Name: x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

אנו מודים למרטין רובר על הגהה של המאמר הזה ועל מתן הערות מועילות. הגישה לקו הקרן של Proxima 2 (SOLEIL synchrotron) הייתה בתוך קבוצות הקצאת בלוקים 20151139.

1. ייצור וטיהור של TmPep1050 רקומביננטי
הערה: להלן מתוארים הליך השיבוט וטיהור של TmPep1050 מסוג פראי מותאם ממחקרקודם 11. לחלופין, ניתן לעשות את השיבוט באמצעות גן סינתטי. כדי ליצור גרסאות TmPep1050, אתר בבימויו mutagenesis ניתן לבצע בעקבות, למשל, תגובות פריימר יחיד בשיטה פרוטוקול מקבי...

הפרוטוקול המתואר בזאת מאפשר הבנת המעבר של דמר-dodecamer של TmPep1050 ברמה המבנית. המתודולוגיה מנוסה בעבר לקביעת המבנה של שני TmPep1050 אוליגומרים11. הצעד המאתגר ביותר היה למצוא תנאים המקדמים את הניתקות של dodecamers לעמומים יציבים. תנאים כאלה היו צריכים להיות קלים מספיק כדי לאפשר שיוך מחדש של ד?...

אוליגומרציה היא תהליך דומיננטי המכתיב את הפונקציות הביולוגיות של חלבונים רבים. ב Escherichia קולי, ההערכה היא כי רק 35% של חלבונים הם מונומריים1. חלבונים מסוימים, הנקראים מורפיינים, יכולים אפילו לאמץ מספר מצבים אוליגומריים עם יחידות משנה בעל מבנה נפרד בכל מצב אוליגומרי2. המעבר בין מצבם האוליגומרי הוא לעתים קרובות מתכוון לווסת את פעילות החלבון כמו כל מצב אוליגומרי עשוי להיות פעילות או פונקציה ספציפית שונה. מספר דוגמאות למורפיין תועדו היטב בספרות, במיוחד את סינתאזפורפובילינוגן 3, HPr קינאז/פוספטאז4, פרוטאזלון 5, להקטאט דהידג'נאז6, גליצרלדהיד-3-פוספט דהידג'נאז7, פירווט קינאז8, סינתזיטציטראט 9, וריבנוקלאז A10. לאחרונה, תיארנו M42 aminopeptidase TmPep1050, דוגמה נוספת של אנזים עם התנהגות כמו מורפיין, שפעילותו תלויה במצבים האוליגומרייםשלה 11. המעבר בין המדינות האוליגומריות שלה מתווכת על ידי הגורמים המתכתיים שלה, מה שגורמים למספר שינויים מבניים של יחידות המשנה.
משפחת M42 aminopeptidase שייכת לשבט MH12,13, והיא מחולקת באופן נרחב בקרב חיידקים וארכאה14. M42 aminopeptidases הם אנזימים די-גרעין אמיתיים משפיל פפטידים עד 35 שאריות חומצת אמינובאורך 15. הם מאמצים מבנה מוזר בצורת טטריהדרון עשוי מ-12 יחידות משנה עם האתרים הפעילים שלהם הכיוון לחלל הפנימי. הסדר כזה מתואר לעתים קרובות בשם ננו-מידור של הפעילות כדי למנוע פרוטאוליזה בלתי מבוקרת. הפונקציה הפיזיולוגית של M42 aminopeptidases עשוי להיות קשור פרוטאזום, פפטידים הידרוליזההנובעים מירידהבחלבון 16,17. Pyrococcus horikoshii בעל ארבעה M42 aminopeptidases, כל אחד מציג ייחודי אך משליםפרטים 18,19,20,21. באופן ייחודי, תסביכות הטרוסקסואליות המורכבות משני סוגים שונים של יחידות משנה תוארו בפ. horikoshii, מה שמצביע על קיומם שלמתחמים פפטידים 22,23.
בספרות תוארו מספר מבנים של M42 aminopeptidases11,16,18,19,20,24,25,26. תחום המשנה מורכב משני תחומים נפרדים, קבוצת מחשבים קתטית ותחום דימיטים. התחום הקתליטי מאמץ פיפול α/β משותף שנצמר בכל שבט MH, התחום הקטליטי הארכיטיפי הוא ה-Ap1 של Vibrio proteolyticus27. תחום dimerization מאמצת קיפול PDZ כמו16 ואולי יש, בנוסף לתפקידה oligomerization, תפקיד בשליטה על גישה למצע ואיגוד בחלל הפנימי11. מכיוון שאבן הבניין הבסיסית היא עמומה יותר, מתואר ה-dodecamer לעתים קרובות כשיוך של שישה דימרים, שכל אחד מהם ממוקם בכל קצה של טטרהדרון16. אוליגומרציה של M42 aminopeptidases מסתמך על הזמינות של cofactors מתכת שלה. יונים מתכת Divalent, לעתים קרובות Zn2+ ו Co2+, מעורבים באופן קטליטי בכריכת פפטיד והידרוליזה. הם נמצאים בשני אתרי איגוד נפרדים, כלשהם אתרי M1 ו-M2. שני יונים מתכת גם לנהוג ולכוונן היטב את oligomerization כפי שהוכח עבור PhTET2, PhTET3, PfTET3, ו TmPep105011,24,28,29. כאשר cofactors מתכת מתרוקן, dodecamer מתפרק לתוך dimers, כמו PhTET2, PhTET3, ו TmPep105011,16,28,או אפילו מונומרים, כמו PhTET2 ו PfTET324,29.
