Name: x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

Vi takker Martine Roovers for korrekturlæsning af dette papir og med konstruktive kommentarer. Adgang til Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) var inden for Blokallokeringsgrupper 20151139.

1. Produktion og rensning af rekombinant TmPep1050
BEMÆRK: Herefter beskrives kloningsproceduren og rensningen af vildtypen TmPep1050 tilpasset fra en tidligere undersøgelse11. Alternativt kan kloning gøres ved hjælp af et syntetisk gen. For at generere TmPep1050 varianter, site rettet mutagenesis kan udføres efter, for eksempel, single-primer reaktioner i parallel protokol (SPRINP) metode30. Renselsesprotokollen kan bruges til TmPep1050 varia...

Den protokol, der er beskrevet heri, gør det muligt at forstå overgangen til dimer-dodecamer af TmPep1050 på det strukturelle niveau. Metoden blev tidligere oplevet til bestemmelse af strukturen af både TmPep1050 oligomers11. Det mest udfordrende skridt var at finde betingelser, der fremmer dissociation af dodecamers i stabile dimers. Sådanne forhold måtte være milde nok til at gøre det muligt at reassociere dimers til dodecamers, når metal ion cofactor blev tilføjet. Adskillelsen af oli...

Oligomerization er en fremherskende proces, der dikterer de biologiske funktioner af mange proteiner. I Escherichia colianslås det, at kun 35 % af proteinerne er monomeriske1. Nogle proteiner, kaldet morfeeeiner, kan endda vedtage flere oligomeriske tilstande med underenheder med særskilt struktur i hver oligomeric tilstand2. Overgangen mellem deres oligomeriske tilstande er ofte et middel til at regulere protein aktivitet som hver oligomeric tilstand kan have en anden specifik aktivitet eller funktion. Flere eksempler på morfeseiner er veldokumenteret i litteraturen, navnlig porphobilinogensyntase3, HPr kinase/phosphatase4, Lon protease5, laktat dehydrogenase6, glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase7, pyruvatkinase8, citratsyntetase9og ribonuclease A10. For nylig har vi beskrevet M42 aminopeptidase TmPep1050, et andet eksempel på enzym med morfemein-lignende adfærd, hvis aktivitet afhænger af dens oligomeric stater11. Overgangen mellem dens oligomeriske tilstande er medieret af dens metalliske cofaktorer, som fremkalder flere strukturelle ændringer af underenheder.
Den M42 aminopeptidase familien tilhører MH klan12,13, og er udbredt blandt bakterier og Archaea14. M42 aminopeptidases er ægte dinuclear enzymer nedbrydende peptider op til 35 aminosyre rester i længde15. De vedtager en ejendommelig tetrahedron-formet struktur lavet af 12 underenheder med deres aktive steder orienteret mod en indre hulrum. Et sådant arrangement beskrives ofte som en nanoopdelte aktivitet for at undgå ukontrolleret proteolyse. Den fysiologiske funktion af M42 aminopeptidases kan være forbundet med proteasom, hydrolyserende peptider som følge af proteinnedbrydning 16,17. Pyrococcus horikoshii har fire M42 aminopeptidases, hver præsenterer forskellige, men komplementærespecificiteter 18,19,20,21. Ental, heterocomplexes lavet af to forskellige typer af underenheder er blevet beskrevet i P. horikoshii, hvilket tyder på eksistensen af peptidasome komplekser22,23.
Flere strukturer af M42 aminopeptidaser er blevet beskrevet ilitteraturen 11,16,18,19,20,24,25,26. Underenheden består af to forskellige domæner, et katalytisk domæne og et dimeriseringsdomæne. Den katalytiske domæne vedtager en fælles α/ β fold bevaret i hele MH klan, den arketypiske katalytiske domæne er aminopeptidase Ap1 af Vibrio proteolyticus27. Den dimerization domæne vedtager en PDZ-lignende fold16 og kan have, ud over sin rolle i oligomerization, en rolle i at kontrollere substrat adgang og bindende i det indre hulrum11. Da den grundlæggende byggesten er en dimer, dodecamer er ofte beskrevet som sammenslutningen af seks dimers, hver dimer er placeret på hver kant af tetrahedron16. Den oligomerization af M42 aminopeptidases bygger på tilgængeligheden af sine metal cofaktorer. Divalente metalioner, ofte Zn2+ og Co2+,er katalytisk involveret i peptidbindingen og hydrolyse. De findes i to forskellige bindingssteder, nemlig M1 og M2 sites. De to metalioner også køre og finjustere oligomerization som påvist for PhTET2, PhTET3, PfTET3, og TmPep105011,24,28,29. Når metal cofaktorer er opbrugt, dodecamer demonterer i dimers, ligesom i PhTET2, PhTET3, og TmPep105011,16,28, eller endda monomerer, som i PhTET2 og PfTET324,29.
Præsenteret her er en protokol, der anvendes til at studere strukturerne i TmPep1050 oligomers. Denne protokol er et sæt af almindelige metoder, herunder proteinrensning, proteolytisk aktivitet screening, krystallisering, X-ray diffraktion, og molekylær udskiftning. Finesser iboende beskæftiger sig med metalloenzymer, protein oligomerisering, protein krystallisering og molekylær udskiftning understreges. Et studieeksemier præsenteres også for at vise, om TmPep1050 dodecamers yderligere kan dissociate i monomerer eller ej. For at løse dette spørgsmål, en TmPep1050 variant, TmPep1050H60A H307A, er blevet undersøgt, hvis metal bindingssteder er svækket ved at mutere His-60 (M2 site) og His-307 (M1 site) til Ala rester. Denne protokol kan indkvarteres til at studere andre M42 aminopeptidases eller metalloenzymer med morfem-lignende adfærd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13, 137-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://www.ccp4.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen II</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyXtal 15-well tool</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>132007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli PPY strain</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>see reference 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli XL1 blue strain</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Standard</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1511901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litholoops</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine-p-nitroanilide</td>
			<td>Bachem AG</td>
			<td>40010720025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neggia plugin</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>N/A</td>
			<td>visit https://www.dectris.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBAD-TOPO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K430001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www.phenix-online.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Phe</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17014702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Q</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17094705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17104301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima MSB8 strain</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 43589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TmCD00089984</td>
			<td>DNASU Plasmid Repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xdsme</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://github.com/legrandp/xdsme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

