Name: x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

Nous remercions Martine Roovers d’avoir relu ce document et d’avoir formulé des commentaires constructifs. L’accès à la ligne de faisceau Proxima 2 (synchrotron SOLEIL) faisait partie des groupes d’allocation de blocs 20151139.

1. Production et purification de tmpep1050 recombinant
NOTE: Ci-après sont décrits la procédure de clonage et la purification de type sauvage TmPep1050 adapté d’une étude précédente11. Alternativement, le clonage peut être fait à l’aide d’un gène synthétique. Pour générer des variantes TmPep1050, la mutagenèse dirigée par le site peut être effectuée à la suite, par exemple, des réactions d’amorce unique dans la méthode du protocole parallèle (...

Le protocole décrit ci-après permet de comprendre la transition dimer-dodecamer de TmPep1050 au niveau structurel. La méthodologie a été expérimentée précédemment pour déterminer la structure des deux oligomers TmPep105011. L’étape la plus difficile a été de trouver des conditions favorisant la dissociation des dodecamers en dimers stables. De telles conditions ont dû être assez douces pour permettre la réassociation des dimers dans des dodecamers quand le cofacteur d’ion en m?...

L’oligomérisation est un processus prédominant qui dicte les fonctions biologiques de nombreuses protéines. Dans Escherichia coli, on estime que seulement 35% des protéines sont monomères1. Certaines protéines, appelées morphéines, peuvent même adopter plusieurs états oligomériques avec des sous-unités ayant une structure distincte dans chaque état oligomérique2. La transition entre leurs états oligomériques est souvent un moyen de réguler l’activité protéique car chaque état oligomérique peut avoir une activité ou une fonction spécifique différente. Plusieurs exemples de morphétines ont été bien documentés dans la littérature, notamment la synthase porphobilinogen3, HPr kinase/phosphatase4, Lon protease5, lactate dehydrogenase6, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase7, pyruvate kinase8, synthase citrate9, et ribonuclease A10. Récemment, nous avons décrit l’aminopeptidase M42 TmPep1050, un autre exemple d’enzyme avec un comportement morphéine, dont l’activité dépend de ses états oligomériques11. La transition entre ses états oligomériques est médiée par ses cofacteurs métalliques qui induisent plusieurs modifications structurelles des sous-unités.
La famille des aminopeptidase M42 appartient au clan MH12,13, et est largement répartie entre bactéries et archée14. Les aminopeptidases M42 sont de véritables enzymes dinucléaires dégradant les peptides jusqu’à 35 résidus d’acides aminés delongueur 15. Ils adoptent une structure particulière en forme de tétraèdre faite de 12 sous-units avec leurs sites actifs orientés vers une cavité intérieure. Un tel arrangement est souvent décrit comme une nano-compartimentation de l’activité pour éviter la protéolyse incontrôlée. La fonction physiologique des aminopeptidases M42 peut être associée aux peptides hydrolysants protéasomes résultant de la dégradation desprotéines 16,17. Pyrococcus horikoshii possède quatre aminopeptidases M42, chacune présentant des spécificités distinctes mais complémentaires18,19,20,21. Singulièrement, des hétérocomplexes faits de deux types différents de sous-unités ont été décrits dans P. horikoshii,suggérant l’existence des complexes peptidasome22,23.
Plusieurs structures de M42 aminopeptidases ont été décrites dans lalittérature 11,16,18,19,20,24,25,26. Le sous-unité est composé de deux domaines distincts, d’un domaine catalytique et d’un domaine de dimérisation. Le domaine catalytique adopte un pli α/β commun conservé dans tout le clan MH, le domaine catalytique archétypal étant l’aminopeptidase Ap1 de Vibrio proteolyticus27. Le domaine de la dimérisation adopte un pli16 en forme de PDZ et peut avoir, en plus de son rôle dans l’oligomérisation, un rôle dans le contrôle de l’accès au substrat et la liaison dans la cavitéinterne 11. Comme le bloc de base est un dimère, le dodécaamer est souvent décrit comme l’association de six dimers, chaque dimer étant placé à chaque bord du tétraèdre16. L’oligomérisation des aminopeptidases M42 repose sur la disponibilité de ses cofacteurs métalliques. Les ions métalliques Divalent, souvent Zn2+ et Co2+,sont catalytiques impliqués dans la liaison peptidique et l’hydrolyse. On les trouve dans deux sites de liaison distincts, à savoir les sites M1 et M2. Les deux ions métalliques conduisent et accordent finement l’oligomérisation comme démontré pour PhTET2, PhTET3, PfTET3, et TmPep105011,24,28,29. Lorsque les cofacteurs métalliques sont épuisés, le dodecamer se démonte en dimers, comme dans PhTET2, PhTET3, et TmPep105011,16,28, ou même des monomères, comme dans PhTET2 et PfTET324,29.
Présenté ici est un protocole utilisé pour étudier les structures des oligomers TmPep1050. Ce protocole est un ensemble de méthodes communes comprenant la purification de protéine, le criblage protéolytique d’activité, la cristallisation, la diffraction de rayon X, et le remplacement moléculaire. Les subtilités inhérentes au traitement des métalloenzymes, de l’oligomérisation des protéines, de la cristallisation des protéines et du remplacement moléculaire sont soulignées. Un cas d’étude est également présenté pour montrer si tmPep1050 dodecamers peut se dissocier davantage en monomères ou non. Pour répondre à cette question, une variante tmpep1050, TmPep1050H60A H307A, a été étudiée dont les sites de liaison métallique sont altérés par la mutation de His-60 (site M2) et His-307 (site M1) en résidus d’Ala. Ce protocole peut être hébergé pour étudier d’autres aminopeptidases M42 ou tout métalloenzymes avec un comportement morpheein-like.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13, 137-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://www.ccp4.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen II</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyXtal 15-well tool</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>132007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli PPY strain</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>see reference 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli XL1 blue strain</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Standard</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1511901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litholoops</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine-p-nitroanilide</td>
			<td>Bachem AG</td>
			<td>40010720025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neggia plugin</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>N/A</td>
			<td>visit https://www.dectris.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBAD-TOPO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K430001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www.phenix-online.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Phe</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17014702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Q</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17094705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17104301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima MSB8 strain</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 43589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TmCD00089984</td>
			<td>DNASU Plasmid Repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xdsme</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://github.com/legrandp/xdsme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

