Name: x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00
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हम इस पेपर को प्रूफरीडिंग करने और रचनात्मक टिप्पणियां देने के लिए मार्टीन रोबर्स को धन्यवाद देते हैं । प्रोक्सिमा 2 बीमलाइन (SOLEIL सिंक्रोट्रॉन) तक पहुंच ब्लॉक आवंटन समूह 20151139 के भीतर थी।

1. पुनर्संयोजन TmPep1050 का उत्पादन और शुद्धिकरण
नोट: इसके बाद क्लोनिंग प्रक्रिया और जंगली प्रकार TmPep1050 की शुद्धि एक पिछले अध्ययन11से अनुकूलित वर्णित हैं । वैकल्पिक रूप से, क्लोनिंग एक सिंथे?...

यहां वर्णित प्रोटोकॉल संरचनात्मक स्तर पर TmPep1050 के मंद-द्वादक संक्रमण को समझने की अनुमति देता है। इस पद्धति का अनुभव पहले टीएमपेप1050 ओलिगोमर दोनों की संरचना निर्धारित करनेकेलिए किया गया था । सबस...

ओलिगोमेराइजेशन एक प्रमुख प्रक्रिया है जो कई प्रोटीन के जैविक कार्यों को तय करती है। एस्चेरिचिया कोलाईमें यह अनुमान लगाया गया है कि केवल 35% प्रोटीन मोनोमेरिक1हैं । कुछ प्रोटीन, जिन्हें मॉर्फीिन कहा जाता है, यहां तक कि प्रत्येक अल्पाधिकारी राज्य2में अलग संरचना वाले उपइकाओं के साथ कई ओलिगोमेरिक राज्यों को भी अपना सकते हैं। उनके अल्पाधिकारी राज्यों के बीच संक्रमण अक्सर प्रोटीन गतिविधि को विनियमित करने का मतलब होता है क्योंकि प्रत्येक अल्पाधिकारी राज्य में एक अलग विशिष्ट गतिविधि या कार्य हो सकता है। अफ़रीद के कई उदाहरण साहित्य में अच्छी तरह से प्रलेखित किए गए हैं, विशेष रूप से पोर्फोबिलिनोजेन सिंथेस3,एचपीआर किनेस/फॉस्फेट4,लोन प्रोटीज5,लैक्टेट डेहाइड्रोजनेज़6,ग्लाइसेरल्डिहाइड-3-फॉस्फेट डेहाइड्रोजेज7,पायरुवेट किनेस8,साइट्रेट सिंथाज9,और रिबोक्लेशिकेस ए10। हाल ही में, हमने M42 aminopeptidase TmPep1050 का वर्णन किया, जो मॉर्फीिन जैसे व्यवहार के साथ एंजाइम का एक और उदाहरण है, जिसकी गतिविधि इसके ओलिगोमेरिक राज्यों पर निर्भर करती है11। इसके अल्पाधिकारी राज्यों के बीच संक्रमण इसके धातु सहकारकों द्वारा मध्यस्थता की जाती है जो उपइकाओं के कई संरचनात्मक संशोधनों को प्रेरित करते हैं।
एम42 अमीनोपेपिडेस परिवार एमएच कबीले12,13से संबंधित है और यह बैक्टीरिया और आर्चिया14के बीच व्यापक रूप से वितरित किया जाता है । एम42 अमीनोपेपिडेस वास्तविक डिस्यूक्लियर एंजाइम हैं जो पेप्टाइड्स को15लंबाई में 35 अमीनो एसिड अवशेषों तक अपमानजनक करते हैं। वे एक अजीब टेट्राहेड्रॉन के आकार की संरचना को अपनाते हैं जो 12 उपइकाओं से बना है, जिसमें उनकी सक्रिय साइटें एक आंतरिक गुहा की ओर उन्मुख होती हैं। इस तरह की व्यवस्था को अक्सर अनियंत्रित प्रोटेओलिसिस से बचने के लिए गतिविधि के नैनो-कंपार्टमेंट के रूप में वर्णित किया जाता है। एम 42 अमीनोपेपिडेस का शारीरिक कार्य प्रोटीन क्षरण16, 17के परिणामस्वरूप प्रोटेसोम, हाइड्रोलिजिंग पेप्टाइड्स से जुड़ा हो सकता है। पायरोकोकस होरीकोशिई के पास चार एम 42 अमीनोपेपिडेस होते हैं, जिनमें से प्रत्येक अलग लेकिन पूरक विशिष्टताएं18,19,20,21पेश करते हैं। पी होरिकोशिमें दो अलग-अलग प्रकार की उपइकाइकों से बने हेट्रोकॉम्प्लेक्स का वर्णन किया गया है, जो पेप्टिडासोम कॉम्प्लेक्स22,23के अस्तित्व का सुझाव देते हैं।
साहित्य 11 , 16 , 18 ,19, 20 , 24,25,26में एम42अमीनोपेपिडेस की कई संरचनाओं का वर्णन किया गया है । सबयूनिट दो अलग-अलग डोमेन, एक उत्प्रेरक डोमेन और एक डाइमराइजेशन डोमेन से बना है। उत्प्रेरक डोमेन पूरे एमएच कबीले में संरक्षित एक आम α/β गुना को अपनाता है, ठेठ उत्प्रेरक डोमेन विब्रियो प्रोटेओलिटिकस27का एमिओपेप्टिडेस एपी1 है। डिमराइजेशन डोमेन पीडीजेड-जैसे गुना16 को अपनाता है और हो सकता है कि अल्पाधिकार में इसकी भूमिका के अलावा, सब्सट्रेट एक्सेस को नियंत्रित करने और आंतरिक गुहा11में बाध्यकारी होने में भूमिका हो। चूंकि बुनियादी बिल्डिंग ब्लॉक एक डाइमर है, इसलिए डोडेकेमर को अक्सर छह डाइमर के संघ के रूप में वर्णित किया जाता है, प्रत्येक डाइमर को टेट्राहेड्रॉन16के प्रत्येक किनारे