Name: x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

Ringraziamo Martine Roovers per aver corretto questo documento e per aver dato commenti costruttivi. L'accesso alla linea di travi Proxima 2 (sincrotrone SOLEIL) rientrava nei gruppi di allocazione dei blocchi 20151139.

1. Produzione e purificazione del ricombinante TmPep1050
NOTA: Di seguito sono descritte la procedura di clonazione e la purificazione di tipo selvatico TmPep1050 adattato da uno studioprecedente 11. In alternativa, la clonazione può essere eseguita utilizzando un gene sintetico. Per generare varianti TmPep1050, la mutagenesi diretta dal sito può essere eseguita seguendo, ad esempio, le reazioni a singolo primer nel metodo SPRINP (Parallel Protocol)30<...

Il protocollo qui descritto consente di comprendere la transizione dimero-dodecamero di TmPep1050 a livello strutturale. La metodologia è stata sperimentata in precedenza per determinare la struttura di entrambi gli oligomeri TmPep105011. Il passo più impegnativo è stato quello di trovare le condizioni che promuoveno la dissociazione dei dodecamer in dimeri stabili. Tali condizioni dovevano essere abbastanza miti da consentire la riassociazione dei dimeri in dodecamer al momento dell'aggiunta d...

L'oligomerizzazione è un processo predominante che detta le funzioni biologiche di molte proteine. In Escherichia coli, si stima che solo il 35% delle proteine siano monomeriche1. Alcune proteine, chiamate morfeeine, possono anche adottare diversi stati oligomerici con subunità aventi una struttura distinta in ogni stato oligomerico2. La transizione tra i loro stati oligomerici è spesso una media per regolare l'attività proteica in quanto ogni stato oligomerico può avere un'attività o una funzione specifica diversa. Diversi esempi di morfeeine sono stati ben documentati in letteratura, in particolare il porfobilinogeno sintasi3, HPr chinasi/fosfatasi4, Lon proteasi5, lattato deidrogenasi6, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi7, piruvato chinasi8, citrato sintasi9e ribonucleasi A10. Recentemente, abbiamo descritto l'amminopeptidasi M42 TmPep1050, un altro esempio di enzima con comportamento simile alla morfeina, la cui attività dipende dai suoi stati oligomerici11. La transizione tra i suoi stati oligomerici è mediata dai suoi cofattori metallici che inducono diverse modifiche strutturali delle subunità.
La famiglia M42 aminopeptidasi appartiene al clan MH12,13,ed è ampiamente distribuita tra Batteri e Archaea14. Le amminopeptidasi M42 sono veri enzimi dinucleari che degradano peptidi fino a 35 residui di amminoacidi inlunghezza 15. Adottano una particolare struttura a forma di tetraedro composta da 12 subunità con i loro siti attivi orientati verso una cavità interna. Tale disposizione è spesso descritta come una nano-compartimentazione dell'attività per evitare la proteolisi incontrollata. La funzione fisiologica delle amminopeptidasi M42 può essere associata al proteasome, peptidi idrolizzando risultanti dalla degradazione proteica16,17. Pyrococcus horikoshii possiede quattro aminopeptidasi M42, ognuna delle quali presenta specifiche distinte ma complementari18,19,20,21. Singolarmente, eterocomplessi fatti di due diversi tipi di subunità sono stati descritti in P. horikoshii, suggerendo l'esistenza di complessi peptidasomei22,23.
Diverse strutture di M42 aminopeptidasi sono state descritte nellaletteratura 11,16,18,19,20,24,25,26. La subunità è composta da due domini distinti, un dominio catalitico e un dominio di dimerizzazione. Il dominio catalitico adotta una comune piega α/β conservata in tutto il clan MH, il dominio catalitico archetipico è l'amminopeptidasi Ap1 di Vibrio proteolyticus27. Il dominio di dimerizzazione adotta una piega16 simile a PDZ e può avere, oltre al suo ruolo nell'oligomerizzazione, un ruolo nel controllo dell'accesso al substrato e del legame nella cavitàinterna 11. Poiché l'elemento costitutivo di base è un dimero, il dodecamero è spesso descritto come l'associazione di sei dimeri, ognuno dei quali è posizionato ad ogni bordo del tetraedro16. L'oligomerizzazione delle aminopeptidasi M42 si basa sulla disponibilità dei suoi cofattori metallici. Gli ioni metallici divalenti, spesso Zn2+ e Co2+,sono cataliticamente coinvolti nel legame peptidico e nell'idrolisi. Si trovano in due siti di binding distinti, vale a dire siti M1 e M2. I due ioni metallici guidano e ottimizzano finemente l'oligomerizzazione come dimostrato per PhTET2, PhTET3, PfTET3 e TmPep105011,24,28,29. Quando i cofattori metallici sono esauriti, il dodecamero si smonta in dimeri, come in PhTET2, PhTET3 e TmPep105011,16,28o anche monomeri, come in PhTET2 e PfTET324,29.
Presentato qui è un protocollo utilizzato per studiare le strutture degli oligomeri TmPep1050. Questo protocollo è un insieme di metodi comuni tra cui la purificazione proteica, lo screening dell'attività proteolitica, la cristallizzazione, la diffrazione dei raggi X e la sostituzione molecolare. Vengono enfatizzate le sottigliezze inerenti alla gestione dei metalloenzimi, all'oligomerizzazione proteica, alla cristallizzazione proteica e alla sostituzione molecolare. Viene inoltre presentato un caso di studio per dimostrare se i dodecamer TmPep1050 possono dissociarsi ulteriormente in monomeri o meno. Per rispondere a questa domanda, è stata studiata una variante TmPep1050, TmPep1050H60A H307A, i cui siti di legame metallico sono compromessi mutando i residui di His-60 (sito M2) e His-307 (sito M1) ad Ala. Questo protocollo può essere ospitato per studiare altre amminopeptidasi M42 o qualsiasi metalloenzima con comportamento simile alla morfeina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13, 137-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://www.ccp4.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen II</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyXtal 15-well tool</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>132007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli PPY strain</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>see reference 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli XL1 blue strain</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Standard</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1511901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litholoops</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine-p-nitroanilide</td>
			<td>Bachem AG</td>
			<td>40010720025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neggia plugin</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>N/A</td>
			<td>visit https://www.dectris.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBAD-TOPO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K430001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www.phenix-online.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Phe</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17014702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Q</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17094705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17104301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima MSB8 strain</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 43589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TmCD00089984</td>
			<td>DNASU Plasmid Repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xdsme</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://github.com/legrandp/xdsme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