מוצג כאן פרוטוקול המשמש לחקר המבנים של TmPep1050 אוליגומרים. פרוטוקול זה הוא קבוצה של שיטות נפוצות כולל טיהור חלבונים, הקרנת פעילות פרוטאוליטית, התגבשות, מפזר רנטגן, והחלפת מולקולרית. הדקויות הטמונות בהתמודדות עם מטאלואנזימים, אוליגומריזציה של חלבונים, התגבשות חלבונים והחלפת מולקולרית מודגשות. מקרה של מחקר מוצג גם כדי להראות אם TmPep1050 dodecamers עשויים עוד יותר לנתק לתוך מונומרים או לא. כדי לטפל בשאלה זו, גרסה TmPep1050, TmPep1050H60A H307A, נחקרה שאתרי כריכת המתכת שלהם נפגעים על ידי מוטציה שלו-60 (אתר M2) ו His-307 (אתר M1) כדי Ala שאריות. פרוטוקול זה עשוי להיות מתאים ללמוד aminopeptidases M42 אחרים או כל מטאלואנזימים עם התנהגות כמו מורפיין.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13, 137-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://www.ccp4.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen II</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyXtal 15-well tool</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>132007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli PPY strain</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>see reference 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli XL1 blue strain</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Standard</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1511901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litholoops</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine-p-nitroanilide</td>
			<td>Bachem AG</td>
			<td>40010720025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neggia plugin</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>N/A</td>
			<td>visit https://www.dectris.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBAD-TOPO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K430001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www.phenix-online.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Phe</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17014702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Q</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17094705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17104301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima MSB8 strain</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 43589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TmCD00089984</td>
			<td>DNASU Plasmid Repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xdsme</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://github.com/legrandp/xdsme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

M42 aminopeptidases יוצרים מתחמים פעילים מבחינה פונקציונלית המורכבים מ-12 יחידות משנה. נראה שתהליך ההרכבה שלהם מוסדר על ידי התורמים היונים המתכתיים שלהם, מה שמפעיל מעבר של דימר-דוקאמר. עם כריכת יון מתכת, מספר שינויים מבניים מתרחשים באתר הפעיל ובממשק האינטראקציה, מעצבים עמעום לקידום ההרכבה העצמית. כדי לצפות בשינויים כאלה, אוליגומרים יציבים חייבים להיות מבודדים לפני מחקר מבני. דווח כאן היא שיטה המאפשרת טיהור של dodecamers יציבים ועמומים של TmPep1050, M42 aminopeptidase של T. maritima, ואת קביעת המבנה שלהם על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. דימרים הוכנו מ-dodecamers על ידי הסרת יונים מתכת עם סוכן chelating. ללא קופקטור שלהם, dodecamers הפך פחות יציב ונתק לחלוטין עם החימום. המבנים האוליגומריים נפתרו על ידי גישת ההחלפה המולקולרית הפשוטה. כדי להמחיש את המתודולוגיה, המבנה של גרסה TmPep1050, פגום לחלוטין בכריכת יון מתכת, מוצג לא מראה פירוט נוסף של dimers מונומרים.

