Name: x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00
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我们感谢马丁·罗弗斯对本文件进行校对，并提出建设性意见。访问 Proxima 2 光束线 （SOLEIL 同步加速器） 是在块分配组 20151139。

1. 重组TmPep1050的生产和纯化
注：下面描述了克隆过程和纯化野生型TmPep1050改编自以前的研究11。或者，克隆可以使用合成基因进行。为了生成 TmPep1050 变种，可以按照以下方法 30 执行站点定向突变，例如，并行协议 （SPRINP） 方法30中的单底反应。纯化协议可用于 TmPep1050 变种。应避免使用 His-tag，因为它干扰金属离子结合。
<ol><li>表达式?...

此处描述的协议允许在结构层面上理解 TmPep1050 的二代多卡默过渡。该方法之前是用于确定两个TmPep1050寡聚物11的结构的经验。最具挑战性的一步是找到条件，促进多德卡人分离成稳定的暗化器。当添加金属离子辅助因子时，这些条件必须足够温和，才能将二丁二暗器重新关联到多德卡器中。寡聚物的分离也是关键的一步，因为它为结构研究和进一步的生化特性（例如，研究不同...

寡聚化是决定许多蛋白质生物功能的主要过程。在大肠杆菌中，估计只有35%的蛋白质是单体1。一些蛋白质，称为形态素，甚至可以采用几种寡聚态，亚基在每个寡聚态2中具有不同的结构。它们的寡聚状态之间的过渡通常是调节蛋白质活性的一种意义，因为每种寡聚状态可能有不同的特定活性或功能。几个例子的形态素已被文献记载，特别是磷脂蛋白原合成酶3，HPr激酶/磷酸酶4，隆蛋白酶5，乳酸脱氢酶6，甘油醛-3-磷酸脱氢酶7，丙酮酸盐激酶8，柠檬酸合成酶9，和核糖酶A10。最近，我们描述了M42氨基肽TmPep1050，另一个酶的例子与形态素样的行为，其活性取决于其寡聚状态11。其寡聚状态之间的过渡由其金属辅助因子进行调解，从而引起亚单位的几次结构修饰。
M42氨基肽家族属于MH氏族12，13，并广泛分布于细菌和阿奇亚14。M42氨基肽是正宗的二核酶，降解肽的长度为35个氨基酸残留物15。他们采用一种奇特的四角体状结构，由12个亚单位形成，其活性位点面向内腔。这种安排通常被描述为对活性的纳米分形，以避免不受控制的蛋白解。M42氨基肽的生理功能可能与蛋白质降解引起的蛋白酶体、水解肽16、17有关。热球菌霍里科希拥有四个M42氨基肽，每个呈现不同但互补的特异性18，19，20，21。单说，由两种不同类型的亚单位制造的异质复杂体在P.horikoshii中描述，暗示了22、23中肽复合物的存在。
文献中对M42氨基肽的几个结构已经描述了11、16、18、19、20、24、25、26。子单元由两个不同的域组成，一个催化域和一个二化域。催化域采用一种共同的α/β折叠保存于整个MH族中，原型催化域为Vibrio蛋白酶27的氨基肽Ap1。二聚化域采用PDZ形折叠16，除了在寡聚化中的作用外，还具有控制内腔11中基板访问和结合的作用。由于基本构建基块是一个二角板，多德卡默通常被描述为六个二角的关联，每个二丁体被放置在四边板16的每一边缘。M42 氨基肽的寡聚化取决于其金属辅助因子的可用性。二氧化二离子，通常为Zn2+和Co2+，在肽结合和水解中催化参与。它们存在于两个不同的绑定站点中，即 M1 和 M2 站点。两个金属离子也驱动和微调寡聚化，如PhTET2，PhTET3，PfTET3和TmPep105011，24，28，29。当金属辅助因子耗尽时，多德卡默分解成二元，如 PhTET2、PhTET3 和 TmPep1050 11、16、28，甚至单体，如 PhTET2和 PfTET324、29。
此处介绍的是用于研究 TmPep1050 寡聚物结构的协议。该协议是一套常见的方法，包括蛋白质纯化、蛋白解活性筛选、结晶、X射线衍射和分子替代。强调了处理金属糖酶、蛋白质寡聚化、蛋白质结晶和分子替代所固有的微妙之处。还提出了一个研究案例，以表明TmPep1050多卡默是否可以进一步分离成单体。为了解决这个问题，TMPep1050变种TmPep1050H60A H307A已经研究过其金属结合位点通过将 His-60（M2位点）和 His-307（M1位点）变异到阿拉残留物而受损。该协议可以容纳研究其他M42氨基肽或任何金属糖酶与形态素一样的行为。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13, 137-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://www.ccp4.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen II</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyXtal 15-well tool</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>132007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli PPY strain</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>see reference 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli XL1 blue strain</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Standard</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1511901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litholoops</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine-p-nitroanilide</td>
			<td>Bachem AG</td>
			<td>40010720025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neggia plugin</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>N/A</td>
			<td>visit https://www.dectris.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBAD-TOPO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K430001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www.phenix-online.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Phe</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17014702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Q</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17094705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17104301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima MSB8 strain</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 43589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TmCD00089984</td>
			<td>DNASU Plasmid Repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xdsme</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://github.com/legrandp/xdsme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