Le amminopeptidasi M42 formano complessi funzionalmente attivi fatti di 12 subunità. Il loro processo di assemblaggio sembra essere regolato dai loro cofattori ionici metallici che innescano una transizione dimero-dodecamero. Al momento del legame ionici metallici, si verificano diverse modifiche strutturali nel sito attivo e nell'interfaccia di interazione, modellando i dimeri per promuovere l'auto-assemblaggio. Per osservare tali modifiche, gli oligomeri stabili devono essere isolati prima dello studio strutturale. Qui riportato è un metodo che consente la purificazione di dodecamer stabili e dimeri di TmPep1050, un amminopeptidasi M42 di T. maritimae la loro determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X. I dimeri venivano preparati da dodecamer rimuovendo ioni metallici con un agente chelatante. Senza il loro cofattore, i dodecamer divennero meno stabili e furono completamente dissociati al riscaldamento. Le strutture oligomeriche sono state risolte con il semplice approccio di sostituzione molecolare. Per illustrare la metodologia, viene presentata la struttura di una variante TmPep1050, totalmente compromessa nel legame ionici metallici, che non mostra ulteriori dimeri in monomeri.

Per studiare una possibile dissociazione del dodecamero in monomeri in TmPep1050, i codoni His-60 e His-307 sono stati sostituiti da alanina codone usando un gene sintetico. Questo gene è stato quindi clonato nel vettore pBAD per l'espressione e la purificazione della corrispondente variante TmPep1050 successivamente denominata TmPep1050H60A H307A. La cromatografia ad esclusione di dimensioni(figura 3B)ha mostrato che la proteina purificata aveva un peso molecolare apparente di 5...

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X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Questo protocollo è stato sviluppato per studiare la transizione dimero-dodecamero di TmPep1050, un'amminopeptidasi M42, a livello strutturale. È una pipeline semplice che parte dalla purificazione delle proteine all'elaborazione dei dati a raggi X. La cristallogenesi, l'indicizzazione del set di dati e la sostituzione molecolare sono state enfatizzate attraverso un caso di studio, variante TmPep1050H60A H307A.