כדי ללמוד ניתק dodecamer אפשרי לתוך מונומרים ב TmPep1050, שלו-60 ו שלו-307 codons הוחלפו על ידי אלנין קודון באמצעות גן סינתטי. גן זה שוכפל לאחר מכן בוקטור pBAD עבור ביטוי וטיהור של המשתנה המתאים TmPep1050 לאחר מכן בשם TmPep1050H60A H307A. הכרומטוגרפיה שלהחרגת גודל (איור 3B)הראתה כי לחלבון המטוהר היה ?...

Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

פרוטוקול זה פותח כדי ללמוד את המעבר dimer-dodecamer של TmPep1050, M42 aminopeptidase, ברמה המבנית. זהו צינור פשוט החל מטיהור חלבונים לעיבוד נתוני רנטגן. Crystallogenesis, אינדקס סט נתונים, והחלפה מולקולרית הודגמו באמצעות מקרה של מחקר, TmPep1050H60A H307A משתנה.

קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

פרוטוקול זה מקל על המחקר של aminopeptidases עם מצבים אוליגומריים שונים ופעילויות תלויות אוליגומריזציה מאוזנות בין עמעום לא פעיל דודקאמרים פעילים. טכניקה קונבנציונלית זו יכולה להתבצע בקלות בכל מעבדה. ומלבד הצורך בגישה למתקן קריסטלוגרפיה של קורות או קרני רנטגן, אינו דורש התקנים מיוחדים.עם הסתגלות מסוימת, שיטה זו עשויה להיות מיושמת על כל חלבון אחר עם פעילות או פונקציה התלויה במידה של אוליגומריזציה. כדי לעבד את נתוני הרנטגן, למשתמשים חייבת להיות הבנה מינימלית של קריסטלוגרפיה. אנו מזמינים את המשתמשים לעקוב אחר הדרכות, לבקר ב- XDS Wiki ולצפות בערכות לימוד של Phenix.כדי לבצע בדיקת פעילות, להוסיף 25 microliters של 100 mM L-לאוצין p-Nitroanilide ל 965 microliters של 50 מילימולרים MOPS, 250 micromolar קובלט שני כלוריד ו 10% מתנול Pre דגירה תערובת התגובה באמבטיה יבשה 75 מעלות צלזיוס, לפני דילול האנזים לריכוז סופי micromolar אחד עם 50 מילימולים נוספים MOPS. לאחר מכן, מוסיפים 10 מיקרוליטרים של אנזים מיקרומולרי אחד לתערובת התגובה והמערבולת את הפתרון שנוצר לפני החזרת התגובה לאמבטיה היבשה של 75 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משעה. כאשר הפתרון הפך צהוב, לעצור את התגובה עם מיליליטר אחד של 20% חומצה חומצית מערבולת את התערובת לפני המאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.לאחר מכן להעביר aliquot של תערובת התגובה לתא ספקטרופוטומטר ולקרוא את סופגים ב 410 ננומטר נגד תערובת תגובה דגירה ללא אנזים, כשליטה שלילית. להכנת אפואנזים, להוסיף 10 microliters של 1, 10-phenanthroline פתרון מלאי 890 microliters של 50 מילימולרית MOPS, 0.5 אמוניום גופרתי טוחה ו 100 microliters של TmPep1050 מטוהרים. בדוק את אובדן הפעילות באמצעות בדיקת הפעילות כפי שהוכח ללא תוספת של קובלט שני כלוריד.לאחר ההקפאה, להעביר את המדגם לתוך צינור דיאליזה להדיאליזה המדגם נגד 200 מיליליטר של 50 מילימולרים MOPS ו 0.5 אמוניום גופרתי טוחה בארבע מעלות צלזיוס. החלף את הדיאליזה עם חיץ טרי שלוש פעמים במהלך הדיאליזה 48 שעות ולאסוף מדגם מצינור הדיאליזה. באמצעות יחידות סינון אולטרה עם ניתוק 30 קילודאלטון, לרכז את המדגם בחזרה 100 microliters ולבדוק את הריכוז על ספקטרופוטומטר נפח ננו ב 280 ננומטר.