Name: x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00
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Wir danken Martine Roovers für das Korrekturlesen dieses Papiers und die konstruktiven Kommentare. Der Zugang zu Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) erfolgte innerhalb der Block Allocation Groups 20151139.

1. Herstellung und Reinigung des rekombinanten TmPep1050
HINWEIS: Im Folgenden werden das Klonverfahren und die Reinigung des Wildtyps TmPep1050 beschrieben, der an eine frühere Studie angepasst wurde11. Alternativ kann das Klonen mit einem synthetischen Gen erfolgen. Um TmPep1050-Varianten zu generieren, kann eine standortgesteuerte Mutagenese beispielsweise nach den Single-Primer-Reaktionen in der Parallelprotokollmethode (SPRINP)30durchgeführt...

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht das Verständnis des Dimer-Dodedecamer-Übergangs von TmPep1050 auf struktureller Ebene. Die Methodik wurde bereits bei der Bestimmung der Struktur der beiden TmPep1050 Oligomere11erlebt. Der schwierigste Schritt bestand darin, Bedingungen zu finden, die die Dissoziation von Dodecamern in stabile Dimer fördern. Solche Bedingungen mussten mild genug sein, um die Wiedervereinigung von Dimern in Dodecameer zu ermöglichen, wenn der Metallionenkofaktor hinz...

Oligomerisierung ist ein vorherrschender Prozess, der die biologischen Funktionen vieler Proteine diktiert. In Escherichia coliwerden nur 35% der Proteine monomer1. Einige Proteine, morpheeins genannt, können sogar mehrere oligomere Zustände mit Untereinheiten mit unterschiedlicher Struktur in jedem oligomeren Zustand annehmen2. Der Übergang zwischen ihren oligomeren Zuständen ist oft ein Mittel, um die Proteinaktivität zu regulieren, da jeder oligomere Zustand eine andere spezifische Aktivität oder Funktion haben kann. Mehrere Beispiele für Morpheeins sind in der Literatur gut dokumentiert, insbesondere die Porphobilinogen-Synthase3, HPr Kinase/Phosphatase4, Lon Protease5, Lactat-Dehydrogenase6, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase7, Pyruvatkinase8, Citratsynthase9und Ribonuclease A10. Kürzlich beschrieben wir die M42-Aminopeptidase TmPep1050, ein weiteres Beispiel für Enzym mit morpheeinähnlichem Verhalten, dessen Aktivität von seinen oligomeren Zuständenabhängt 11. Der Übergang zwischen seinen oligomeren Zuständen wird durch seine metallischen Kofaktoren vermittelt, die mehrere strukturelle Modifikationen der Untereinheiten induzieren.
Die M42 Aminopeptidase Familie gehört zum MH-Clan12,13, und ist weit verbreitet unter Bakterien und Archaea14. Die M42-Aminopeptidase sind echte denukleare Enzyme, die Peptide bis zu 35 Aminosäurerückstände in der Länge15abbauen. Sie nehmen eine eigentümliche tetraederförmige Struktur aus 12 Untereinheiten an, deren aktive Stellen auf eine innere Höhle ausgerichtet sind. Eine solche Anordnung wird oft als nano-kompartalisierung der Aktivität beschrieben, um eine unkontrollierte Proteolyse zu vermeiden. Die physiologische Funktion der M42-Aminopeptidasen kann mit den proteasom, hydrolysierenden Peptiden in Folge des Proteinabbaus16,17in Verbindung gebracht werden. Pyrococcus horikoshii besitzt vier M42-Aminopeptidasen, die jeweils unterschiedliche, aber komplementäre Besonderheiten18,19,20,21präsentieren. Singuläre, Heterokomplexe aus zwei verschiedenen Arten von Untereinheiten wurden in P. horikoshiibeschrieben, was auf die Existenz von Peptidasom-Komplexen22,23hindeutet.
Mehrere Strukturen von M42 Aminopeptidasen wurden in der Literatur beschrieben11,16,18,19,20,24,25,26. Die Untereinheit besteht aus zwei unterschiedlichen Domänen, einer katalytischen Domäne und einer Dimerisierungsdomäne. Die katalytische Domäne nimmt eine gemeinsame α/β Falte an, die im gesamten MH-Clan konserviert wird, wobei die archetypische katalytische Domäne die Aminopeptidase Ap1 von Vibrio proteolyticus27ist. Die Dimerisierungsdomäne nimmt eine PDZ-ähnliche Falte16 an und kann neben ihrer Rolle bei der Oligomerisierung eine Rolle bei der Steuerung des Substratzugangs und der Bindung in der inneren Kavität11spielen. Da der Grundbaustein ein Dimer ist, wird der Dodedekadaner oft als die Assoziation von sechs Dimeren beschrieben, wobei jeder Dimer an jeder Kante des Tetraeders16positioniert wird. Die Oligomerisierung der M42-Aminopeptidase beruht auf der Verfügbarkeit ihrer Metallkofaktoren. Divalente Metallionen, oft Zn2+ und Co2+,sind katalytisch an der Peptidbindung und Hydrolyse beteiligt. Sie befinden sich in zwei unterschiedlichen Bindungsstellen, nämlich M1- und M2-Sites. Die beiden Metallionen treiben und stimmen auch die Oligomerisierung an, wie sie für PhTET2, PhTET3, PfTET3 und TmPep105011,24,28,29demonstriert wurde. Wenn die Metallkofaktoren erschöpft sind, zerlegt sich der Dodecamer in Dimer, wie in PhTET2, PhTET3 und TmPep105011,16,28oder sogar Monomeren, wie in PhTET2 und PfTET324,29.
Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der Strukturen von TmPep1050-Oligomeren vorgestellt. Dieses Protokoll ist eine Reihe von gängigen Methoden einschließlich Proteinreinigung, proteolytische Aktivität Screening, Kristallisation, Röntgenbeugung, und molekularen Ersatz. Subtilitäten im Umgang mit Metalloenzymen, Proteinoligomerisierung, Proteinkristallisation und molekularem Ersatz werden betont. Ein Fall der Studie wird auch vorgestellt, um zu zeigen, ob TmPep1050 Dodecamer sich weiter in Monomere dissoziieren können oder nicht. Um diese Frage zu beantworten, wurde eine TmPep1050-Variante, TmPep1050H60A H307A, untersucht, deren Metallbindungsstellen durch Mutation seiner-60 (M2-Site) und His-307 (M1-Site) zu Ala-Rückständen beeinträchtigt werden. Dieses Protokoll kann aufgenommen werden, um andere M42-Aminopeptidase oder Metalloenzyme mit Morpheein-ähnlichem Verhalten zu untersuchen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13, 137-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://www.ccp4.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen II</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyXtal 15-well tool</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>132007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli PPY strain</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>see reference 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli XL1 blue strain</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Standard</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1511901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litholoops</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine-p-nitroanilide</td>
			<td>Bachem AG</td>
			<td>40010720025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neggia plugin</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>N/A</td>
			<td>visit https://www.dectris.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBAD-TOPO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K430001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www.phenix-online.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Phe</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17014702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Q</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17094705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17104301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima MSB8 strain</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 43589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TmCD00089984</td>
			<td>DNASU Plasmid Repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xdsme</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://github.com/legrandp/xdsme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