पर तैनात किया जाता है। M42 अमीनोपेप्टिडास का अल्पाधिकार इसके धातु कोफैक्टरों की उपलब्धता पर निर्भर करता है। डिवेलेंट मेटल आयन, अक्सर जेडएन2 + और सीओ2 +,पेप्टाइड बाइंडिंग और हाइड्रोलिसिस में उत्प्रेरक रूप से शामिल होते हैं। वे दो अलग-अलग बाध्यकारी साइटों, अर्थात् एम 1 और एम 2 साइटों में पाए जाते हैं। दो धातु आयनों को भी ड्राइव और बारीकी से के रूप में PhTET2, PhTET3, PfTET3, और TmPep105011,24, 28,29के लिए प्रदर्शन के रूप में अल्पाधिकार धुन । जब धातु कोफैक्टर समाप्त हो जाते हैं, तो द्वादश डिमर्स में अलग हो जाता है, जैसे PhTET2, PhTET3, और TmPep105011,16,28,या यहां तक कि मोनोमर, जैसे PhTET2 और PfTET324, 29।
यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जो TmPep1050 अल्पाधिकार की संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। यह प्रोटोकॉल प्रोटीन शुद्धिकरण, प्रोटियोलिटिक गतिविधि स्क्रीनिंग, क्रिस्टलीकरण, एक्स-रे विवर्तन और आणविक प्रतिस्थापन सहित सामान्य तरीकों का एक सेट है। धातु, प्रोटीन ओलिगोमेराइजेशन, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण और आणविक प्रतिस्थापन से निपटने के लिए निहित बारीकियों पर जोर दिया जाता है। अध्ययन का एक मामला यह दिखाने के लिए भी प्रस्तुत किया जाता है कि क्या TmPep1050 द्वादशों को मोनोमर में और अलग कर सकते हैं या नहीं । इस प्रश्न का समाधान करने के लिए, एक TmPep1050 संस्करण, TmPep1050H60A H307A,जिसका धातु बाध्यकारी साइटों अपने-६० (M2 साइट) और उसके-३०७ (M1 साइट) अला अवशेषों को उत्परिवर्तन द्वारा बिगड़ा हुआ है अध्ययन किया गया है । इस प्रोटोकॉल को अन्य M42 अमीनोपेप्टिडेस या मॉर्फीिन जैसे व्यवहार के साथ किसी भी धातुलोएंज़ीम का अध्ययन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13, 137-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://www.ccp4.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen II</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyXtal 15-well tool</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>132007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli PPY strain</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>see reference 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli XL1 blue strain</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Standard</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1511901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litholoops</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine-p-nitroanilide</td>
			<td>Bachem AG</td>
			<td>40010720025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neggia plugin</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>N/A</td>
			<td>visit https://www.dectris.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBAD-TOPO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K430001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www.phenix-online.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Phe</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17014702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Q</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17094705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17104301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima MSB8 strain</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 43589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TmCD00089984</td>
			<td>DNASU Plasmid Repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xdsme</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://github.com/legrandp/xdsme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