Den M42 aminopeptidases form funktionelt aktive komplekser lavet af 12 underenheder. Deres samling proces synes at være reguleret af deres metal ion cofaktorer udløser en dimer-dodecamer overgang. Ved metalionbinding sker der flere strukturelle ændringer på det aktive sted og ved interaktionsgrænsefladen, der former dæmninger for at fremme selvsamlingen. For at observere sådanne ændringer skal stabile oligomerer isoleres forud for strukturundersøgelsen. Rapporteret her er en metode, der tillader rensning af stabile dodecamers og dimers af TmPep1050, en M42 aminopeptidase af T. maritima, og deres struktur bestemmelse ved X-ray krystallografi. Dimers blev fremstillet af dodecamers ved at fjerne metalioner med et chelaterende middel. Uden deres cofactor blev dodecamers mindre stabile og blev fuldt adskilt ved opvarmning. De oligomeriske strukturer blev løst ved hjælp af den enkle molekylære udskiftningsmetode. For at illustrere metoden præsenteres strukturen af en TmPep1050-variant, der er fuldstændig svækket i metalionbinding, og som ikke viser nogen yderligere opdeling af dimers til monomerer.

For at studere en mulig dodecamer dissociation i monomerer i TmPep1050, hans-60 og Hans-307 codons blev erstattet af alanin codon ved hjælp af et syntetisk gen. Dette gen blev derefter klonet i pBAD vektor for udtryk og rensning af den tilsvarende TmPep1050 variant efterfølgende opkaldt TmPep1050H60A H307A. Størrelseseksklusivekromatografi (Figur 3B) viste, at det rensede protein havde en tilsyneladende molekylvægt på 56 kDa (molekylvægt af monomeren er 36,0 kDa). En lignend...

Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Denne protokol er udviklet til at studere dimer-dodecamer overgang af TmPep1050, en M42 aminopeptidase, på det strukturelle niveau. Det er en enkel rørledning, der starter fra proteinrensning til røntgendatabehandling. Crystallogenesis, datasæt indeksering, og molekylær udskiftning er blevet understreget gennem et studie, TmPep1050H60A H307A variant.

