Name: evaluating cell death using cell-free supernatant of probiotics in three-dimensional spheroid cultures of colorectal cancer cells
Uploaded: 2020-06-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch die "Etablierung von Messstandards für Chemie und Strahlung", Förderkennzeichen KRISS-2020-GP2020-0003, und "Entwicklung von Messstandards und -technologien für Biomaterialien und medizinische Konvergenz", Förderkennzeichen KRISS-2020-GP2020-0004 Programme, finanziert vom Korea Research Institute of Standards and Science, unterstützt. Diese Forschung wurde auch vom Ministerium für Wissenschaft und IKT (MSIT), der National Research Foundation of Korea (NRF-2019M3A9F3065868), dem Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt (MOHW), dem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, HI20C0558), dem Ministerium für Handel, Industrie und Energie (MOTIE) und dem Korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT, 20009350) unterstützt. ORCID ID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Wir danken Chang Woo Park für die Unterstützung bei experimenten.

1. Bakterielle Zellkulturen und Herstellung von Lactobacillus zellfreiem Überstand (LCFS)
HINWEIS: Die Schritte 1.2 – 1.9 werden in einer anaeroben Kammer durchgeführt.
<ol><li>Bereiten Sie eine MRS-Agarplatte und eine Brühe mit L-Cystein vor und sterilisieren Sie sie durch Autoklavieren.</li>
	<li>Die MRS-Agarplatte wird in der anaerobenH2-Kammer bei 37 °C mit 20 ppm Sauerstoff vorinkubiert.</li>
	<li>Lactobacillus-Bakterienbestand auftauen und die Agarpla...

<ol>
	<li>Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+molecular+insights+into+the+interaction+between+probiotics+and+the+host+intestinal+mucosa.">Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).</li><li>Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., S&#225;nchez, B., Margolles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacteria+and+their+molecular+communication+with+the+immune+system.">Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).</li><li>Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+prebiotics+in+intestinal+health+and+disease:+from+biology+to+the+clinic.">Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).</li><li>Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics,+prebiotics+and+synbiotics-+a+review.">Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review.</a> Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).</li><li>Harish, K., Varghese, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+in+humans-evidence+based+review.">Probiotics in humans-evidence based review.</a> Calicut Medical Journal. 4 (4), 3 (2006).</li><li>Routy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+influences+anticancer+immunosurveillance+and+general+health.">The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+of+the+cell-based+data-harvesting+efforts+that+drive+the+integration+of+cell+biology.">Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Jong, B. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Anti-Cancer+Activity+of+the+Probiotic+Bacterium+Lactobacillus+fermentum+Using+2D+vs.+3D+Culture+in+Colorectal+Cancer+Cells.">Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells.</a> Biomolecules. 9 (10), 557 (2019).</li><li>Koledova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+An+introduction.">3D cell culture: An introduction.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).</li><li>Kapa&#322;czy&#324;ska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning.">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+The+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li><li>Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Metabolic+Pathway+for+Activation+of+Dietary+Glucosinolates+by+a+Human+Gut+Symbiont.">A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont.</a> Cell. 180 (4), 717-728 (2020).</li><li>Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+and+the+social+brain.">Microbiota and the social brain.</a> Science. 366 (6465), 2016 (2019).</li><li>Honda, K., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+in+adaptive+immune+homeostasis+and+disease.">The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease.</a> Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).</li><li>B&#225;rcena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthspan+and+lifespan+extension+by+fecal+microbiota+transplantation+into+progeroid+mice.">Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice.</a> Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).</li><li>Michalovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+disease+severity+magnify+disturbed+microbiome-immune+interactions+in+asthma+patients.">Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients.</a> Nature Communications. 10, 5711 (2019).</li><li>Ansaldo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akkermansia+muciniphila+induces+intestinal+adaptive+immune+responses+during+homeostasis.">Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis.</a> Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).</li></ol>

Die Gewebemikroumgebung, einschließlich benachbarter Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM), ist grundlegend für die Gewebeerzeugung und entscheidend für die Kontrolle des Zellwachstums und der Gewebeentwicklung13. 2D-Kulturen haben jedoch mehrere Nachteile, wie die Störung zellulärer Interaktionen sowie Veränderungen in der Zellmorphologie, extrazellulären Umgebungen und dem Ansatz derDivision 14. 3D-Zellkultursysteme wurden gründlich untersucht, um In-vivo-E...