M42 अमीनोपेपिडेस 12 उपइकाओं से बने कार्यात्मक रूप से सक्रिय परिसर बनाते हैं। उनकी असेंबली प्रक्रिया को उनके धातु आयन कोफैक्टरों द्वारा विनियमित किया जाता है जो एक डिमर-डोडेकेमर संक्रमण को ट्रिगर करते हैं। धातु आयन बाध्यकारी पर, कई संरचनात्मक संशोधन सक्रिय साइट में और इंटरैक्शन इंटरफेस पर होते हैं, जो आत्म-असेंबली को बढ़ावा देने के लिए डिमर्स को आकार देते हैं। इस तरह के संशोधनों का पालन करने के लिए, संरचनात्मक अध्ययन से पहले स्थिर अल्पाधिकार को अलग किया जाना चाहिए। यहां रिपोर्ट की गई एक विधि है जो TmPep1050 के स्थिर द्वादक और डाइमर्स के शुद्धिकरण की अनुमति देती है, टी मैरिटिमाका एक M42 अमीनोपेप्टिडेस, और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा उनकी संरचना निर्धारण। एक चेटिंग एजेंट के साथ धातु आयनों को हटाकर दशमलव से डिमर्स तैयार किए गए थे। उनके कोफैक्टर के बिना, द्वादश कम स्थिर हो गए और गर्म करने पर पूरी तरह से अलग हो गए। ओलिगोमेरिक संरचनाओं को सीधा आणविक प्रतिस्थापन दृष्टिकोण द्वारा हल किया गया था। कार्यप्रणाली को समझाने के लिए, धातु आयन बाध्यकारी में पूरी तरह से बिगड़ा एक TmPep1050 संस्करण की संरचना, मोनोमर के लिए dimers के आगे कोई टूटने दिखा प्रस्तुत किया है ।

TmPep1050 में मोनोमर में एक संभावित द्वादश वियोजन का अध्ययन करने के लिए, उनके-60 और उनके-307 कोडन को सिंथेटिक जीन का उपयोग करके एलेनिन कोडन द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था। तब इस जीन को इसी TmPep1050 संस्करण की अभिव्यक...

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X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

इस प्रोटोकॉल को संरचनात्मक स्तर पर TmPep1050, एक M42 अमीनोपेप्टिडेस के डिमर-डोडेकामर संक्रमण का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। यह प्रोटीन शुद्धिकरण से लेकर एक्स-रे डेटा प्रोसेसिंग तक की सीधी पाइपलाइन है । क्रिस्टलोलोजेनेसिस, डेटा सेट इंडेक्सेशन, और आणविक प्रतिस्थापन अध्ययन के एक मामले के माध्यम से जोर दिया गया है, TmPep1050H60A H307A संस्करण ।

थर्मोटोगा मारिटिमा M42 अमीनोपेप्टिडेस TmPep1050 के ओलिगोमेरिक राज्य संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