Les aminopeptidases M42 forment des complexes fonctionnellement actifs faits de 12 sous-units. Leur processus d’assemblage semble être régulé par leurs cofacteurs d’ions métalliques déclenchant une transition dimer-dodecamer. Lors de la liaison d’ion métallique, plusieurs modifications structurelles se produisent dans le site actif et à l’interface d’interaction, façonnant les dimers pour favoriser l’auto-assemblage. Pour observer de telles modifications, les oligomers stables doivent être isolés avant l’étude structurale. Rapporté ici est une méthode qui permet la purification de dodecamers stables et dimers de TmPep1050, un Aminopeptidase M42 de T. maritima, et leur détermination de la structure par cristallographie aux rayons X. Dimers ont été préparés à partir de dodecamers en enlevant les ions métalliques avec un agent chélateur. Sans leur cofacteur, les dodecamers sont devenus moins stables et ont été entièrement dissociés au chauffage. Les structures oligomériques ont été résolues par l’approche moléculaire simple de remplacement. Pour illustrer la méthodologie, la structure d’une variante tmpep1050, totalement altérée dans la reliure d’ion métallique, est présentée ne montrant aucune autre dégradation des dimers aux monomères.

Pour étudier une dissociation possible du dodécaamer en monomères dans TmPep1050, les codons His-60 et His-307 ont été remplacés par de l’alanine codon à l’aide d’un gène synthétique. Ce gène a ensuite été cloné dans le vecteur pBAD pour l’expression et la purification de la variante tmpep1050 correspondante par la suite nommée TmPep1050H60A H307A. La chromatographie d’exclusion de taille (figure 3B) a prouvé que la protéine purifiée a eu un poids moléc...

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X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Ce protocole a été développé pour étudier la transition dimer-dodecamer de TmPep1050, un Aminopeptidase M42, au niveau structurel. Il s’agit d’un pipeline simple qui part de la purification des protéines au traitement des données aux rayons X. Crystallogenesis, indexation d’ensemble de données, et remplacement moléculaire ont été soulignés par un cas d’étude, TmPep1050H60A H307A variante.