כדי להכין את dimers לדלל את האפואנזים לריכוז micromolar אחד ב 50 מילימולרי MOPS ו 0.5 אמוניום גופרתי טוחן, ולהדקיר את התגובה במשך שעתיים באמבטיה יבשה 75 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לרכז את דגימת האנזים כאשר לפחות 50 ריכוז microliter ולבדוק את המשקל המולקולרי לפי גודל הדרת כרומטוגרפיה. כדי לשפר את הצורה, הגודל והקריסטליות של גבישי החלבון, הוסיפו את הנפח המתאים של פתרון התגבשות ממוטב לירידה בגבישים כדי להביא את נפח טיפת הגביש ל-10 מיקרוליטרים.מעבירים את טיפת צינור 1.5 מיליליטר מיקרו ולהוסיף 90 microliters יותר של פתרון התגבשות לזרע היטב. עבור כל דילול זרעים, יש להוסיף 500 מיקרוליטרים של רגנט התגבשות לאורך כל באר למספר בארות המתאים בצלחת התגבשות ולערבב שני מיקרוליטרים של דגימת חלבון עם שני מיקרוליטרים של רייגנט התגבשות ו-0.2 מיקרוליטרים של זרעים בתמיכה אחת של התגבשות לאורך כל באר. ואז לתקן את התומכים על כל באר של reagent התגבשות.לקטוף קריסטל, למלא אמבטיה עם חנקן נוזלי לצלול כל בקבוקונים או סל המשמש לטיפול מדגם לתוך החנקן. טיפול בחנקן נוזלי מסוכן זה יכול לגרום לכוויות קור חמורות. הקפד ללבוש הגנות אישיות נאותות כמו כפפות קריוגניים ומנועי עיניים מגן.הגדר לולאות איסוף לדוגמה בגדלים שונים בהתאם לגודל הגביש ולהשתמש במשקפת כדי לבחור טיפה המכילה גבישים. לאחר מכן השתמש בלולאה כדי לבחור בעדינות גביש מבודד מ באר אחת ומיד לצלול את הלולאה בחנקן נוזלי לפני הצבת הלולאה בקבוקון מתאים. למדידת מידות נקודתיות של דיפוזיה, צרו תיקייה שממנה יופעל XDS ואתרו את הנתיב לתמונות.כדי להפעיל xdsme, הזן את הפקודה בחלון מסוף. לאחר XDS סיים את המשימה לבדוק את קובץ lp הנכון לציין את ההסתברות של קביעת קבוצת החלל, שלמות נתונים, הרזולוציה הגבוהה ביותר, פסיפס גביש ואיכות נתונים. לאחר בדיקת יומן XDS חסר טעם כדי להשיג את הסבירות של קבוצות רווח, השתמש בפקודות כדי להדק את xdsme עם פתרונות שונים של קבוצת חלל המוצעים על-ידי XDS, בתיקיה נפרדת כדי למנוע דריסת התהליך הקודם.לאחר בחירת הפתרון הטוב ביותר בהתבסס על סטטיסטיקת הנתונים, הזן את הפקודות להפעלת XSCALE ו- XDSCONV. כדי לקבוע את השלב ללא פריט פיזור חריג, השתמש בקואורדינטות 4P X, Y, כדי להכין את המודל ההתחלתי להחלפה מולקולרית. מקובץ PDB, השתמש בעורך הקבצים PDB Phenix כדי לחלץ את מונומר A כדי לחתוך חומצות האמינו שלה אלנין.הפעל X עם קובץ ההשתקפות שנוצר על-ידי XDSCONV והרצף כקלט. בדוק את קובץ יומן הרישום מ- Xtriage. שים לב להשלמות, למספר יחידות המשנה ביחידה האסימטרית, לאניסוטרופיה, לנוכחות טבעות הקרח ולמופע התאומים.