Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Jong, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology.">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 6, 19103 (2016).</li><li>Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+breakthrough+in+vivo.">Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).</li><li>Lee, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Anti-Cancer+Activity+of+the+Probiotic+Bacterium+Lactobacillus+fermentum+Using+2D+vs.+3D+Culture+in+Colorectal+Cancer+Cells.">Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells.</a> Biomolecules. 9 (10), 557 (2019).</li><li>Koledova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+An+introduction.">3D cell culture: An introduction.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).</li><li>Kapa&#322;czy&#324;ska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning.">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+The+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li><li>Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+patient-derived+3D+mesothelioma+tumor+organoids+facilitate+patient-centric+therapeutic+screening.">In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening.</a> Scientific Reports. 8, 2886 (2018).</li><li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li><li>Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylcellulose+Based+Thermally+Reversible+Hydrogel+System+for+Tissue+Engineering+Applications.">Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications.</a> Cells. 2 (3), 460-475 (2013).</li><li>Chandrashekran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylcellulose+as+a+scaffold+in+the+culture+of+liver-organoids+for+the+potential+of+treating+acute+liver+failure.">Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure.</a> Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).</li><li>Lee, W., Park, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+patterned+stem+cell+differentiation+using+thermo-responsive+methylcellulose+hydrogel+molds.">3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds.</a> Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).</li><li>Fan, H., Demirci, U., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+organoid+models:+Leaping+forward+in+cancer+research.">Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research.</a> Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Liou, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Metabolic+Pathway+for+Activation+of+Dietary+Glucosinolates+by+a+Human+Gut+Symbiont.">A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont.</a> Cell. 180 (4), 717-728 (2020).</li><li>Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+and+the+social+brain.">Microbiota and the social brain.</a> Science. 366 (6465), 2016 (2019).</li><li>Honda, K., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+in+adaptive+immune+homeostasis+and+disease.">The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease.</a> Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).</li><li>B&#225;rcena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthspan+and+lifespan+extension+by+fecal+microbiota+transplantation+into+progeroid+mice.">Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice.</a> Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).</li><li>Michalovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+disease+severity+magnify+disturbed+microbiome-immune+interactions+in+asthma+patients.">Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients.</a> Nature Communications. 10, 5711 (2019).</li><li>Ansaldo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akkermansia+muciniphila+induces+intestinal+adaptive+immune+responses+during+homeostasis.">Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis.</a> Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).</li></ol>

البيئة الدقيقة للأنسجة، بما في ذلك الخلايا المجاورة والمصفوفة خارج الخلية (ECM)، أمر أساسي لتوليد الأنسجة وحاسمة في السيطرة على نمو الخلايا وتطوير الأنسجة13. ومع ذلك ، فإن الثقافات 2D لها العديد من العيوب ، مثل تعطيل التفاعلات الخلوية ، وكذلك التعديلات في مورفولوجيا الخلايا ، وا...

البروبيوتيك هي الكائنات الحية الدقيقة الأكثر فائدة في القناة الهضمية التي تحسن التوازن المناعي واستقلاب الطاقة المضيف1. البروبيوتيك من اللاكتوباكيلوس وبيفيدوباكتريا هي الأكثر تقدما من نوعها وجدت في الأمعاء2،3. وقد أظهرت التحقيقات السابقة أن Lactobacillus له آثار مثبطة ومكافحة الانتشار على العديد من أنواع السرطان, بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم4. وعلاوة على ذلك، البروبيوتيك منع أمراض التهاب الأمعاء، ومرض كرون، والتهاب القولون التقرحي5،6. ومع ذلك، أجريت معظم الدراسات مع البروبيوتيك في أحادية الأبعاد ثنائية الأبعاد (2D) التي تزرع على الأسطح الصلبة.
تفتقر أنظمة الثقافة الاصطناعية إلى السمات البيئية، وهو أمر غير طبيعي بالنسبة للخلايا السرطانية. للتغلب على هذا القيد، تم تطوير أنظمة ثقافة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد)7و8. تظهر الخلايا السرطانية في 3D تحسينات من حيث الآليات البيولوجية الأساسية ، مثل صلاحية الخلية ، والانتشار ، والمورفولوجيا ، والاتصالات الخلوية ، وحساسية الدواء ، وفيأهميةالجسم الحي 9،10. وعلاوة على ذلك، يتم إجراء كرويدات من أنواع متعددة الخلايا من سرطان القولون والمستقيم وتعتمد على التفاعلات الخلية الخلية ومصفوفة خارج الخلية (ECM)11. وقد ذكرت دراستنا السابقة أن الخلايا بروبيوتيك خالية من الخلايا supernatant (CFS) المنتجة باستخدام اللاكتوباكيلوس fermentum أظهرت آثار مضادة للسرطان على الثقافات 3D من سرطان القولون والمستقيم (CRC) خلايا12. اقترحنا أن لجنة الأمن الغذائي العالمي هو استراتيجية بديلة مناسبة لاختبار آثار بروبيوتيك على كرويدات 3D12.
هنا, نقدم نهجا يمكن أن تستوعب أنواع متعددة الخلايا من سرطان القولون والمستقيم 3D لتحليل الآثار العلاجية للخلايا بروبيوتيك supernatant خالية (CFS) على العديد من أنظمة محاكاة سرطان القولون والمستقيم 3D. توفر هذه الطريقة وسيلة لتحليل الآثار ذات الصلة بروبيوتيك ومكافحة السرطان في المختبر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 &#181;l</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561036</td>
			<td>Pkg of 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>100 covers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x transfer buffer</td>
			<td>Intron</td>
			<td>IBS-BT031A</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine (W/SDS)</td>
			<td>Intron</td>
			<td>IBS-BT014</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SCT-200-C</td>
			<td>500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Lactobacilli MRS Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0881-17-5</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell viability assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>100&#956;l/assay in 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
			<td>vial of 20 tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes</td>
			<td>fisher Scientific</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>25/Pack, 500/Case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 &#181;l rxns #1708890</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1708890</td>
			<td>25 x 20 &#181;L rxns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1725121</td>
			<td>5 x 1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus fermentum</td>
			<td>Korean Collection for Type Cultures</td>
			<td>KCTC 3112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Cellulose (3500-5600mPa&#183;s, 2% in Water at 20&#176;C)</td>
			<td>TCI</td>
			<td>M0185</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346906</td>
			<td>20 plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>640934</td>
			<td>100 tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Introgen</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89901</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Materials/Equipment/Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti - p-I&#954;B&#945; (B-9)</td>
			<td>Santa cruze</td>
			<td>sc-8404</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BclxL (H-5)</td>
			<td>Santa cruze</td>
			<td>sc-8392</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PARP 1 (C2-10)</td>
			<td>Santa cruze</td>
			<td>sc-53643</td>
			<td>50 &#181;l ascites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa cruze</td>
			<td>sc-47778</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSVerse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>San Diego, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioT</td>
			<td>S1LFA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>HERAcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 ml</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 50 ml</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire Multimode Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Enspire 2300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
			<td>Ashland, OR, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-035-062</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td>2.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Inc., San Diego, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000 mini</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated shaker</td>
			<td>Lab companion</td>
			<td>SIF-6000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Gauge Ver. 3.0,</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL microcentrifuge tube 1.5mL</td>
			<td>SPL</td>
			<td>60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile</td>
			<td>SPL</td>
			<td>21012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors</td>
			<td>SONICS-vibra cell</td>
			<td>VC 505</td>
			<td>500 Watt ultrasonic processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber</td>
			<td>COY LAB PRODUCTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating cell death using cell-free supernatant of probiotics in three-dimensional spheroid cultures of colorectal cancer cells