Cristallographie aux rayons X pour étudier la transition oligomérique de l’État de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Ce protocole facilite l’étude des aminopeptidases avec différents états oligomériques et activités oligomerization-dépendantes qui sont équilibrées entre les dimers inactifs et les dodecamers actifs. Cette technique conventionnelle peut être facilement effectuée dans n’importe quel laboratoire. Et en dehors d’exiger l’accès à une ligne de faisceau ou une installation de cristallographie aux rayons X, ne nécessite pas d’appareils spéciaux.Avec une certaine adaptation, cette méthode peut être appliquée à toute autre protéine ayant une activité ou une fonction qui dépend de son degré d’oligomérisation. Pour traiter les données aux rayons X, les utilisateurs doivent avoir une compréhension minimale de la cristallographie. Nous invitons les utilisateurs à suivre des formations, à visiter XDS Wiki et à regarder les tutoriels Phenix.Pour effectuer un test d’activité, ajouter 25 microlitres de 100 mM L-Leucine p-Nitroanilide à 965 microlitres de MOPS de 50 millimlaires, 250 micromolaire cobalt deux chlorure et 10% méthanol Pré incuber le mélange de réaction dans un bain sec de 75 degrés Celsius, avant de diluer l’enzyme à une concentration finale d’un micromolaire avec mops supplémentaire de 50 millimolaires. Ensuite, ajoutez 10 microlitres d’une enzyme micromolaire au mélange de réaction et vortex la solution résultante avant de retourner la réaction au bain sec de 75 degrés Celsius pendant pas plus d’une heure. Lorsque la solution est devenue jaune, arrêter la réaction avec un millilitre d’acide acide à 20% et vortex le mélange avant de lui permettre de refroidir à température ambiante.Ensuite, transférez un aliquot du mélange de réaction à une cellule spectrophotomètre et lisez les absorbants à 410 nanomètres contre un mélange de réaction incubé sans enzyme, comme un contrôle négatif. Pour la préparation de l’apoenzyme, ajouter 10 microlitres de 1, 10-phenanthroline solution de stock à 890 microlitres de 50 millimillons MOPS, 0,5 sulfate d’ammonium molaire et 100 microlitres de TmPep1050 purifié. Vérifiez la perte d’activité à l’aide de l’analyse d’activité telle qu’elle a été démontrée sans ajout de chlorure de cobalt deux.Après l’analyse, transférer l’échantillon dans un tube de dialyse et dialyser l’échantillon contre 200 millilitres de MOPS millimolaire et 0,5 sulfate d’ammonium molaire à quatre degrés Celsius. Échangez le dialyse avec un tampon frais trois fois pendant la dialyse de 48 heures et recueillez l’échantillon du tube de dialyse. À l’aide d’unités de filtration ultra avec une coupure de 30 kilodaltons, concentrez l’échantillon à 100 microlitres et vérifiez la concentration sur un spectrophotomètre à nano volume à 280 nanomètres.Pour préparer les dimers diluer l’apoenzyme à une concentration d’un micromolaire en MOPS millimolaire et 0,5 sulfate d’ammonium molaire, et incuber la réaction pendant deux heures dans un bain sec de 75 degrés Celsius. Concentrez ensuite l’échantillon enzymatique jusqu’à la concentration d’au moins 50 microlitres et vérifiez le poids moléculaire par chromatographie d’exclusion de taille. Pour améliorer la forme, la taille et la cristallinité des cristaux protéiques, ajoutez le volume approprié de solution de cristallisation optimisée à une goutte de cristaux pour porter le volume de gouttelettes de cristal à 10 microlitres.Transférer la gouttelette dans un micro tube de 1,5 millilitre et ajouter 90 microlitres de solution de cristallisation au puits ensemencé. Pour chaque dilution des graines, ajouter 500 microlitres de réagencé de cristallisation par puits au nombre approprié de puits dans une plaque de cristallisation et mélanger deux microlitres d’échantillon protéique avec deux microlitres de rééditant de cristallisation et 0,2 microlitres de graines dans un support de cristallisation par puits. Ensuite, fixez les supports sur chaque puits de réagenage de cristallisation.Pour la cueillette du cristal, remplissez un bain d’azote liquide et plongez les flacons ou paniers utilisés pour la manipulation de l’échantillon dans l’azote. La manipulation de l’azote liquide est dangereuse, elle peut causer de graves engelures. Assurez-vous de porter des protections individuelles appropriées comme des gants cryogéniques et des lunettes de protection.Configurer des boucles de cueillette d’échantillons de différentes tailles en fonction de la taille du cristal et utiliser une jumelle pour sélectionner une goutte contenant des cristaux. Ensuite, utilisez une boucle pour sélectionner délicatement un cristal