यह प्रोटोकॉल विभिन्न अल्पाहारिक राज्यों और अल्पाधिकार-निर्भर गतिविधियों के साथ अमीनोपेप्टिडेस के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है जो निष्क्रिय डिमर्स और सक्रिय दनिर्णयके के बीच संतुलित होते हैं। इस पारंपरिक तकनीक को किसी भी लैब में आसानी से अंजाम दिया जा सकता है। और एक तरफ एक बीमलाइन या एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी सुविधा के लिए उपयोग की आवश्यकता से, विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है ।कुछ अनुकूलन के साथ, इस विधि को किसी अन्य प्रोटीन पर एक गतिविधि या कार्य के साथ लागू किया जा सकता है जो इसकी डिग्री के अल्पाधिकार पर निर्भर है। एक्स-रे डेटा को प्रोसेस करने के लिए, उपयोगकर्ताओं को क्रिस्टलोग्राफी की न्यूनतम समझ होनी चाहिए। हम उपयोगकर्ताओं को प्रशिक्षण का पालन करने, XDS विकी पर जाने और फेनिक्स ट्यूटोरियल देखने के लिए आमंत्रित करते हैं।एक गतिविधि परख करने के लिए, 50 मिलीमोलर एमओपी के 965 माइक्रोलीटर के लिए 100 m M L-Leucine p-Nitroanilide के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें, 250 माइक्रोमोलर कोबाल्ट दो क्लोराइड और 10% मेथनॉल प्री 75 डिग्री सेल्सियस शुष्क स्नान में प्रतिक्रिया मिश्रण को कम करते हैं, एंजाइम को अतिरिक्त 50 मिलीमोलर एमओपी के साथ एक माइक्रोमोलर अंतिम एकाग्रता में पतला करने से पहले। इसके बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण में एक माइक्रोमोलर एंजाइम के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें और एक घंटे से अधिक समय तक 75 डिग्री सेल्सियस शुष्क स्नान की प्रतिक्रिया लौटाने से पहले परिणामी समाधान को भंवर दें। जब समाधान पीला हो गया है, तो 20% अम्लीय एसिड के एक मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया बंद करें और मिश्रण को कमरे के तापमान तक ठंडा करने की अनुमति देने से पहले भंवर करें।फिर प्रतिक्रिया मिश्रण के एक एलिकोट को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर सेल में स्थानांतरित करें और एंजाइम के बिना एक इनक्यूबेटेड प्रतिक्रिया मिश्रण के खिलाफ 410 नैनोमीटर पर शोषकों को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पढ़ें। एपोएंजाइम तैयारी के लिए, 50 मिलीमोलर एमओपीएस, 0.5 मोलर अमोनियम सल्फेट और शुद्ध टीएमपीपी1050 के 100 माइक्रोलीटर के 890 माइक्रोलीटर में 10-फेनथ्रोलिन स्टॉक समाधान जोड़ें। कोबाल्ट दो क्लोराइड के अलावा के बिना प्रदर्शन के रूप में गतिविधि परख का उपयोग कर गतिविधि हानि की जांच करें ।परख के बाद, नमूने को डायलिसिस ट्यूब में स्थानांतरित करें और 50 मिलीमोलर एमओपीएस के 200 मिलीलीटर और 0.5 मोलर अमोनियम सल्फेट के खिलाफ चार डिग्री सेल्सियस पर नमूना डायलाइज़ करें। 48 घंटे के डायलिसिस के दौरान तीन बार ताजा बफर के साथ डायलासेट का आदान-प्रदान करें और डायलिसिस ट्यूब से नमूना एकत्र करें। 30 किलोडडलटन कटऑफ के साथ अल्ट्रा फिल्ट्रेशन इकाइयों का उपयोग करके, नमूना को 100 माइक्रोलीटर पर वापस केंद्रित करें और 280 नैनोमीटर पर नैनो वॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर एकाग्रता की जांच करें।डिमर्स तैयार करने के लिए 50 मिलीमोलर एमओपी और 0.5 मोलर अमोनियम सल्फेट में एक माइक्रोमोलर एकाग्रता के लिए एपोएंजाइम को पतला करें, और 75 डिग्री सेल्सियस शुष्क स्नान में दो घंटे के लिए प्रतिक्रिया को कम करें। फिर एंजाइम के नमूने को कम से कम 50 माइक्रोलीटर एकाग्रता पर केंद्रित करें और आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी द्वारा आणविक वजन की जांच करें। प्रोटीन क्रिस्टल के आकार, आकार और क्रिस्टलिनिटी में सुधार करने के लिए, क्रिस्टल की बूंद में अनुकूलित क्रिस्टलीकरण समाधान की उचित मात्रा जोड़ें ताकि क्रिस्टल ड्रॉपलेट वॉल्यूम को 10 माइक्रोलीटर तक लाया जा सके।बूंद को 1.5 मिलीलीटर माइक्रो ट्यूब में स्थानांतरित करें और वरीयता प्राप्त कुएं में क्रिस्टलीकरण समाधान के 90 अधिक माइक्रोलीटर जोड़ें। प्रत्येक बीज कमजोर पड़ने के लिए, क्रिस्टलीकरण प्लेट में कुओं की उचित संख्या में क्रिस्टलीकरण रिएजेंट के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्रोटीन नमूने के दो माइक्रोलीटर को क्रिस्टलीकरण रिएजेंट के दो माइक्रोलीटर और एक क्रिस्टलीकरण समर्थन में बीजों के 0.2 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं। फिर क्रिस्टलीकरण रिएजेंट के प्रत्येक कुएं पर समर्थन को ठीक करें।क्रिस्टल चुनने के लिए, तरल नाइट्रोजन के साथ स्नान भरें और नाइट्रोजन में नमूना हैंडलिंग के लिए उपयोग की जाने वाली किसी भी शीशियों या टोकरी को डुबकी दें। तरल नाइट्रोजन को संभालना खतरनाक है यह गंभीर ठंढ का कारण बन सकता है। क्रायोजेनिक दस्ताने और सुरक्षात्मक आंख काले चश्मे की तरह उचित व्यक्तिगत सुरक्षा पहनना सुनिश्चित करें।