M42氨基肽形成由12个亚单位构成的功能活性复合物。他们的装配过程似乎由其金属离子辅助因子调节，从而触发了二丁体转换。金属离子结合时，在有源位点和相互作用界面上发生几次结构修改，形成二丁体，促进自组装。为了观察这种修改，在结构研究之前必须分离稳定的寡聚物。这里报道的方法，允许纯化稳定的多德卡派和二甲，TmPep1050，一个M42氨基肽 的T.马里蒂玛，并由X射线晶体学的结构测定。迪姆斯是由多德卡人用溷合剂去除金属离子从多德卡人那里准备的。没有他们的辅助因素，多德卡器变得不那么稳定，在加热时完全分离。通过直接的分子替代方法解决了寡聚结构问题。为了说明该方法，TmPep1050变种的结构，在金属离子结合中完全受损，显示没有进一步分解的二元体到单体。

为了研究在TmPep1050中可能分离成单体的单体，His-60和Sss-307的编码子被使用合成基因的丙氨酸codon所取代。该基因随后在pBAD载体中克隆，用于表达和纯化相应的TmPep1050变种，随后命名为TmPep1050H60A H307A。大小排除色谱（图3B）显示，纯化蛋白质的表观分子量为56kDa（单体分子量为36.0kDa）。据报道，TmPep1050二暗器11的类似明显分子量为52kDa。因此，TmPep1050...

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X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

该协议已经开发，以研究TmPep1050的二丁二代过渡，一种M42氨基肽，在结构层面。从蛋白质纯化到 X 射线数据处理，这是一条简单的管道。通过一个案例研究，TmPep1050H60A H307A 变种强调了晶体生成、数据集索引和分子 替代。