Die M42-Aminopeptidasen bilden funktionell aktive Komplexe aus 12 Untereinheiten. Ihr Montageprozess scheint durch ihre Metallionenkofaktoren geregelt zu sein, die einen Dimer-Dodecamer-Übergang auslösen. Bei der Metallionenbindung treten mehrere strukturelle Modifikationen am aktiven Standort und an der Interaktionsschnittstelle auf, die Drücker formen, um die Selbstmontage zu fördern. Um solche Veränderungen zu beobachten, müssen stabile Oligomere vor der Strukturuntersuchung isoliert werden. Hier wird eine Methode berichtet, die die Reinigung von stabilen Dodecamern und Dimern von TmPep1050, einer M42-Aminopeptidase von T. maritima, und deren Strukturbestimmung durch Röntgenkristallographie ermöglicht. Dimere wurden von Dodecamern hergestellt, indem Metallionen mit einem Chelatbildner entfernt wurden. Ohne ihren Cofaktor wurden die Dodecameer weniger stabil und wurden beim Erhitzen vollständig distanziert. Die oligomeren Strukturen wurden durch den einfachen molekularen Ersatzansatz gelöst. Zur Veranschaulichung der Methodik wird die Struktur einer TmPep1050-Variante, die in der Metallionenbindung völlig beeinträchtigt ist, dargestellt, die keine weitere Aufschlüsselung von Dimern zu Monomeren zeigt.

