Name: x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

نشكر مارتين رووفر على تصحيح هذه الورقة وتقديم تعليقات بناءة. كان الوصول إلى خط الشعاع Proxima 2 (SOLEIL synchrotron) ضمن مجموعات تخصيص الكتلة 20151139.

1. إنتاج وتنقية من TmPep1050 المؤتلف
ملاحظة: ويرد أدناه وصف إجراء الاستنساخ وتنقية من نوع البرية TmPep1050 مقتبس من دراسة سابقة11. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء الاستنساخ باستخدام جين اصطناعي. لتوليد المتغيرات TmPep1050، يمكن تنفيذ الطفرات الموقع الموجهة التالية، على سبيل المثال?...

البروتوكول الموصوف هنا يسمح بفهم انتقال dimer-dodecamer من TmPep1050 على المستوى الهيكلي. وقد شهدت منهجية سابقا لتحديد هيكل كل من oligomers TmPep105011. وكانت الخطوة الأكثر تحديا هي إيجاد ظروف تعزز تفكك الـddecamers إلى خافضات مستقرة. وكان على هذه الظروف أن تكون خفيفة بما يكفي للسماح بإعادة دمج الخافت?...

10- التنشئة القلائية هي عملية سائدة تملي الوظائف البيولوجية للعديد من البروتينات. في الإشريكية القولونية، ويقدر أن 35٪ فقط من البروتينات هيأحادية 1. بعض البروتينات، ودعا morpheeins، يمكن أن تعتمد حتى العديد من الدول القلة مع وحدات فرعية وجود بنية متميزة في كل دولة أوليغومريك2. الانتقال بين حالاتهم القلة غالبا ما يعني تنظيم نشاط البروتين حيث أن كل ولاية من الدول القلة قد يكون لها نشاط أو وظيفة مختلفة محددة. وقد تم توثيق العديد من الأمثلة على morpheeins جيدا في الأدب ، لا سيما في الporphobilinogen synthase3, HPr kinase /phosphatase4, لون بروتياز5, لاكتات dehydrogenase6, الجلسرينالدهيدي -3-الفوسفات dehydrogenase7, بيروفات كيناز8, سيترات synthase9, وpponuclease A10. في الآونة الأخيرة، وصفنا M42 aminopeptidase TmPep1050، مثال آخر من الانزيم مع سلوك مثل مورفيين، الذي يعتمد نشاطه على الدول القلةلها 11. ويتوسط الانتقال بين دولها القلة من قبل العوامل المساعدة المعدنية التي تحفز العديد من التعديلات الهيكلية لالوحدات الفرعية.
تنتمي عائلة M42 aminopeptidase إلى عشيرة MH12,13, ويتم توزيعها على نطاق واسع بين البكتيريا والارشمية14. و M42 aminopeptidases هي إنزيمات دينوكليار حقيقية الببتيدات المهينة تصل إلى 35 بقايا الأحماض الأمينية في طول15. أنها تعتمد على هيكل غريب على شكل رباعي الهيدرون مصنوعة من 12 وحدات فرعية مع مواقعهم النشطة الموجهة نحو تجويف داخلي. وكثيرا ما يوصف مثل هذا الترتيب بأنه تقسيم نانو للنشاط لتجنب انحلال البروتيل غير المنضبط. قد تكون مرتبطة الوظيفة الفسيولوجية من أمينوببتيداسيس M42 مع البروتيم، الببتيدات التحلل الناجمة عن تدهور البروتين16،17. Pyrococcus horikoshii تمتلك أربعة M42 أمينوببتيداسيس، كل عرض خصوصيات متميزة ولكن متكاملة18,19,20,21. فريد, وقد وصفت هيتيروكوميكس مصنوعة من نوعين مختلفين من الوحدات الفرعية في p. horikoshii, مما يشير إلى وجود مجمعات ببتيداسوم22,23.
وقد وصفت عدة هياكل من M42 أمينوببتيداسيس في الأدب11،16،18،19،20،24،25،26. وتتألف هذه الunit من مجالين مختلفين، مجال حفاز ومجال اتم. المجال الحفاز يعتمد α المشتركة / β أضعاف محفوظة في عشيرة MH كله، والمجال الحفاز الأركيولوجية يجري أمينوببتيداز Ap1 من فيبريو proteolyticus27. يعتمد المجال الديمّر طية تشبه PDZ16 وقد يكون لها دور في oligomerization ، بالإضافة إلى دورها في التحكم في الوصول الركازة والتجليد في التجويف الداخلي11. كما اللبنة الأساسية هو أكثر خافة، وغالبا ما يوصف dodecamer بأنها رابطة من ستة خافمات، كل خافض يجري وضعها في كل حافة من tetrahedron16. يعتمد احتكار أعضاء M42 aminopeptidases على توافر العوامل المساعدة المعدنية. أيونات المعادن المبرومة، وغالباً ما زن2 + وCo2+، وتشارك بشكل تحفيزي في الربط الببتيد والتحلل المائي. وهي موجودة في موقعين مختلفين للربط، وهما موقعي M1 و M2. أيونات معدنية اثنين أيضا محرك وصقل االتائح كما هو موضح لPhTET2، PhTET3، PfTET3، وTmPep105011،24،28،29. عندما تنضب العوامل المساعدة المعدنية، وdedecamer تفكيك في العتيمات، كما هو الحال في PhTET2، PhTET3، وTmPep105011،16،28، أو حتى مونومرات، كما هو الحال في PhTET2 وPfteT324،29.
هنا هو بروتوكول يستخدم لدراسة هياكل oligomers TmPep1050. هذا البروتوكول هو مجموعة من الطرق الشائعة بما في ذلك تنقية البروتين، وفحص نشاط البروتيوليك، والتبلور، وانعراج الأشعة السينية، والاستبدال الجزيئي. وأكد على الدقة الكامنة في التعامل مع metalloenzymes، oligomerization البروتين، وبلورة البروتين واستبدال الجزيئية. كما يتم عرض حالة من الدراسة لإظهار ما إذا كان dodecamers TmPep1050 قد تتفكك إلى مونومرات أم لا. لمعالجة هذا السؤال، تم دراسة متغير TmPep1050، TmPep1050H60A H307A، مواقع ربط المعادن التي تضعف من قبل تحور له -60 (موقع M2) وه - 307 (موقع M1) إلى بقايا علاء. قد يتم استيعاب هذا البروتوكول لدراسة أخرى M42 أمينوببتيداسيس أو أي metalloenzymes مع سلوك مثل morpheein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13, 137-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://www.ccp4.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen II</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyXtal 15-well tool</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>132007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli PPY strain</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>see reference 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli XL1 blue strain</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Standard</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1511901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litholoops</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine-p-nitroanilide</td>
			<td>Bachem AG</td>
			<td>40010720025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neggia plugin</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>N/A</td>
			<td>visit https://www.dectris.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBAD-TOPO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K430001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www.phenix-online.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Phe</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17014702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Q</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17094705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17104301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima MSB8 strain</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 43589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TmCD00089984</td>
			<td>DNASU Plasmid Repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xdsme</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://github.com/legrandp/xdsme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