isolé à partir d’un puits et plonger immédiatement la boucle dans de l’azote liquide avant de placer la boucle dans un flacon approprié. Pour mesurer les intensités ponctuelles de diffraction, créez un dossier à partir duquel XDS sera exécuté et localisez le chemin vers les images.Pour exécuter xdsme, entrez la commande dans une fenêtre terminale. Une fois XDS terminé, vérifiez le fichier lp correct et notez la probabilité de la détermination du groupe spatial, de l’exhaustivité des données, de la résolution la plus élevée, de la mosaïque cristalline et de la qualité des données. Après avoir vérifié le journal inutile XDS pour obtenir la probabilité de groupes spatiaux, utilisez les commandes pour réexécuter xdsme avec différentes solutions de groupe spatial proposées par XDS, dans un dossier séparé pour éviter de passer outre au processus précédent.Après avoir sélectionné la meilleure solution en fonction des statistiques de données, entrez les commandes pour exécuter les XSCALE et XDSCONV. Pour déterminer la phase sans élément de diffusion anormal, utilisez les coordonnées 4P X, Y, pour préparer le modèle de départ pour le remplacement moléculaire. À partir du fichier PDB, utilisez l’éditeur de fichiers Phenix PDB pour extraire le monomère A et tronquer ses acides aminés dans l’alanine.Exécutez X trié avec le fichier de réflexion généré par XDSCONV et la séquence sous forme d’entrées. Vérifiez le fichier journal de Xtriage. Notez l’exhaustivité, le nombre de sous-unités dans l’unité asymétrique, l’anisotropie, la présence d’anneaux de glace et l’événement de jumelage.Pour exécuter Phaser-MR dans Phenix pour le remplacement moléculaire, sélectionnez le fichier de réflexion, la séquence et le modèle 4P six Y de départ tronqué en polyalanine et cliquez sur Exécuter. une fois terminé, vérifiez si un modèle a été trouvé et vérifiez le score du remplacement moléculaire. Un facteur de traduction Z score d’au moins huit, indique que la solution est définitivement correcte.Après avoir déterminé la phase par remplacement moléculaire, sélectionnez Exécuter la construction automatique et cliquez sur Exécuter. Tous les fichiers requis seront automatiquement ajoutés. Une fois terminé, vérifiez le modèle dans COOT et construisez et affinez le modèle manuellement, selon la carte de densité électronique dans COOT.En utilisant ce modèle, la séquence et les données de diffraction comme entrées, affiner le modèle manuellement organisé dans Phenix, se référant à Phenix pour aider à sélectionner la bonne stratégie. Après vérification des résultats, le travail de raffinement libre et de raffinement doit diminuer. Les indicateurs molprobité doivent être respectés et les valeurs aberrantes avec une faible corrélation spatiale réelle doivent être limitées.Lorsque le meilleur modèle raffiné a été généré, exécutez MolProbity sur le serveur et vérifiez toutes les valeurs aberrantes identifiées par le programme. La chromatographie d’exclusion de taille peut être employée pour déterminer le poids moléculaire apparent de la protéine purifiée. L’état de cristallisation du peptide, peut être optimisé en variant le pH par rapport à la concentration peg autour de l’état du dimère.Par exemple, les meilleurs cristaux TmPep1050 H60A H307A, ont été obtenus dans 0,1 citrate de sodium molaire avec un pH de 5,2 et 20%PEG 3350 concentration, après un cycle de micro semis pour améliorer la micro cristallinité. Dans cette analyse, l’indexation des données a montré que le groupe spatial du cristal TmPep1050 H60A H307A était C2221, mais XDS a proposé une autre solution, le groupe spatial MP. La structure de TmPep1050 H60A H307A, pourrait être achevée après plusieurs cycles de raffinement automatisé et manuel.Confirmation de l’état oligomérique avec une surface d’interface de 1 710 angstroms carrés entre les monomères et une énergie libre de formation d’interface de moins 16,2 kilocalories par taupe. Ici, un gros plan du site actif TmPep1050 H60A H307A par rapport au site actif du dimère tmpep1050 et du dodecamer peut être observé. Lors de la construction d’un modèle prendre soin de construire seulement ce que vous voyez dans la densité des électrons pour éviter une surinterprétation, les données, et de prendre le temps de polir votre modèle.Le poids moléculaire du dimère et du dodécaamer peut également être déterminé par spectrométrie de masse indigène. Et les méthodes peuvent être utiles pour détecter les oligomers de transition.

Research

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Biochemistry

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

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