כדי להפעיל את Phaser-MR בפניקס להחלפה מולקולרית, בחר את קובץ ההשתקפות, את הרצף ואת מודל 4P six Y ההתחלתי נחתך בפוליאלנין ולחץ על הפעל. עם השלמת, לבדוק אם המודל נמצא ולבדוק את הציון של ההחלפה המולקולרית. ציון Z גורם תרגום של לפחות שמונה, מציין כי הפתרון הוא בהחלט נכון.לאחר קביעת השלב לפי החלפה מולקולרית, בחר הפעל מבנה אוטומטי ולחץ על הפעל. כל הקבצים הדרושים יתווספו באופן אוטומטי. עם השלמתו, בדוק את המודל ב- COOT ולבנות ולמקד את המודל באופן ידני, על פי מפת צפיפות האלקטרונים ב- COOT.באמצעות מודל זה, הרצף ואת נתוני העקמומיות כמו קלט, לחדד את המודל אוצרות ידנית Phenix, בהתייחסו Phenix כדי לעזור לבחור את האסטרטגיה הנכונה. לאחר עידון לבדוק את התוצאות, עידון חינם עבודת עידון חייב להקטין. מחווני MolProbity חייבים להיות מכובדים וחריגים עם מתאם חלל ריאלי נמוך, חייבים להיות מוגבלים.כאשר המודל המעודן הטוב ביותר נוצר, להפעיל MolProbity בשרת ולבדוק את כל החריגים שזוהו על ידי התוכנית. ניתן להשתמש כרומטוגרפיה של הדרת גודל כדי לקבוע את המשקל המולקולרי לכאורה של החלבון המטוהר. מצב התגבשות של פפטיד, ניתן לייעל על ידי שינוי ה- pH לעומת ריכוז PEG סביב מצבו של עמום.לדוגמה, הטוב ביותר TmPep1050 H60A H307A גבישים, הושגו 0.1 ציטראט נתרן טוחנת עם pH של 5.2 ו 20%PEG 3350 ריכוז, לאחר מחזור אחד של זריעת מיקרו כדי לשפר את גבישיות מיקרו. בניתוח זה, אינדקס נתונים הראה כי קבוצת החלל של הגביש TmPep1050 H60A H307A היה C2221, אבל XDS הציע פתרון אחר, קבוצת החלל MP. המבנה של TmPep1050 H60A H307A, ניתן להשלים לאחר מספר מחזורים של עידון אוטומטי וידני.אישור המצב האוליגומרי עם משטח ממשק של 1, 710 אנגסטרום מרובע בין שני מונומרים ואנרגיה חופשית של היווצרות ממשק של מינוס 16.2 קילוקלוריות לכל שומה. כאן, תקריב של TmPep1050 H60A H307A אתר פעיל בהשוואה לאתר הפעיל של TmPep1050 עמום ו dodecamer ניתן לראות. בעת בניית מודל לדאוג לבנות רק את מה שאתה רואה בצפיפות האלקטרונים כדי למנוע פרשנות יתר, את הנתונים, ולקחת את הזמן כדי ללטש את המודל שלך.המשקל המולקולרי של עמום ו dodecamer יכול להיקבע גם על ידי ספקטרומטריית מסה מקומית. והשיטות יכולות להיות שימושיות לגילוי אוליגומרים מעבר.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

לימודי המבנית של מקרומולקולות בפתרון באמצעות פיזור קרני רנטגן זווית קטנה

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

תרבות התא על ממברנות הסיליקון נידהר וקריופיקציה עבור סינכרוטרון X-ray פלואורסצנטית ננו-ניתוח

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

הקרנה עבור התרמוטוגה מארימה ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

אופטימיזציה של הצמיחה של גבישי אנדותיאפפסין לניסויי קריסטלוגרפיה סדרתיים

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטית במתקן EMBL HTX בגרנובל

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...