Um eine mögliche Dodecamer-Dissoziation in Monomere in TmPep1050 zu untersuchen, wurden die His-60 und His-307 Codons durch Alanin-Codon mit einem synthetischen Gen ersetzt. Dieses Gen wurde dann im pBAD-Vektor zur Expression und Reinigung der entsprechenden TmPep1050-Variante mit dem anschließenden Namen TmPep1050H60A H307Ageklont. Die Größenausschlusschromatographie (Abbildung 3B) zeigte, dass das gereinigte Protein ein scheinbares Molekulargewicht von 56 kDa hatte (Molekula...

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X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um den Dimer-Dodecamer-Übergang von TmPep1050, einer M42-Aminopeptidase, auf struktureller Ebene zu untersuchen. Es ist eine einfache Pipeline, die von der Proteinreinigung bis zur Röntgendatenverarbeitung reicht. Crystallogenese, Datensatzindexierung und molekularer Ersatz wurden durch einen Studienfall, TmPep1050H60A H307A Variante, betont.

Röntgenkristallographie zur Untersuchung des oligomeren Zustandsübergangs der Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Dieses Protokoll erleichtert die Untersuchung von Aminopeptidasen mit verschiedenen oligomeren Zuständen und oligomerisierungsabhängigen Aktivitäten, die zwischen inaktiven Dimern und aktiven Dodecamern ausgeglichen sind. Diese herkömmliche Technik kann leicht in jedem Labor durchgeführt werden. Abgesehen davon, dass der Zugang zu einer Beamline- oder Röntgenkristallographie-Anlage erforderlich ist, sind keine speziellen Geräte erforderlich.Mit einer gewissen Anpassung kann diese Methode auf jedes andere Protein mit einer Aktivität oder Funktion angewendet werden, die vom Grad der Oligomerisierung abhängt. Um die Röntgendaten verarbeiten zu können, müssen Benutzer über ein minimales Verständnis der Kristallographie verfügen. Wir laden Benutzer ein, Schulungen zu verfolgen, XDS Wiki zu besuchen und Phenix-Tutorials zu sehen.Um einen Aktivitätstest durchzuführen, fügen Sie 25 Mikroliter 100 mM L-Leucin p-Nitroanilid zu 965 Mikroliter50 Millimolar MOPS, 250 Mikromolar Kobalt zwei Chlorid und 10% Methanol Vor inkubieren sie die Reaktionsmischung in einem 75 Grad Celsius trockenen Bad, bevor das Enzym zu einer einmikromollaren Endkonzentration mit zusätzlichen 50 Millimolar MOPS verdünnt wird. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter eines Mikromolaren-Enzyms in den Reaktionsmix und Wirbel die resultierende Lösung, bevor Sie die Reaktion auf das 75 Grad Celsius trockene Bad für nicht mehr als eine Stunde. Wenn die Lösung gelb geworden ist, stoppen Sie die Reaktion mit einem Milliliter 20%Saursäure und wirbeln Sie das Gemisch, bevor Sie es auf Raumtemperatur abkühlen lassen.Dann übertragen Sie ein Aliquot des Reaktionsmixes auf eine Spektralphotometerzelle und lesen Sie die Absorber bei 410 Nanometern gegen einen inkubierten Reaktionsmix ohne Enzym, als Negativkontrolle. Zur Apoenzym-Präparation 10 Mikroliter 1, 10-Phenanthroline-Stammlösung zu 890 Mikroliter50 Millimolar MOPS, 0,5 Molaren-Ammoniumsulfat und 100 Mikroliter gereinigtem TmPep1050 hinzufügen. Überprüfen Sie den Aktivitätsverlust mit dem Aktivitätstest, wie gezeigt, ohne die Zugabe von Kobalt zwei Chlorid.Nach dem Test die Probe in ein Dialyserohr geben und die Probe gegen 200 Milliliter 50 Millimolar MOPS und 0,5 Molar-Ammoniumsulfat bei vier Grad Celsius dialysieren. Das Dialysat während der 48-stunden-Dialyse dreimal mit frischem Puffer tauschen und Proben aus dem Dialyserohr sammeln. Mit Hilfe von Ultrafiltrationseinheiten mit einem 30-Kilodalton-Cutoff konzentrieren Sie die Probe wieder auf 100 Mikroliter und überprüfen Sie die Konzentration auf einem Nanovolumenspektrophotometer auf 280 Nanometer.Um die Dimere vorzubereiten, verdünnen Sie das Apoenzym in 50 Millimolar MOPS und 0,5 Molar-Ammoniumsulfat auf eine mikromolare Konzentration und inkubieren Sie die Reaktion für zwei Stunden in einem 75 Grad Celsius trockenen Bad. Konzentrieren Sie dann die Enzymprobe auf mindestens 50 Mikroliter Konzentration und überprüfen Sie das Molekulargewicht durch Größenausschlusschromatographie. Um die Form, Größe und Kristallinität der Proteinkristalle zu verbessern, fügen Sie das entsprechende Volumen der optimierten Kristallisationslösung zu einem Tropfen Kristalle hinzu, um das Kristalltröpfchenvolumen auf 10 Mikroliter zu bringen.