تشكل M42 aminopeptidases مجمعات نشطة وظيفيًا مصنوعة من 12 وحدة فرعية. ويبدو أن عملية التجميع الخاصة بهم تخضع للتنظيم من قبل العوامل المساعدة في أيونات المعادن مما يؤدي إلى انتقال أكثر ظُنًا. عند ربط أيونات المعادن، تحدث عدة تعديلات هيكلية في الموقع النشط وعلى واجهة التفاعل، وتشكيل الخافتات لتعزيز التجمع الذاتي. ولمراقبة هذه التعديلات، يجب عزل القلة المستقرة قبل إجراء دراسة هيكلية. ذكرت هنا هو الأسلوب الذي يسمح لتنقية dodecamers مستقرة وdamers من TmPep1050, M42 aminopeptidase من T. maritima, وتحديد هيكلها بواسطة التصوير البلوري بالأشعة السينية. تم إعداد الديممرات من dodecamers عن طريق إزالة الأيونات المعدنية مع عامل chelating. دون عاملهم المساعد، أصبحت dodecamers أقل استقرارا وتم فصلها تماما عند التدفئة. تم حل الهياكل القلة من خلال نهج الاستبدال الجزيئي المباشر. لتوضيح المنهجية ، يتم عرض هيكل متغير TmPep1050 ، ضعيف تمامًا في ربط الأيونات المعدنية ، يظهر عدم وجود مزيد من الأعطال من الخافضات إلى مونومرات.

