Name: x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

Wij danken Martine Roovers voor het nalezen van deze krant en het geven van constructieve opmerkingen. Toegang tot Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) viel binnen Block Allocation Groups 20151139.

1. Productie en zuivering van recombinant TmPep1050
OPMERKING: Hierna worden de kloonprocedure en de zuivering van wild-type TmPep1050 aangepast aan een eerdere studie11beschreven . Als alternatief kan het klonen worden gedaan met behulp van een synthetisch gen. Om TmPep1050-varianten te genereren, kan site directed mutagenesis worden uitgevoerd volgens bijvoorbeeld de single-primer reacties in parallel protocol (SPRINP) methode30. Het zuiveringspr...

Het protocol hierin beschreven maakt het mogelijk inzicht in de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050 op structureel niveau. De methodologie werd eerder ervaren voor het bepalen van de structuur van beide TmPep1050 oligomers11. De meest uitdagende stap was het vinden van voorwaarden ter bevordering van de dissociatie van dodecamers in stabiele dimers. Dergelijke omstandigheden moesten mild genoeg zijn om de koppeling van dimers in dodecamers mogelijk te maken toen de metaal-ionencofactor werd toe...

Oligomerisatie is een overheersend proces dat de biologische functies van veel eiwitten dicteert. In Escherichia coliwordt geschat dat slechts 35% van de eiwitten monomeerbaar is1. Sommige eiwitten, genaamd morpheeins, kunnen zelfs verschillende oligomerische toestanden aannemen met subeenheden met een duidelijke structuur in elke oligomerische toestand2. De overgang tussen hun oligomerische toestanden is vaak een gemiddelde om eiwitactiviteit te reguleren, omdat elke oligomerische toestand een andere specifieke activiteit of functie kan hebben. Verschillende voorbeelden van morpheeins zijn goed gedocumenteerd in de literatuur, met name de porphobilinogen synthase3, HPr kinase/phosphatase4, Lon protease5, lactate dehydrogenase6, glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase7, pyruvate kinase8, citraat synthase9, en ribonuclease A10. Onlangs hebben we beschreven de M42 aminopeptidase TmPep1050, een ander voorbeeld van enzym met morphein-achtig gedrag, waarvan de activiteit afhankelijk is van zijn oligomerieke toestanden11. De overgang tussen de oligomerische toestanden wordt bemiddeld door zijn metaalcofactoren die verschillende structurele wijzigingen van de subeenheden veroorzaken.
De M42 aminopeptidase familie behoort tot de MH clan12,13, en wordt op grote schaal verspreid onder Bacteriën en Archaea14. De M42 aminopeptidases zijn echte dinucleaire enzymen die peptiden tot 35 aminozuurresten in lengte15degraderen. Ze nemen een eigenaardige tetraëdervormige structuur aan die bestaat uit 12 subeenheden met hun actieve locaties gericht op een innerlijke holte. Een dergelijke regeling wordt vaak beschreven als een nano-compartimentering van de activiteit om ongecontroleerde proteolyse te voorkomen. De fysiologische functie van de M42 aminopeptidases kan worden geassocieerd met het proteasoom, hydrolyserende peptiden als gevolg van eiwitafbraak16,17. Pyrococcus horikoshii bezit vier M42 aminopeptidases, die elk verschillende maar complementaire specificiteiten18,19,20,21presenteren . Bijzonder, heterocomplexen gemaakt van twee verschillende soorten subeenheden zijn beschreven in P. horikoshii, wat wijst op het bestaan van peptidasome complexen22,23.
Verschillende structuren van M42 aminopeptidases zijn beschreven in de literatuur11,16,18,19,20,24,25,26. De subunit bestaat uit twee verschillende domeinen, een katalytisch domein en een dimerisatiedomein. De katalytische domein neemt een gemeenschappelijke α / β vouw bewaard in de hele MH-clan, de archetypische katalytische domein wordt de aminopeptidase Ap1 van Vibrio proteolyticus27. De dimerization domein neemt een PDZ-achtige vouw16 en kan, naast zijn rol in de oligomerisatie, een rol hebben bij het regelen van substraattoegang en binding in de binnenholte11. Aangezien de basisbouwsteen een dimer is, wordt de dodecamer vaak omschreven als de associatie van zes dimers, waarbij elke dimer aan elke rand van de tetraëder16wordt geplaatst. De oligomerisatie van de M42 aminopeptidases is afhankelijk van de beschikbaarheid van zijn metaalcofactoren. Divalent metaalionen, vaak Zn2+ en Co2+, zijn katalytisch betrokken bij de peptide binding en hydrolyse. Ze zijn te vinden in twee verschillende bindende sites, namelijk M1 en M2 sites. De twee metalen ionen rijden ook en stemmen de oligomerisatie zoals aangetoond voor PhTET2, PhTET3, PfTET3 en TmPep105011,24,28,29. Wanneer de metaalcofactoren uitgeput zijn, demonteert de dodecamer in dimers, zoals in PhTET2, PhTET3 en TmPep105011,16,28of zelfs monomeren, zoals in PhTET2 en PfTET324,29.
Hier gepresenteerd is een protocol dat wordt gebruikt voor het bestuderen van de structuren van TmPep1050 oligomers. Dit protocol is een reeks gemeenschappelijke methoden, waaronder eiwitzuivering, proteolytische activiteitscreening, kristallisatie, röntgendiffractie en moleculaire vervanging. Subtiliteiten die inherent zijn aan het omgaan met metalloenzymen, eiwit oligomerisatie, eiwit kristallisatie en moleculaire vervanging worden benadrukt. Er wordt ook een studiegeval gepresenteerd om aan te tonen of TmPep1050 dodecamers zich verder kunnen distantiëren in monomeren of niet. Om deze vraag te beantwoorden, een TmPep1050 variant, TmPep1050H60A H307A, is onderzocht waarvan de metalen binding sites worden aangetast door het muteren van His-60 (M2 site) en His-307 (M1 site) naar Ala residuen. Dit protocol kan worden ondergebracht om andere M42 aminopeptidases of metaalloenzymen met morpheein-achtig gedrag te bestuderen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13, 137-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://www.ccp4.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen II</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyXtal 15-well tool</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>132007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli PPY strain</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>see reference 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli XL1 blue strain</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Standard</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1511901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litholoops</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine-p-nitroanilide</td>
			<td>Bachem AG</td>
			<td>40010720025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neggia plugin</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>N/A</td>
			<td>visit https://www.dectris.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBAD-TOPO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K430001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www.phenix-online.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Phe</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17014702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Q</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17094705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17104301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima MSB8 strain</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 43589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TmCD00089984</td>
			<td>DNASU Plasmid Repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xdsme</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://github.com/legrandp/xdsme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