X射线晶体学研究热木体马里蒂玛M42氨基肽TmPep1050的寡聚态过渡

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

该协议有助于研究具有不同寡聚状态和寡聚相关活性的氨基肽，这些活性酶在非活性二聚剂和活性多德卡默斯之间保持平衡。这种传统技术可以轻松地在任何实验室中执行。除了要求访问光束线或X射线晶体学设施外，不需要特殊设备。对于某种适应，此方法可应用于任何其他具有活动或功能的蛋白质，其活性或功能取决于其寡聚化程度。要处理 X 射线数据，用户必须对晶体学有最低限度的了解。我们邀请用户关注培训，访问XXS Wiki，并观看Phenix教程。要执行活动测定， 在 75 摄氏度干浴中加入 25 微升 100 mM L-Leucine p-硝基苯甲酰胺至 965 微升 50 毫摩尔莫普、250 微摩尔钴二氯化物和 10% 甲醇预孵化反应混合物，然后稀释至 1 微摩尔最终浓度，再增加 50 毫摩尔 MM。接下来，在反应混合物中加入10微升微摩尔酶，然后旋转产生的溶液，然后将反应返回75摄氏度的干浴，不超过一小时。当溶液变黄时，停止与20%酸的一毫升反应，并旋转混合物，然后使其冷却至室温。然后将反应混合物的等分数转移到分光光度计细胞，并读取410纳米的吸收剂，以对抗没有酶的孵育反应混合物，作为负对照。对于苯丙胺制备，在 890 微升 50 毫摩尔莫普、0.5 摩尔硫酸铵和 100 微升纯化 TmPep1050 中加入 10 微升 1，10-phenanthroline 库存溶液。使用活性测定检查活性损失，如证明没有添加钴二氯化物。检测后，将样品转移到透析管中，在4摄氏度下对200毫升50毫摩尔莫普和0.5摩尔硫酸铵进行透析。在48小时透析期间，用新鲜缓冲液更换三次透析液，从透析管中采集样品。使用具有 30 千吨截止的超滤单元，将样品浓缩回 100 微升，并在 280 纳米的纳米体积分光光度计上检查浓度。准备调粉稀释酸酶，在50毫摩尔莫巴斯和0.5摩尔硫酸铵中稀释一微摩尔浓度，并在75摄氏度的干浴中孵育反应两小时。然后将酶样品浓缩到至少50微升浓度时，通过大小排除色谱检查分子量。为了改善蛋白质晶体的形状、大小和结晶度，在一滴晶体中加入适当体积的优化结晶溶液，使晶体液滴体积达到10微升。将液滴转移到1.5毫升微管中，并在播种良好的种子中再加入90微升结晶溶液。对于每颗种子稀释，在每口井中加入500微升结晶试剂，并在结晶板中加入适当数量的井中，并将两个微升蛋白质样品与两个结晶试剂微升和0.2微升种子混合在每口一个结晶支持中。然后将支架固定到结晶试剂的每个井上。对于晶体采摘，在浴缸中加满液氮，将用于样品处理的任何小瓶或篮子放入氮气中。处理液氮是危险的，它可能会导致严重的冻伤。一定要穿适当的个人防护，如低温手套和护目镜。根据晶体大小设置不同尺寸的样品拾取循环，并使用双筒望远镜选择含有晶体的滴。然后使用循环从一个井中轻轻地选择一个隔离的晶体，并立即将循环放入液氮中，然后再将循环放入合适的小瓶中。要测量衍射点强度，请创建一个文件夹，从该文件夹运行 XDS 并找到图像的路径。若要运行 xdsme，请在终端窗口中输入命令。XDS 结束后，作业检查正确的 lp 文件，并记下空间组确定、数据完整性、最高分辨率、水晶镶嵌度和数据质量的概率。在检查 XDS 无意义日志以获取空间组的可能性后，使用命令在单独的文件夹中使用 XDS 建议的不同空间组解决方案重新运行 xdsme，以避免覆盖上一个进程。根据数据统计信息选择最佳解决方案后，输入运行 XSCALE 和 XDSCONV 的命令。要确定没有异常散射项的相位，请使用 4P X，Y 坐标，为分子替换准备起始模型。从PDB文件，使用Phenix PDB文件编辑器提取单体和截断其氨基酸在丙氨酸。运行 X 与 XDSCONV 生成的反射文件和作为输入序列进行分诊。检查 Xtriage 的日志文件。注意完整性、非对称单元中的亚单位数量、各向异性、冰环的存在和结对发生。要运行Phenix中的相位-MR进行分子替换，请选择反射文件、序列和起始的4P 6 Y模型，在聚氨酯中截断，然后单击"运行"。完成后，检查是否找到模型，并检查分子替换的分数。翻译因子 Z 分数至少为 8，表示解决方案明确正确。通过分子替换确定相位后，选择"运行自动生成"并单击"运行"。将自动添加所有必需的文件。完成后，根据COOT中的电子密度图，检查COOT中的模型，并手动构建和优化模型。使用此模型、序列和衍射数据作为输入，在 Phenix 中优化手动策划的模型，参考 Phenix 来帮助选择正确的策略。细化后检查结果，细化免费和细化工作必须减少。必须尊重摩尔质量指标，必须限制实际空间相关性较低的离群值。生成最佳优化模型后，在服务器上运行 MolProbity 并检查程序标识的任何异常值。大小排除色谱可用于确定纯化蛋白质的表观分子量。肽的结晶条件，可以通过改变pH值与PEG浓度围绕二丁石的条件进行优化。例如，最好的TmPep1050 H60A H307A晶体，是在0.1摩尔柠檬酸钠中获得的，pH为5.2和20%PEG 3350浓度，经过一个周期的微播种，以提高微结晶度。在此分析中，数据索引显示，TmPep1050 H60A H307A晶体的空间组为C2221，但XDS提出了另一种解决方案，即MP空间组。TmPep1050 H60A H307A 的结构，经过几个周期的自动化和手动优化后可以完成。确认寡聚状态，单体之间的界面表面为1，710平方，界面形成的自由能量为每摩尔负16.2千卡。在这里，可以观察到 TmPep1050 H60A H307A 活动站点与 TmPep1050 二元和多德卡默的活动位点相比的特写。构建模型时，请注意只构建电子密度中看到的数据，以避免过度解释、数据，并花时间对模型进行润色。二丁和多德卡默的分子量也可以由本地质谱仪确定。这些方法可用于检测过渡寡聚物。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

制备及脂质立方相反应蛋白微晶交付串行飞秒晶体

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科研

生物化学

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

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结合 x 射线晶体学与小角度 x 射线散射到模型的非结构化区域的 Nsa1 从s 酿酒酵母

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

用 X 射线晶体学和生物物理技术表征免疫球蛋白折叠的糖蛋白

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

小角度 x 射线散射溶液中大分子的结构研究

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

用于大分子 X 射线晶体学的一体式样品支架,具有最小的背景散射

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

硅氮化物膜的细胞培养和同步加速器X射线荧光纳米分析的冷冻制备

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

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Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

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