क्रिस्टल आकार के अनुसार विभिन्न आकारों के नमूना उठा छोरों की स्थापना और क्रिस्टल युक्त एक बूंद का चयन करने के लिए एक दूरबीन का उपयोग करें। फिर एक लूप का उपयोग धीरे-धीरे एक अच्छी तरह से एक अलग क्रिस्टल का चयन करने के लिए और तुरंत एक उपयुक्त शीशी में पाश रखने से पहले तरल नाइट्रोजन में पाश डुबकी। विवर्तन स्पॉट तीव्रता को मापने के लिए, एक फ़ोल्डर बनाएं जिसमें से XDS चलाया जाएगा और छवियों के रास्ते का पता लगाएगा।xdsme चलाने के लिए, एक टर्मिनल विंडो में कमांड दर्ज करें। XDS के बाद नौकरी समाप्त हो गया है सही एलपी फ़ाइल की जांच करें और अंतरिक्ष समूह के निर्धारण, डेटा पूर्णता, उच्चतम संकल्प, क्रिस्टल मोज़ेक और डेटा गुणवत्ता की संभावना ध्यान दें । अंतरिक्ष समूहों की संभावना प्राप्त करने के लिए XDS व्यर्थ लॉग की जांच करने के बाद, पिछली प्रक्रिया को अधिभावी से बचने के लिए एक अलग फ़ोल्डर में XDS द्वारा प्रस्तावित विभिन्न अंतरिक्ष समूह समाधानों के साथ xdsme को फिर से चलाने के लिए आदेशों का उपयोग करें।डेटा आंकड़ों के आधार पर सबसे अच्छा समाधान चुनने के बाद, XSCALE और XDSCONV चलाने के लिए आदेश दर्ज करें। एक असंगत बिखरने आइटम के बिना चरण निर्धारित करने के लिए, आणविक प्रतिस्थापन के लिए शुरुआती मॉडल तैयार करने के लिए 4P X, वाई निर्देशांक का उपयोग करें। पीडीबी फाइल से, एक मोनोमर निकालने और एलनिन में अपने अमीनो एसिड को ट्राइन करने के लिए फेनिक्स पीडीबी फाइल एडिटर का उपयोग करें।XDSCONV द्वारा उत्पन्न प्रतिबिंब फ़ाइल और इनपुट के रूप में अनुक्रम के साथ एक्स रन ट्राय किया। Xtriage से लॉग फाइल की जांच करें। पूर्णता, असममित इकाई में उपइकांतों की संख्या, एनिसोट्रोपी, बर्फ के छल्ले की उपस्थिति और ट्विनिंग घटना पर ध्यान दें।आणविक प्रतिस्थापन के लिए फेनिक्स में Phaser-MR चलाने के लिए, प्रतिबिंब फ़ाइल, अनुक्रम और शुरू 4P छह Y मॉडल पॉलीलैनिन और क्लिक रन में काट का चयन करें । पूरा होने पर, जांच करें कि क्या एक मॉडल पाया गया है और आणविक प्रतिस्थापन के स्कोर की जांच करें। कम से कम आठ का अनुवाद कारक जेड स्कोर, इंगित करता है कि समाधान निश्चित रूप से सही है।आणविक प्रतिस्थापन द्वारा चरण का निर्धारण करने के बाद, रन ऑटो बिल्ड और क्लिक रन का चयन करें। सभी आवश्यक फाइलें स्वचालित रूप से जुड़ जाएंगी। पूरा होने पर, COOT में मॉडल की जांच करें और कूट में इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र के अनुसार, मैन्युअल रूप से मॉडल का निर्माण और परिष्कृत करें।इस मॉडल का उपयोग करना, अनुक्रम और इनपुट के रूप में विवर्तन डेटा, फेनिक्स में मैन्युअल रूप से क्यूरेटेड मॉडल को परिष्कृत करें, सही रणनीति का चयन करने में मदद करने के लिए फेनिक्स का जिक्र करते हुए। परिष्करण के बाद परिणामों की जांच, शोधन मुक्त और शोधन काम कम होना चाहिए । मोलप्रोबिटी संकेतकों का सम्मान किया जाना चाहिए और कम वास्तविक अंतरिक्ष सहसंबंध के साथ आउटलर्स, सीमित होना चाहिए।जब सबसे अच्छा परिष्कृत मॉडल उत्पन्न किया गया है, तो सर्वर पर मोलप्रोबिटी चलाएं और कार्यक्रम द्वारा पहचाने गए किसी भी आउटलर्स की जांच करें। शुद्ध प्रोटीन के स्पष्ट आणविक वजन को निर्धारित करने के लिए आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया जा सकता है। पेप्टाइड की क्रिस्टलीकरण स्थिति, डाइमर की स्थिति के चारों ओर पीएच बनाम खूंटी एकाग्रता को अलग करके अनुकूलित किया जा सकता है।उदाहरण के लिए, सबसे अच्छा TmPep1050 H60A H307A क्रिस्टल, माइक्रो क्रिस्टल में सुधार करने के लिए माइक्रो सीडिंग के एक चक्र के बाद 5.2 और 20% खूंटी 3350 एकाग्रता के पीएच के साथ 0.1 मोलर सोडियम साइट्रेट में प्राप्त किए गए थे। इस विश्लेषण में, डेटा इंडेक्सेशन से पता चला है कि TmPep1050 H60A H307A क्रिस्टल का अंतरिक्ष समूह C2221 था, लेकिन XDS ने एक और समाधान का प्रस्ताव रखा, एमपी स्पेस ग्रुप । TmPep1050 H60A H307A की संरचना, स्वचालित और मैनुअल शोधन के कई चक्रों के बाद पूरा किया जा सकता है।दोनों मोनोमर के बीच 1, 710 वर्ग एंग्स्ट्रॉम की इंटरफ़ेस सतह और शून्य से 16.2 किलोकैलोरी प्रति तिल के इंटरफेस गठन की एक मुक्त ऊर्जा के साथ ओलिगोमेरिक राज्य की पुष्टि। यहां, TmPep1050 H60A H307A सक्रिय साइट का एक क्लोजअप TmPep1050 dimer और dodecamer की सक्रिय साइट की तुलना में मनाया जा सकता है । जब एक मॉडल का निर्माण केवल वही बनाने का ध्यान रखता है जो आप इलेक्ट्रॉन घनत्व में देखते हैं ताकि व्याख्या, डेटा से बचा जा सके और अपने मॉडल को पॉलिश करने का समय लिया जा सके।डाइमर और द्वादश का आणविक वजन भी देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। और तरीके संक्रमण ओलिगोमर का पता लगाने के लिए उपयोगी हो सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