De M42 aminopeptidases vormen functioneel actieve complexen gemaakt van 12 subeenheden. Hun assemblageproces lijkt te worden gereguleerd door hun metalen ionen cofactoren triggering een dimer-dodecamer overgang. Bij metaalionbinding vinden verschillende structurele wijzigingen plaats in de actieve site en op de interactie-interface, waardoor dimers worden gevormd om de zelfassemblage te bevorderen. Om dergelijke wijzigingen waar te nemen, moeten stabiele oligomeren vóór de structurele studie worden geïsoleerd. Hier gemeld is een methode die het mogelijk maakt de zuivering van stabiele dodecamers en dimers van TmPep1050, een M42 aminopeptidase van T. maritima, en hun structuur bepaling door X-ray kristallografie. Dimers werden bereid van dodecamers door het verwijderen van metalen ionen met een chelaatvormer. Zonder hun cofactor werden dodecamers minder stabiel en werden ze volledig gescheiden bij verwarming. De oligomeric structuren werden opgelost door de ongecompliceerde moleculaire vervangingsbenadering. Ter illustratie van de methodologie wordt de structuur van een TmPep1050-variant, volledig aangetast in metaalionbinding, gepresenteerd waaruit blijkt dat er geen verdere uitsplitsing van dimers op monomeren wordt weergegeven.

Om een mogelijke dodecamer dissociatie in monomeren in TmPep1050 te bestuderen, werden de His-60 en His-307 codons vervangen door alanine codon met behulp van een synthetisch gen. Dit gen werd vervolgens gekloond in pBAD vector voor expressie en zuivering van de overeenkomstige TmPep1050 variant vervolgens genaamd TmPep1050H60A H307A. Grootte uitsluiting chromatografie (Figuur 3B) toonde aan dat het gezuiverde eiwit had een schijnbare moleculaire gewicht van 56 kDa (moleculair gew...

Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Dit protocol is ontwikkeld om de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050, een M42 aminopeptidase, op structureel niveau te bestuderen. Het is een eenvoudige pijplijn vanaf eiwitzuivering tot röntgengegevensverwerking. Crystallogenesis, data set indexatie, en moleculaire vervanging zijn benadrukt door middel van een geval van studie, TmPep1050H60A H307A variant.