X-Ray krystallografi at studere oligomeric stat Overgang af Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Denne protokol letter studiet af aminopeptidases med forskellige oligomeric stater og oligomerization-afhængige aktiviteter, der er afbalanceret mellem inaktive dimers og aktive dodecamers. Denne konventionelle teknik kan nemt udføres i ethvert laboratorium. Og bortset fra at kræve adgang til en beamline eller x-ray krystallografi facilitet, kræver ikke særlige enheder.Med en vis tilpasning, denne metode kan anvendes på ethvert andet protein med en aktivitet eller funktion, der er afhængig af dens grad af oligomerization. For at behandle røntgendata skal brugerne have en minimal forståelse af krystallografi. Vi inviterer brugerne til at følge kurser, til at besøge XDS Wiki, og til at se Phenix tutorials.For at udføre en aktivitetsanalyse tilsættes 25 mikroliter på 100 mM L-Leucin p-Nitroanilide til 965 mikroliter på 50 millimolar MOPS, 250 mikromolar kobolt to klorid og 10% methanol Pre inkubere reaktionen mix i en 75 grader Celsius tørt bad, før fortynde enzymet til en en mikromolar endelig koncentration med yderligere 50 millimolar MOPS. Dernæst tilsættes 10 mikroliter af et mikromolarenzym til reaktionsblandingen og vortex den resulterende opløsning, før reaktionen returneres til det 75 grader Celsius tørre bad i højst en time. Når opløsningen er blevet gul, skal du stoppe reaktionen med en milliliter 20% sur syre og vortex blandingen, før den køler til stuetemperatur.Derefter overføres en aliquot af reaktionsblandingen til en spektrofotometercelle, og absorberene aflæses ved 410 nanometer mod en inkuberet reaktionsblanding uden enzym som en negativ kontrol. Til apenzympræparatet tilsættes 10 mikroliter af 1, 10-phenanthrolinlinstrømpeopløsning til 890 mikroliter på 50 millimolar MOPS, 0,5 molar ammoniumsulfat og 100 mikroliter renset TmPep1050. Aktivitetstabet kontrolleres ved hjælp af aktivitetsanalysen som påvist uden tilsætning af kobolt 2chlorid.Efter analysen overføres prøven til et dialyserør, og prøven dialyseres mod 200 milliliter 50 millimolar MOPS og 0,5 molar ammoniumsulfat ved fire grader Celsius. Dialyseatet udskiftes med frisk buffer tre gange i løbet af dialyse på 48 timer, og prøven udtages af dialyserøret. Ved hjælp af ultrafiltreringsenheder med en udskæring på 30 kilodalton skal prøven koncentreres tilbage til 100 mikroliter, og koncentrationen kontrolleres på et nanovolumenspektrofotometer ved 280 nanometer.For at forberede dimers fortyndes apoenzym til en en mikromolar koncentration i 50 millimolar MOPS og 0,5 molar ammonium sulfat, og inkubere reaktionen i to timer i en 75 grader Celsius tørt bad. Derefter koncentreres enzymprøven, når der er mindst 50 mikroliters koncentration, og molekylvægten kontrolleres efter størrelsesudelukkekromatografi. For at forbedre proteinkrystallernes form, størrelse og krystallinitet skal der tilsættes den passende mængde optimeret krystalliseringsopløsning til en dråbe krystaller for at bringe krystaldråbervolumenet til 10 mikroliter.Overfør dråben til et 1,5 milliliter mikrorør og tilsæt 90 flere mikroliter krystalliseringsopløsning til den såede brønd. For hver frøfortynding tilsættes 500 mikroliter krystalliseringsregenser pr. brønd til et passende antal brønde i en krystalliseringsplade, og der blandes to mikroliter proteinprøve med to mikroliter krystalliseringsgenser og 0,2 mikroliter af frø i en krystalliseringsunderstøttelse pr. brønd. Derefter fastgør støtterne på hver brønd af krystallisering reagens.Til krystalplukning fyldes et bad med flydende nitrogen og eventuelle hætteglas eller kurv, der anvendes til prøvehåndtering, fyld i nitrogenet. Håndtering af flydende nitrogen er farligt, det kan forårsage alvorlige forfrysninger. Sørg for at bære ordentlig individuel beskyttelse som kryogene handsker og beskyttende øjenbriller.Konfigurer prøveplukningssløjfe i forskellige størrelser i henhold til krystalstørrelsen, og brug en kikkert til at vælge en dråbe, der indeholder krystaller. Brug derefter en løkke til forsigtigt at vælge en isoleret krystal fra en brønd og straks kaste løkken i flydende nitrogen, før du placerer løkken i et passende hætteglas. Hvis du vil måle diffraktions staffageintensiteter, skal du oprette en mappe, hvorfra XDS skal køres, og finde stien til billederne.Hvis du vil køre xdsme, skal du angive kommandoen i et terminalvindue. Når XDS har afsluttet jobbet kontrollere den korrekte lp-fil og bemærk sandsynligheden for pladsgruppe bestemmelse, data fuldstændighed, den højeste opløsning, krystal mosaicity og datakvalitet. Når du har kontrolleret XDS-filfilen uden grund for at opnå sandsynligheden for pladsgrupper, skal du bruge kommandoerne til at køre xdsme igen