Übertragen Sie das Tröpfchen auf ein 1,5 Milliliter Mikrorohr und fügen Sie dem ausgesäten Brunnen 90 weitere Mikroliter Kristallisationslösung hinzu. Für jede Samenverdünnung 500 Mikroliter Kristallisationsreagenz pro Brunnen in die entsprechende Anzahl von Brunnen in einer Kristallisationsplatte geben und zwei Mikroliter Proteinprobe mit zwei Mikroliter Kristallisationsreagenz und 0,2 Mikroliter Samen in einer Kristallisationsunterstützung pro Brunnen mischen. Befestigen Sie dann die Stützen an jedem Brunnen des Kristallisationsreagenzes.Für die Kristallkommissionierung ein Bad mit flüssigem Stickstoff füllen und alle Fläschchen oder Korb, die für die Probenhandhabung verwendet werden, in den Stickstoff tauchen. Der Umgang mit flüssigem Stickstoff ist gefährlich, es kann zu starken Frostbissen führen. Achten Sie darauf, den richtigen individuellen Schutz wie kryogene Handschuhe und Schutzbrille zu tragen.Richten Sie Probenaufnahmeschlaufen unterschiedlicher Größe entsprechend der Kristallgröße ein und wählen Sie mit einem Fernglas einen Tropfen aus, der Kristalle enthält. Dann verwenden Sie eine Schleife, um vorsichtig einen isolierten Kristall aus einem Brunnen auszuwählen und sofort die Schleife in flüssigen Stickstoff zu tauchen, bevor Sie die Schleife in eine geeignete Durchstechflasche legen. Um die Beugungspunktintensitäten zu messen, erstellen Sie einen Ordner, aus dem XDS ausgeführt wird, und suchen Sie den Pfad zu den Bildern.Um xdsme auszuführen, geben Sie den Befehl in ein Terminalfenster ein. Nachdem XDS den Auftrag beendet hat, überprüfen Sie die richtige lp-Datei und notieren Sie sich die Wahrscheinlichkeit der Raumgruppenbestimmung, Datenvollständigkeit, höchste Auflösung, Kristallmosaik und Datenqualität. Nachdem Sie das xDS-Protokoll ohne Punkt überprüft haben, um die Wahrscheinlichkeit von Speicherplatzgruppen zu erhalten, verwenden Sie die Befehle, um xdsme mit verschiedenen von XDS vorgeschlagenen Raumgruppenlösungen in einem separaten Ordner erneut auszuführen, um ein Überschreiben des vorherigen Prozesses zu vermeiden.Nachdem Sie die beste Lösung basierend auf den Datenstatistiken ausgewählt haben, geben Sie die Befehle ein, um XSCALE und XDSCONV auszuführen. Um die Phase ohne anomale Streuung zu bestimmen, verwenden Sie 4P X, Y-Koordinaten, um das Startmodell für den molekularen Ersatz vorzubereiten. Aus der PDB-Datei, verwenden Sie die Phenix PDB-Datei-Editor, um die A-Monomer zu extrahieren und seine Aminosäuren in Alanin zu reduzieren.Führen Sie X triaged mit der von XDSCONV generierten Reflektionsdatei und der Sequenz als Eingänge aus. Überprüfen Sie die Protokolldatei von Xtriage. Beachten Sie die Vollständigkeit, die Anzahl der Untereinheiten in der asymmetrischen Einheit, die Anisotropie, das Vorhandensein von Eisringen und das Twinning-Vorkommen.Um Phaser-MR in Phenix für den molekularen Ersatz auszuführen, wählen Sie die Reflexionsdatei, die Sequenz und das Startmodell 4P sechs Y in Polyalanin abgeschnitten aus und klicken Sie auf Ausführen. überprüfen Sie nach Abschluss, ob ein Modell gefunden wurde, und überprüfen Sie die Punktzahl des molekularen Ersatzes. Ein Übersetzungsfaktor Z-Score von mindestens acht gibt an, dass die Lösung definitiv korrekt ist.Nachdem Sie die Phase durch molekularen