Probiotika sind die vorteilhaftesten Mikroorganismen im Darm, die die Immunhomöostase und den Energiestoffwechsel verbessern1. Probiotika aus Lactobacillus und Bifidobacterium sind die fortschrittlichsten ihrer Art, die im Darm gefunden werden2,3. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Lactobacillus hemmende und antiproliferative Wirkungen auf mehrere Krebsarten hat, einschließlich Darmkrebs4. Darüber hinaus verhindern Probiotika entzündliche Darmerkrankungen, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa5,6. Die meisten Studien mit Probiotika wurden jedoch in zweidimensionalen (2D) Monoschichten durchgeführt, die auf festen Oberflächen gezüchtet werden.
Künstlichen Kultursystemen fehlen Umweltmerkmale, was für Krebszellen nicht natürlich ist. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden dreidimensionale (3D) Kultursysteme entwickelt7,8. Krebszellen in 3D zeigen Verbesserungen in Bezug auf grundlegende biologische Mechanismen wie Zelllebensfähigkeit, Proliferation, Morphologie, Zell-Zell-Kommunikation, Arzneimittelempfindlichkeit und In-vivo-Relevanz9,10. Darüber hinaus werden Sphäroide aus mehrzelligen Arten von Darmkrebs hergestellt und sind abhängig von Zell-Zell-Interaktionen und der extrazellulären Matrix (ECM)11. Unsere vorherige Studie hat berichtet, dass probiotische zellfreie Überstände (CFS), die mit Lactobacillus fermentum hergestellt wurden, krebshemmende Wirkungen auf 3D-Kulturen von Darmkrebszellen (CRC) zeigten12. Wir schlugen vor, dass CFS eine geeignete alternative Strategie zum Testen probiotischer Wirkungen auf 3D-Sphäroideist 12.
Hier stellen wir einen Ansatz vor, der mehrzellige Arten von 3D-Darmkrebs für die Analyse der therapeutischen Wirkungen von probiotischen zellfreien Überständen (CFS) auf mehrere 3D-Darmkrebs-Mimikrysysteme aufnehmen kann. Diese Methode bietet ein Mittel zur Analyse verwandter probiotischer und krebshemmenden Wirkungen in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td> 
			10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 &#181;l</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561036</td>
			<td>Pkg of 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>100 covers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x transfer buffer</td>
			<td>Intron</td>
			<td>IBS-BT031A</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine (W/SDS)</td>
			<td>Intron</td>
			<td>IBS-BT014</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SCT-200-C</td>
			<td>500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Lactobacilli MRS Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0881-17-5</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell viability assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>100&#956;l/assay in 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
			<td>vial of 20 tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 &#177; 0.1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes</td>
			<td>fisher Scientific</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>25/Pack, 500/Case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 &#181;l rxns #1708890</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1708890</td>
			<td>25 x 20 &#181;L rxns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1725121</td>
			<td>5 x 1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobacillus fermentum</td>
			<td>Korean Collection for Type Cultures</td>
			<td>KCTC 3112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Cellulose (3500-5600mPa&#183;s, 2% in Water at 20&#176;C)</td>
			<td>TCI</td>
			<td>M0185</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346906</td>
			<td>20 plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>640934</td>
			<td>100 tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Introgen</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89901</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Materials/Equipment/Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti - p-I&#954;B&#945; (B-9)</td>
			<td>Santa cruze</td>
			<td>sc-8404</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BclxL (H-5)</td>
			<td>Santa cruze</td>
			<td>sc-8392</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PARP 1 (C2-10)</td>
			<td>Santa cruze</td>
			<td>sc-53643</td>
			<td>50 &#181;l ascites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin (C4)</td>
			<td>Santa cruze</td>
			<td>sc-47778</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSVerse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>San Diego, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioT</td>
			<td>S1LFA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>HERAcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 ml</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 50 ml</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire Multimode Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Enspire 2300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122000051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
			<td>Ashland, OR, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-035-062</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td>2.0 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Inc., San Diego, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS 4000 mini</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubated shaker</td>
			<td>Lab companion</td>
			<td>SIF-6000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Gauge Ver. 3.0,</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td></td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL microcentrifuge tube 1.5mL</td>
			<td>SPL</td>
			<td>60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile</td>
			<td>SPL</td>
			<td>21012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors</td>
			<td>SONICS-vibra cell</td>
			<td>VC 505</td>
			<td>500 Watt ultrasonic processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber</td>
			<td>COY LAB PRODUCTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating cell death using cell-free supernatant of probiotics in three-dimensional spheroid cultures of colorectal cancer cells