لدراسة احتمال تفكك dodecamer في مونومر في TmPep1050، تم استبدال codons له-60 و 307 له من قبل الين كودون باستخدام جين الاصطناعية. ثم تم استنساخ هذا الجين في ناقلات pBAD للتعبير وتنقية من البديل TmPep1050 المقابلة اسمه لاحقا TmPep1050H60A H307A. أظهر الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (الشكل 3B) أن البروت?...

Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

وقد تم تطوير هذا البروتوكول لدراسة التحول dimer-dodecamer من TmPep1050، M42 aminopeptidase، على المستوى الهيكلي. وهو خط أنابيب مباشر يبدأ من تنقية البروتين إلى معالجة بيانات الأشعة السينية. وقد تم التأكيد على كريستالودينسيس، فهرسة مجموعة البيانات، واستبدال الجزيئية من خلال حالة من الدراسة، TmPep1050H60A H307A البديل.

التصوير البلوري بالأشعة السينية لدراسة انتقال الدولة أوليغومريك من Thermotoga maritima M42 أمينوببتيداسي TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

يسهل هذا البروتوكول دراسة الأمينات باستخدام حالات oligomeric المختلفة والأنشطة المعتمدة على القلة التي يتم موازنةها بين الخافتات غير النشطة وddecamers النشطة. يمكن تنفيذ هذه التقنية التقليدية بسهولة في أي مختبر. وبصرف النظر عن اشتراط الوصول إلى مرفق الأشعة أو الأشعة السينية البلورات، لا يتطلب أجهزة خاصة.مع بعض التكيف، يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي بروتين آخر مع نشاط أو وظيفة التي تعتمد على درجة من oligomerization. لمعالجة بيانات الأشعة السينية، يجب أن يكون لدى المستخدمين فهم الحد الأدنى من البلورات. ندعو المستخدمين لمتابعة التدريبات، لزيارة XDS ويكي، ومشاهدة الدروس فينيكس.لإجراء فحص نشاط، إضافة 25 ميكرولترات من 100 mM L-Leucine p-Nitroanilide إلى 965 ميكرولترات من 50 ملليمترا MOPS، 250 ميكرومولار الكوبالت اثنين من كلوريد و 10٪ الميثانول قبل احتضان مزيج التفاعل في حمام جاف 75 درجة مئوية، قبل تخفيف الإنزيم إلى تركيز نهائي واحد ميكرومولر مع إضافية 50 مل. بعد ذلك، أضف 10 ميكرولترات من إنزيم ميكرومولار واحد إلى مزيج التفاعل ودوامة الحل الناتج قبل إرجاع التفاعل إلى حمام جاف 75 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن ساعة واحدة. عندما تحول المحلول إلى اللون الأصفر، أوقف التفاعل بميليلتر واحد من حمض حمضي بنسبة 20٪، ودوامة الخليط قبل السماح له بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة.ثم نقل aliquot من مزيج التفاعل إلى خلية مقياس الطيفية وقراءة ماصة في 410 نانومتر ضد مزيج التفاعل المحتضنة دون انزيم، كتحكم سلبي. لإعداد apoenzyme، إضافة 10 ميكرولترات من 1، 10-phenanthroline حل الأسهم إلى 890 ميكرولترات من 50 مللي كومب، 0.5 كبريتات الأمونيوم المولار و 100 ميكرولترات من TmPep 1050 النقي. تحقق من فقدان النشاط باستخدام فحص النشاط كما هو موضح دون إضافة كلوريد الكوبالت اثنين.بعد الفحص، نقل العينة إلى أنبوب غسيل الكلى وs dialyze العينة ضد 200 ملليلتر من 50 مللي 50 MOPS و 0.5 كبريتات الأمونيوم الولير في أربع درجات مئوية. تبادل dialysate مع العازلة الطازجة ثلاث مرات خلال غسيل الكلى 48 ساعة وجمع العينة من أنبوب غسيل الكلى. باستخدام وحدات الترشيح فائقة مع قطع 30 كيلودالتون، وتركيز العينة مرة أخرى إلى 100 ميكرولترس والتحقق من التركيز على مقياس الطيفي حجم نانو في 280 نانومتر.