Austausch bestimmt haben, wählen Sie Auto Build ausführen aus, und klicken Sie auf Ausführen. Alle erforderlichen Dateien werden automatisch hinzugefügt. Überprüfen Sie nach Abschluss des Modells in COOT und erstellen und verfeinern Sie das Modell manuell gemäß der Elektronendichtekarte in COOT.Mit diesem Modell, die Sequenz und die Beugungsdaten als Eingaben, verfeinern Sie das manuell kuratierte Modell in Phenix, unter Bezugnahme auf Phenix, um die richtige Strategie zu wählen. Nach der Verfeinerung überprüfen Sie die Ergebnisse, Verfeinerungfrei und Verfeinerung smüssen abnehmen. MolProbity-Indikatoren müssen respektiert werden und Ausreißer mit geringer realer Raumkorrelation, müssen begrenzt werden.Wenn das am besten verfeinerte Modell generiert wurde, führen Sie MolProbity auf dem Server aus und überprüfen Sie alle vom Programm identifizierten Ausreißer. Größenausschlusschromatographie kann verwendet werden, um das scheinbare Molekulargewicht des gereinigten Proteins zu bestimmen. Der Kristallisationszustand des Peptids kann optimiert werden, indem der pH-Wert im Vergleich zur PEG-Konzentration um den Zustand des Dimers variiert wird.Zum Beispiel wurden die besten TmPep1050 H60A H307A Kristalle in 0,1 molaren Natriumcitrat mit einem pH-Wert von 5,2 und 20%PEG 3350 Konzentration, nach einem Zyklus der Mikrosaat, um die Mikrokristallinität zu verbessern erhalten. In dieser Analyse zeigte die Datenindizierung, dass die Raumgruppe des TmPep1050 H60A H307A Kristalls C2221 war, aber XDS schlug eine andere Lösung vor, die MP-Raumgruppe. Die Struktur des TmPep1050 H60A H307A konnte nach mehreren Zyklen der automatisierten und manuellen Veredelung abgeschlossen werden.Bestätigung des oligomeren Zustands mit einer Grenzfläche von 1. 710 quadratischen Angstroms zwischen beiden Monomeren und einer freien Energie der Grenzflächenbildung von minus 16,2 Kilokalorien pro Mol. Hier kann eine Nahaufnahme der aktiven Fundstelle TmPep1050 H60A H307A im Vergleich zur aktiven Stelle des Dimers und Dodedesamers TmPep1050 beobachtet werden. Achten Sie beim Erstellen eines Modells darauf, nur das zu erstellen, was Sie in der Elektronendichte sehen, um eine Überinterpretation der Daten zu vermeiden und sich die Zeit zu nehmen, Ihr Modell zu polieren.Das Molekulargewicht von Dimer und Dodecamer kann auch durch native Massenspektrometrie bestimmt werden. Und die Methoden können nützlich sein, um Übergangsoligomere zu erkennen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Herstellung und Lieferung von Protein Microcrystals in Lipidische Cubic Phase für Serial Femtosekunden Kristallographie

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Forschung

Biochemie

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Kombination von Röntgen-Kristallographie mit kleinen Winkel Röntgenstreuung, unstrukturierte Regionen der Nsa1 aus S. Cerevisiae zu modellieren

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle Studien von Makromolekülen in Lösung mit kleinen Winkel Röntgenstreuung

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Ein All-in-One-Probenhalter für makromolekulare Röntgenkristallographie mit minimaler Hintergrundstreuung

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Zellkultur auf Siliziumnitridmembranen und Kryovorbereitung für Synchrotron-Röntgenfluoreszenz Nano-Analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening auf Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitoren

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimierung des Wachstums von Endothiapepsin-Kristallen für serielle Kristallographie-Experimente

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

Die automatisierten Kristallographie-Pipelines in der EMBL HTX-Anlage in Grenoble

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...