X-Ray Kristallografie om de oligomerische staat overgang van de Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 studie

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Dit protocol vergemakkelijkt de studie van aminopeptidases met verschillende oligomeric toestanden en oligomerisatie-afhankelijke activiteiten die in evenwicht zijn tussen inactieve dimers en actieve dodecamers. Deze conventionele techniek kan eenvoudig worden uitgevoerd in elk lab. En afgezien van het vereisen van toegang tot een beamline of x-ray kristallografie faciliteit, vereist geen speciale apparaten.Met enige aanpassing kan deze methode worden toegepast op elk ander eiwit met een activiteit of functie die afhankelijk is van de mate van oligomerisatie. Om de röntgengegevens te verwerken, moeten gebruikers een minimaal begrip van kristallografie hebben. We nodigen gebruikers uit om trainingen te volgen, om XDS Wiki te bezoeken en phenix tutorials te bekijken.Om een activiteitstest uit te voeren, voeg 25 microliters van 100 mM L-Leucine p-Nitroanilide toe aan 965 microliters van 50 millimolar MOPS, 250 micromolar kobalt twee chloride en 10%methanol Pre incubeer het reactiemengsel in een 75 graden Celsius droog bad, alvorens het enzym te verdunnen tot een micromolar eindconcentratie met extra 50 millimalar MOPS. Voeg vervolgens 10 microliter van één micromolarenzym toe aan het reactiemengsel en draaikolk de resulterende oplossing voordat u de reactie op het 75 graden Celsius droge bad voor niet meer dan een uur terugzet. Wanneer de oplossing geel is geworden, stop de reactie met een milliliter van 20%zuurzuur en vortex het mengsel voordat het te laten afkoelen tot kamertemperatuur.Breng vervolgens een aliquot van de reactiemix over naar een spectrofotometercel en lees de absorberendetten op 410 nanometer tegen een geïncubeerde reactiemix zonder enzym, als een negatieve controle. Voeg voor apo-enzymbereiding 10 microliter van 1, 10-fenanthroline-voorraadoplossing toe aan 890 microliter van 50 millimolar MOPS, 0,5 molar ammoniumsulfaat en 100 microliter gezuiverde TmPep1050. Controleer het activiteitsverlies met behulp van de activiteitstest, zoals aangetoond zonder toevoeging van kobalt twee chloride.Breng het monster na de test over in een dialysebuis en dialyseer het monster met 200 milliliter mops van 50 millimolar en 0,5 molar ammoniumsulfaat bij vier graden Celsius. Wissel het dialysaat drie keer met een verse buffer tijdens de 48-uursdialyse en verzamel het monster van de dialysebuis. Met behulp van ultrafiltratie-eenheden met een cutoff van 30 kilodalton concentreert u het monster terug naar 100 microliter en controleert u de concentratie op een nanovolumespectrofotometer op 280 nanometer.Om de dimers te bereiden verdunnen het apo-enzym tot een concentratie van één micromolar in 50 millimolar MOPS en 0,5 molar ammoniumsulfaat, en de reactie gedurende twee uur uitbroeden in een droog bad van 75 graden Celsius. Concentreer vervolgens het enzymmonster op wanneer ten minste 50 microliterconcentratie en controleer het moleculaire gewicht op grootteuitsluitingschromatografie. Om de vorm, grootte en kristallijnheid van de eiwitkristallen te verbeteren, voegt u het juiste volume van geoptimaliseerde kristallisatieoplossing toe aan een druppel kristallen om het kristaldruppelvolume op 10 microliter te brengen.Breng de druppel naar een 1,5 milliliter microbuis en voeg nog 90 microliter kristallisatieoplossing toe aan de gezaaide put. Voeg voor elke zaadverdunning 500 microliter kristallisatiereagens per put toe aan het juiste aantal putten in een kristallisatieplaat en meng twee microliter eiwitmonsters met twee microliter kristallisatiereagens en 0,2 microliter zaden in één kristallisatieondersteuning per put. Bevestig vervolgens de steunen op elke put van kristallisatie reagens.Voor het plukken van kristallen, vul een bad met vloeibare stikstof en duik alle flesjes of mand gebruikt voor monster behandeling in de stikstof. Het verwerken van vloeibare stikstof is gevaarlijk, het kan ernstige bevriezingen veroorzaken. Zorg ervoor dat u de juiste individuele bescherming, zoals cryogene handschoenen en beschermende bril dragen.Stel monsterpluklussen van verschillende grootte in op basis van de kristalgrootte en gebruik een verrekijker om een druppel met kristallen te selecteren. Gebruik vervolgens een lus om voorzichtig een geïsoleerd kristal uit een put te selecteren en onmiddellijk de lus in vloeibare stikstof te dompelen voordat u de lus in een geschikte flacon plaatst. Als u de intensiteit van de diffractie wilt meten, maakt u een map van waaruit XDS wordt uitgevoerd en zoekt u het pad naar de afbeeldingen.Voer de opdracht in een eindvenster in om xdsme uit te voeren. Nadat XDS de taak heeft beëindigd, controleert u het juiste lp-bestand en noteert u de waarschijnlijkheid van de bepaling van