لإعداد الغمامات تمييع apoenzyme إلى تركيز واحد micromolar في 50 ملليميلور MOPS و 0.5 كبريتات الأمونيوم الولير، واحتضان التفاعل لمدة ساعتين في حمام جاف 75 درجة مئوية. ثم ركز عينة الإنزيم إلى ما لا يقل عن 50 تركيز ميكرولتر والتحقق من الوزن الجزيئي حسب حجم استبعاد الكروماتوغرافيا. لتحسين الشكل والحجم والبلورية من بلورات البروتين، إضافة الحجم المناسب من حل التبلور الأمثل إلى قطرة من البلورات لتحقيق حجم قطرات الكريستال إلى 10 ميكرولترات.نقل قطرات إلى أنبوب صغير 1.5 ملليلتر وإضافة 90 ميكرولترات أكثر من محلول التبلور إلى جيدا المصنف. لكل تخفيف البذور، إضافة 500 ميكرولترات من كاشف التبلور في بئر إلى العدد المناسب من الآبار في لوحة تبلور ومزيج اثنين من ميكرولترات عينة البروتين مع اثنين من microliters من كاشف التبلور و 0.2 ميكرولترات من البذور في دعم تبلور واحد في بئر. ثم إصلاح يدعم على كل بئر من كاشف التبلور.لالتقاط الكريستال، وملء حمام مع النيتروجين السائل ويغرق أي قوارير أو سلة تستخدم للتعامل مع عينة في النيتروجين. معالجة النيتروجين السائل أمر خطير يمكن أن يسبب قضمات الصقيع الشديدة. تأكد من ارتداء الحماية الفردية المناسبة مثل القفازات المبردة ونظارات العيون الواقية.إعداد عينات التقاط الحلقات من أحجام مختلفة وفقا لحجم الكريستال واستخدام منظار لتحديد قطرة تحتوي على بلورات. ثم استخدم حلقة لاختيار بلطف الكريستال معزولة من بئر واحد وعلى الفور يغرق الحلقة في النيتروجين السائل قبل وضع الحلقة في قارورة مناسبة. لقياس شدة البقعة الحيودة، قم بإنشاء مجلد يتم تشغيل XDS منه وتحديد موقع المسار إلى الصور.لتشغيل xdsme، أدخل الأمر في إطار المحطة الطرفية. بعد أن انتهت XDS التحقق من وظيفة ملف ليرة لبنانية الصحيح وملاحظة احتمال تحديد مجموعة الفضاء ، اكتمال البيانات ، وأعلى دقة ، الكريستال الفسيفساء وجودة البيانات. بعد التحقق من سجل XDS لا طائل منه للحصول على احتمال مجموعات الفضاء ، واستخدام الأوامر لإعادة تشغيل xdsme مع مختلف حلول مجموعة الفضاء المقترحة من قبل XDS ، في مجلد منفصل لتجنب تجاوز العملية السابقة.بعد تحديد أفضل حل استناداً إلى إحصائيات البيانات، أدخل الأوامر لتشغيل XSCALE و XDSCONV. لتحديد المرحلة دون عنصر مبعثر شاذ، استخدم إحداثيات 4P X، Y، لإعداد نموذج البداية للاستبدال الجزيئي. من ملف PDB استخدام محرر ملف PDB PDB فينيكس لاستخراج مونومر و لاقتطاع الأحماض الأمينية الخاصة به في ألانين.تشغيل X فرزها مع ملف الانعكاس التي تم إنشاؤها بواسطة XDSCONV والتسلسل كمدخلات. تحقق من ملف السجل من Xtriage. لاحظ اكتمال، وعدد الوحدات الفرعية في وحدة غير المتماثلة، anisotropy، وجود حلقات الجليد وحدوث التوأمة.لتشغيل Phaser-MR في فينيكس لاستبدال الجزيئية، حدد ملف الانعكاس، تسلسل وبدء 4P ستة نموذج ص اقتطاع في polyalanine وانقر فوق تشغيل. عند الانتهاء، تحقق إذا تم العثور على نموذج والتحقق من درجة الاستبدال الجزيئي. عامل ترجمة Z درجة لا يقل عن ثمانية، يشير إلى أن الحل هو الصحيح نهائيا.بعد تحديد المرحلة عن طريق الاستبدال الجزيئي، حدد تشغيل البناء التلقائي وانقر فوق تشغيل. سيتم إضافة كافة الملفات المطلوبة تلقائياً. عند الانتهاء، والتحقق من النموذج في COOT وبناء وصقل النموذج يدويا، وفقا لخريطة كثافة الإلكترون في COOT.