med forskellige rumgruppeløsninger, der er foreslået af XDS, i en separat mappe for at undgå at tilsidesætte den forrige proces.Når du har valgt den bedste løsning baseret på datastatistikken, skal du angive kommandoerne til at køre XSCALE og XDSCONV. For at bestemme fasen uden en unormal spredning element, skal du bruge 4P X, Y koordinater, at forberede startmodellen for molekylær udskiftning. Fra PDB-filen skal du bruge Phenix PDB-fileditoren til at udtrække A-monomeren og afkorte dens aminosyrer i alanin.Kør X triaged med refleksionsfilen genereret af XDSCONV og sekvensen som input. Kontroller logfilen fra Xtriage. Bemærk fuldstændigheden, antallet af underenheder i den asymmetriske enhed, anisotropi, tilstedeværelsen af isringe og venskabsbyforekomst.Hvis du vil køre Phaser-MR i Phenix for molekylær udskiftning, skal du vælge refleksionsfilen, sekvensen og start 4P seks Y-modellen afkortet i polyalaninen og klikke på Kør. ved afslutningen skal du kontrollere, om der er fundet en model, og kontrollere scoren for den molekylære udskiftning. En oversættelsesfaktor Z-score på mindst otte angiver, at løsningen er endeligt korrekt.Når fasen er fastslået ved molekylær udskiftning, skal du vælge Kør auto build og klikke på Kør. Alle de nødvendige filer vil automatisk blive tilføjet. Ved afslutningen, kontrollere modellen i COOT og bygge og forfine modellen manuelt, i henhold til elektrontæthed kort i COOT.Ved hjælp af denne model, sekvensen og diffraktionsdataene som input forfiner den manuelt kuraterede model i Phenix med henvisning til Phenix for at hjælpe med at vælge den rigtige strategi. Efter raffinement kontrollere resultaterne, raffinement gratis og raffinement arbejde skal falde. MolProbity indikatorer skal respekteres og outliers med lav reel plads korrelation, skal begrænses.Når den bedste raffinerede model er blevet genereret, skal du køre MolProbity på serveren og tjekke eventuelle outliers identificeret af programmet. Størrelse udelukkelse kromatografi kan bruges til at bestemme den tilsyneladende molekylvægt af det rensede protein. Peptidets krystalliseringstilstand kan optimeres ved at variere pH-koncentrationen i forhold til PEG-koncentrationen omkring dimerens tilstand.For eksempel, de bedste TmPep1050 H60A H307A krystaller, blev opnået i 0,1 molar natriumcitrat med en pH-pH på 5,2 og 20% PEG 3350 koncentration, efter en cyklus af mikro såning for at forbedre mikro krystallinitet. I denne analyse viste dataindeksering, at rumgruppen af TmPep1050 H60A H307A krystal var C2221, men XDS foreslog en anden løsning, MP rumgruppen. Strukturen af TmPep1050 H60A H307A, kunne fuldføres efter flere cyklusser af automatiseret og manuel raffinement.Bekræfter oligomeric tilstand med en grænseflade overflade på 1, 710 firkantede angstroms mellem både monomerer og en fri energi interface dannelse af minus 16,2 kilokalorier per muldvarp. Her kan et nærbillede af TmPep1050 H60A H307A aktive site i forhold til det aktive sted for TmPep1050 dimer og dodecamer observeres. Når du bygger en model sørge for at bygge kun, hvad du ser i elektrontætheden for at undgå over fortolkning, data, og at tage sig tid til at polere din model.Den molekylvægt af dimer og dodecamer kan også bestemmes af indfødte massespektrometri. Og metoderne kan være nyttige til at opdage overgangen oligomers.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Udarbejdelse og levering af Protein Mikrokrystaller i lipide Cubic fase for Serial Femtosekund Krystallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Kombinere røntgenkrystallografi med lille vinkel X-Ray spredning til Model ustruktureret regioner af Nsa1 fra S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering af glykoproteiner med immunglobulin Fold af røntgenkrystallografi og biofysiske metoder

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle undersøgelser af makromolekyler i løsning ved hjælp af små vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En all-in-One-prøve holder til makromolekylær røntgenkrystallografi med minimal baggrunds spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cellekultur på silicium nitrid membraner og Cryopreparation for Synchrotron røntgen fluorescens Nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga Maritima membranbundne Pyrofosfatasehæmmere

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimering af væksten af endothiapepsinkrystaller til serielle krystallografieksperimenter

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

De automatiserede krystallografirørledninger på EMBL HTX-anlægget i Grenoble

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening for at opnå krystal hits til proteinkrystallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...