de ruimtegroep, de volledigheid van gegevens, de hoogste resolutie, kristalmozaïek en gegevenskwaliteit. Nadat u het xds-zinloos logboek hebt gecontroleerd om de waarschijnlijkheid van ruimtegroepen te verkrijgen, gebruikt u de opdrachten om xdsme opnieuw te beheren met verschillende ruimtegroepoplossingen die XDS voorstelt, in een aparte map om te voorkomen dat het vorige proces wordt overschreven.Nadat u de beste oplossing hebt geselecteerd op basis van de gegevensstatistieken, voert u de opdrachten in om de XSCALE en XDSCONV uit te voeren. Gebruik 4P X, Y-coördinaten om het startmodel voor moleculaire vervanging voor te bereiden om de fase te bepalen zonder een afwijkend verstrooiingsitem. Gebruik uit het PDB-bestand de Phenix PDB-bestandseditor om de A-monomeer te extraheren en de aminozuren in alanine af te trunceren.Voer X triaged uit met het reflectiebestand dat wordt gegenereerd door XDSCONV en de volgorde als ingangen. Controleer het logbestand van Xtriage. Let op de volledigheid, het aantal subeenheden in de asymmetrische eenheid, de anisotropie, de aanwezigheid van ijsringen en het jumelages.Als u Phaser-MR in Phenix wilt uitvoeren voor moleculaire vervanging, selecteert u het reflectiebestand, de volgorde en het startbare 4P zes Y-model afgekapt in polyalanine en klikt u op Uitvoeren. Controleer na voltooiing of er een model is gevonden en controleer de score van de moleculaire vervanging. Een vertaalfactor Z-score van ten minste acht, geeft aan dat de oplossing definitief correct is.Nadat u de fase hebt bepaald door moleculaire vervanging, selecteert u Automatisch bouwen uitvoeren en klikt u op Uitvoeren. Alle vereiste bestanden worden automatisch toegevoegd. Controleer na voltooiing het model in COOT en bouw en verfijn het model handmatig, volgens de elektronendichtheidskaart in COOT.Met behulp van dit model, de volgorde en de diffractie gegevens als ingangen, verfijnen van de handmatig samengestelde model in Phenix, verwijzend naar Phenix om te helpen bij het selecteren van de juiste strategie. Na verfijning controleer de resultaten, verfijning vrij en verfijning werk moet afnemen. MolProbity indicatoren moeten worden gerespecteerd en uitschieters met een lage echte ruimte correlatie, moet worden beperkt.Wanneer het beste verfijnde model is gegenereerd, voert u MolProbity uit op de server en controleert u eventuele uitschieters die door het programma zijn geïdentificeerd. De uitsluitingschromatografie van de grootte kan worden gebruikt om het zichtbare moleculaire gewicht van het gezuiverde eiwit te bepalen. De kristallisatievoorwaarde van het peptide kan worden geoptimaliseerd door de pH versus de PEG-concentratie rond de conditie van het dimer te variëren.Bijvoorbeeld, de beste TmPep1050 H60A H307A kristallen, werden verkregen in 0,1 molaire natriumcitraat met een pH van 5,2 en 20%PEG 3350 concentratie, na een cyclus van micro zaaien om de microkristalliniteit te verbeteren. In deze analyse toonde gegevensindexatie aan dat de ruimtegroep van het TmPep1050 H60A H307A-kristal C2221 was, maar XDS stelde een andere oplossing voor, de MP-ruimtegroep. De structuur van TmPep1050 H60A H307A, kan worden voltooid na verschillende cycli van geautomatiseerde en handmatige verfijning.Bevestiging van de oligomeric staat met een interface oppervlak van 1, 710 vierkante angstroms tussen beide monomeren en een vrije energie van interface vorming van min 16,2 kilocalorieën per mol. Hier kan een close-up van de TmPep1050 H60A H307A actieve site worden waargenomen in vergelijking met de actieve site van de TmPep1050 dimer en dodecamer. Bij het bouwen van een model zorg ervoor dat alleen bouwen wat je ziet in de elektronendichtheid om te voorkomen dat over interpretatie, de gegevens, en de tijd nemen om uw model te polijsten.Het moleculaire gewicht van de dimer en dodecamer kan ook worden bepaald door inheemse massaspectrometrie. En de methoden kunnen nuttig zijn voor het opsporen van overgang oligomers.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Structurele Studies van macromoleculen in oplossing met behulp van kleine Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Een alles-in-een monsterhouder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie met minimale achtergrond verstrooiing

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Celkweek op siliciumnitride membranen en Cryopreparation voor Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimaliseren van de groei van endothiapepsine kristallen voor seriële kristallografie experimenten

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

De geautomatiseerde kristallografiepijpleidingen in de EMBL HTX-faciliteit in Grenoble

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening om kristalhits te verkrijgen voor eiwitkristallografie

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...