باستخدام هذا النموذج، وسلسلة والبيانات الحيود كمدخلات، وصقل نموذج منظم يدويا في فينيكس، في إشارة إلى فينيكس للمساعدة في تحديد الاستراتيجية الصحيحة. بعد صقل تحقق من النتائج، يجب أن تقلل عمل الصقل والصقل. يجب احترام مؤشرات MolProbity و القيم المتطرفة ذات الارتباط المساحي الحقيقي المنخفض ، يجب أن تكون محدودة.عندما تم إنشاء أفضل نموذج المكررة، تشغيل MolProbity على الخادم والتحقق من أي القيم المتطرفة التي حددها البرنامج. يمكن استخدام الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم لتحديد الوزن الجزيئي الظاهر للبروتين النقي. يمكن تحسين حالة التبلور للببتيد ، من خلال تغيير درجة PH مقابل تركيز PEG حول حالة الغمم.على سبيل المثال، تم الحصول على أفضل بلورات H60A H307A H60A H60A أفضل، في 0.1 citrate الصوديوم ضرس مع درجة حِسّ 5.2 و 20٪ PEG 3350 تركيز، بعد دورة واحدة من البذر الدقيق لتحسين البلورية الدقيقة. في هذا التحليل، أظهرت فهرسة البيانات أن المجموعة الفضائية من الكريستال H60A H307A H60A H600 كانت C2221، ولكن XDS اقترحت حلا آخر، وهو مجموعة الفضاء MP. هيكل TmPep1050 H60A H307A، يمكن أن تكتمل بعد عدة دورات من الصقل الآلي واليدوي.تأكيد الدولة القلة مع سطح واجهة من 1، 710 angstroms مربع بين كل من مونومر والطاقة الحرة لتشكيل واجهة من ناقص 16.2 سعرات حرارية لكل الخلد. هنا ، يمكن ملاحظة صورة مقربة من موقع H60A H307A النشط H307A HmPep1050 HmPep1050 مقارنة بالموقع النشط لـ TmPep1050 dimer و dodecamer. عند بناء نموذج الحرص على بناء فقط ما تراه في كثافة الإلكترون لتجنب أكثر من التفسير، والبيانات، وتأخذ من الوقت لتلميع النموذج الخاص بك.الوزن الجزيئي للدمير وdedecamer يمكن أيضا أن تحدد من قبل الطيف الكتلة المحلية. ويمكن أن تكون الأساليب مفيدة للكشف عن القلة الانتقالية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

الجمع بين علم البلورات بالأشعة السينية بزاوية صغيرة تبعثر الأشعة السينية نموذج المناطق غير منظم من Nsa1 من سيريفيسيا س.

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

وصف جليكوبروتينس مع حظيرة الغلوبولين المناعي علم البلورات بالأشعة السينية والتقنيات الفيزيائية الحيوية

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

الدراسات الهيكلية "للجزيئات الكبيرة" في الحل باستخدام "تبعثر الأشعة السينية زاوية صغيرة"

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

حامل عينة الكل في واحد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع الحد الأدنى من تشتت الخلفية

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

ثقافة الخلية علي اغشيه نيرايد السيليكون والتعويض عن البرد لل Synchrotron الاشعه السينية الفلورية نانو-تحليل

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

الفحص الخاص بمثبطات بيروفوسفاتاسي الغشائية المربوطة بغشاء الثموغا

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

تحسين نمو بلورات الإندوثيابسين لتجارب علم البلورات التسلسلي

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

خطوط أنابيب البلورات الآلية في مرفق EMBL HTX في غرونوبل

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

فحص عالي الإنتاجية للحصول على نتائج بلورية لعلم بلورات البروتين

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...