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لتقييم وفيات الخلايا السرطانية في كرويات ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) لأنواع متعددة الخلايا من الخلايا السرطانية باستخدام الخلايا الخارقة من زراعة خلايا الاختمار اللاكتوباكيلوس ، التي تعتبر ثقافات البروبيوتيك. استخدام الثقافات ثلاثية الأبعاد لاختبار اللاكتوباكيلوس الخالية من الخلايا الفائقة (LCFS) هي خيار أفضل من الاختبار في الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد ، خاصة وأن L. fermentum يمكن أن تنتج تأثيرات مضادة للسرطان داخل الأمعاء. تم تحديد L. fermentum supernatant لامتلاك زيادة الآثار المضادة للتكاثر ضد العديد من خلايا سرطان القولون والمستقيم (CRC) في ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد. ومن المثير للاهتمام أن هذه الآثار كانت مرتبطة بقوة بنموذج الثقافة، مما يدل على القدرة الملحوظة ل. فيمرخوم للحث على موت الخلايا السرطانية. تم إنشاء كرويات مستقرة من CRCs متنوعة (خلايا سرطان القولون والمستقيم) باستخدام البروتوكول المعروض أدناه. هذا البروتوكول لتوليد كرويد 3D هو توفير الوقت وفعالة من حيث التكلفة. وقد تم تطوير هذا النظام للتحقيق بسهولة في الآثار المضادة للسرطان من LCFS في أنواع متعددة من كرويدات لجنة حقوق الطفل. كما هو متوقع، عالجت كرويات CRC مع LCFS موت الخلايا المستحث بقوة خلال التجربة وأعربت عن علامات جزيئية محددة للخلايا المبرمج كما تم تحليلها من قبل qRT-PCR، النشاف الغربي، وتحليل FACS. لذلك، هذه الطريقة قيمة لاستكشاف صلاحية الخلايا وتقييم فعالية الأدوية المضادة للسرطان.

نحن نصف بروتوكول الحصول على كرويدات من خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم المتنوعة. وكان مطلوبا مكملات مع ميثيلسليلوز لتوليد كرويدات. كما نقدم طريقة لإعداد LCFS وتقديم نموذج لدراسة العلاقة بين البروبيوتيك وسرطان القولون والمستقيم. يتم توضيح تشكيل كروي وبروتوكولات إعداد LCFS تخطيطيا في <strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

هنا يتم تقديم طرق لفهم الآثار المضادة للسرطان من اللاكتوباكيلوس الخلايا الخالية من الخلايا الفائقة (LCFS). تظهر خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم وفيات الخلايا عند علاجها باستخدام LCFS في الثقافات ثلاثية الأبعاد. يمكن تحسين عملية توليد كرويدات اعتمادا على السقالة وأساليب التحليل المقدمة مفيدة لتقييم مسارات الإشارات المعنية.

تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

الإعداد والتحليل الأيضي الثقافات المشارك كروي ثلاثي الأبعاد لخلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

تقييم صلاحية الخلية والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

تقييم قدره التمايز من الخلايا الظهاريه البروستاتا الماوس باستخدام الثقافة Organoid

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

عزل خلايا شبيهه بالجذعية من ثقافات كروي ثلاثية الابعاد

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

الكشف عن الحمض النووي خالية من الخلايا في عينات بلازما الدم من مرضى السرطان

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

نموذج ثلاثي الأبعاد من كرويدات لدراسة الخلايا الجذعية سرطان القولون

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

نموذج محاكاة حيوية ثلاثي الأبعاد في المختبر للورم الأرومي العصبي باستخدام السقالات القائمة على الكولاجين

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...