तैयारी और सीरियल गुजरने क्रि लिए lipídic घन चरण में प्रोटीन microcrystals की डिलिवरी

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

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एक्स-रे क्रि छोटे कोण एक्स-रे के साथ Nsa1 के मॉडल unस्ट्रक्चर्ड क्षेत्रों को तितर बितर के साथ संयोजन एस Cerevisiae से

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

एक्स-रे क्रि और भौतिक तकनीकों द्वारा Immunoglobulin गुना के साथ नच का लक्षण वर्णन

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

समाधान में अणुओं के संरचनात्मक अध्ययन छोटे कोण एक्स-रे कैटरिंग का उपयोग

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

न्यूनतम पृष्ठभूमि स्कैटिंग के साथ मैक्रोआण्विक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए एक ऑल-इन-वन नमूना धारक

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली और सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे फ्लोरेसेंस नैनो-विश्लेषण के लिए क्रायोतैयारी पर सेल कल्चर

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

थर्मोटोगा मैरिटिमा झिल्ली-बाउंड पायरोफोस्फेटेसे अवरोधकों के लिए स्क्रीनिंग

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए एंडोथियापेप्सिन क्रिस्टल के विकास का अनुकूलन

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

ग्रेनोबल में ईएमबीएल एचएचएक्स सुविधा में स्वचालित क्रिस्टलोग्राफी पाइपलाइन

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी के लिए क्रिस्टल हिट प्राप्त करने के लिए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...