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Bewertung des Krebszelltodes in dreidimensionalen (3D) Sphäroiden mehrzelliger Krebsarten unter Verwendung von Überständen aus der Lactobacillus fermentum Zellkultur, die als Probiotika-Kulturen betrachtet werden. Die Verwendung von 3D-Kulturen zum Testen von Lactobacillus zellfreiem Überstand (LCFS) ist eine bessere Option als tests in 2D-Monoschichten, zumal L. fermentum Krebsbekämpfungseffekte im Darm hervorrufen kann. Es wurde festgestellt, dass L. fermentum-Überstand unter 3D-Kulturbedingungen eine erhöhte antiproliferative Wirkung gegen mehrere Darmkrebszellen (CRC) besitzt. Interessanterweise waren diese Effekte stark mit dem Kulturmodell verbunden, was die bemerkenswerte Fähigkeit von L. fermentum zeigte, den Tod von Krebszellen zu induzieren. Stabile Sphäroide wurden aus verschiedenen CRCs (Darmkrebszellen) unter Verwendung des unten vorgestellten Protokolls erzeugt. Dieses Protokoll zur Erzeugung von 3D-Sphäroid ist zeitsparend und kostengünstig. Dieses System wurde entwickelt, um die krebshemmenden Wirkungen von LCFS in mehreren Arten von CRC-Sphäroiden leicht zu untersuchen. Wie erwartet, induzierten CRC-Sphäroide, die mit LCFS behandelt wurden, während des Experiments stark den Zelltod und exprimierten spezifische apoptose-molekulare Marker, die durch qRT-PCR, Western Blotting und FACS-Analyse analysiert wurden. Daher ist diese Methode wertvoll für die Erforschung der Zelllebensfähigkeit und die Bewertung der Wirksamkeit von Krebsmedikamenten.

Wir beschreiben das Protokoll der Gewinnung von Sphäroiden aus verschiedenen Darmkrebszelllinien. Eine Supplementierung mit Methylcellulose war erforderlich, um Sphäroide zu erzeugen. Wir stellen auch eine Methode der LCFS-Vorbereitung vor und präsentieren ein Modell, um die Korrelation zwischen Probiotika und Darmkrebs zu untersuchen. Sphäroidbildungs- und LCFS-Präparationsprotokolle sind schematisch in Abbildung 1A,Bdargestellt. Wie in Abbildung 2...

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Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Hier werden Methoden vorgestellt, um die krebshemmende Wirkung von Lactobacillus cell-free superstandant (LCFS) zu verstehen. Darmkrebs-Zelllinien zeigen Zelltod, wenn sie mit LCFS in 3D-Kulturen behandelt werden. Der Prozess der Erzeugung von Sphäroiden kann je nach Gerüst optimiert werden und die vorgestellten Analysemethoden sind nützlich, um die beteiligten Signalwege zu bewerten.

Evaluierung des Zelltods mit zellfreiem Überstand von Probiotika in dreidimensionalen sphäroiden Kulturen von Darmkrebszellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Forschung

Krebsforschung

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Vorbereitung und metabolische Assay von 3-dimensionalen Sphäroid Ko-Kulturen von Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Bewertung der Differenzierungskapazität von Mausprostataepithelzellen mithilfe der organoiden Kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Ein dreidimensionales Modell von Sphäroiden zur Untersuchung von Darmkrebs-Stammzellen

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Dreidimensionales biomimetisches In-vitro-Modell des Neuroblastoms unter Verwendung von kollagenbasierten Gerüsten

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...