Cristallografia a raggi X per studiare la transizione di stato oligomerica della termotoga maritima M42 Aminopeptidasi TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Questo protocollo facilita lo studio delle amminopeptidasi con diversi stati oligomerici e attività dipendenti dall'oligomerizzazione che sono bilanciate tra dimeri inattivi e dodecamer attivi. Questa tecnica convenzionale può essere facilmente eseguita in qualsiasi laboratorio. E oltre a richiedere l'accesso a una funzione di cristallografia beamline o a raggi X, non richiede dispositivi speciali.Con un certo adattamento, questo metodo può essere applicato a qualsiasi altra proteina con un'attività o una funzione che dipende dal suo grado di oligomerizzazione. Per elaborare i dati a raggi X, gli utenti devono avere una comprensione minima della cristallografia. Invitiamo gli utenti a seguire corsi di formazione, a visitare XDS Wiki e a guardare tutorial Phenix.Per eseguire un test di attività, aggiungere 25 microlitri di 100 mM L-Leucine p-Nitroanilide a 965 microlitri di MOPS da 50 millimolare, 250 micromolare cobalto due cloruri e 10%metanolo Pre incubare la miscela di reazione in un bagno secco di 75 gradi Celsius, prima di diluire l'enzima a una concentrazione finale micromolare con mops 50 millimolare aggiuntivo. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di un enzima micromolare alla miscela di reazione e vortice la soluzione risultante prima di restituire la reazione al bagno secco di 75 gradi Celsius per non più di un'ora. Quando la soluzione è diventata gialla, interrompere la reazione con un millilitro di acido acido al 20% e vortice la miscela prima di lasciare raffreddarla a temperatura ambiente.Quindi trasferire un'aliquota della miscela di reazione a una cella spettrofotometrica e leggere gli assorbenti a 410 nanometri contro una miscela di reazione incubata senza enzima, come controllo negativo. Per la preparazione dell'apoenzima, aggiungere 10 microlitri di soluzione di 1, 10 fenantrolina a 890 microlitri di MOPS millimolare, 0,5 solfato di ammonio molare e 100 microlitri di TmPep1050 purificato. Controllare la perdita di attività utilizzando il saggio di attività come dimostrato senza l'aggiunta di cobalto due cloruri.Dopo il test, trasferire il campione in un tubo di dialisi e dializzare il campione contro 200 millilitri di MOPS millimolare e 0,5 solfato di ammonio molare a quattro gradi Celsius. Scambiare il dialisato con tampone fresco tre volte durante la dialisi di 48 ore e raccogliere il campione dal tubo di dialisi. Utilizzando unità di ultra filtrazione con un taglio di 30 kilodalton, concentrare il campione a 100 microlitri e controllare la concentrazione su uno spettrofotometro a nano volume a 280 nanometri.Per preparare i dimeri diluire l'apotenzima a una concentrazione micromolare in MOPS millimolare e 0,5 solfato di ammonio molare e incubare la reazione per due ore in un bagno secco di 75 gradi Celsius. Quindi concentrare il campione enzimatico a quando almeno 50 microliter di concentrazione e controllare il peso molecolare per dimensione esclusione cromatografia. Per migliorare la forma, le dimensioni e la cristallinità dei cristalli proteici, aggiungere il volume appropriato di soluzione di cristallizzazione ottimizzata a una goccia di cristalli per portare il volume della goccia di cristallo a 10 microlitri.Trasferire la goccia in un microtubo da 1,5 millilitri e aggiungere altri 90 microlitri di soluzione di cristallizzazione al pozzo seminato. Per ogni diluizione del seme, aggiungere 500 microlitri di reagente di cristallizzazione per pozzo al numero appropriato di pozzi in una piastra di cristallizzazione e mescolare due microlitri di campione proteico con due microlitri di reagente di cristallizzazione e 0,2 microlitri di semi in un unico supporto di cristallizzazione per pozzo. Quindi fissare i supporti su ogni pozzo di reagente di cristallizzazione.Per la raccolta del cristallo, riempire un bagno con azoto liquido e immergere eventuali fiale o cesto utilizzati per la manipolazione del campione nell'azoto. La manipolazione dell'azoto liquido è pericoloso, può causare forti congelamento. Assicurati di indossare protezioni individuali adeguate come guanti criogenici e occhiali protettivi per gli occhi.Impostare cicli di prelievo campioni di dimensioni diverse in base alle dimensioni del cristallo e utilizzare un binocolo per selezionare una goccia contenente cristalli. Quindi utilizzare un anello per selezionare delicatamente un cristallo isolato da un pozzo e immergere immediatamente l'anello in azoto liquido prima di posizionare l'anello in una fiala adatta. Per misurare le intensità spot di diffrazione, create una cartella da cui verrà eseguito XDS e individuate il percorso delle immagini.Per eseguire xdsme, immettere il comando in una finestra terminale. Dopo che XDS ha terminato il lavoro controlla il file lp corretto e nota la probabilità della determinazione del gruppo spaziale, la completezza dei dati, la massima risoluzione, la mosaicità cristallina e la qualità dei dati. Dopo aver controllato il log inutile XDS per ottenere la probabilità di gruppi spaziali, utilizzare i comandi per rieseguire xdsme con diverse soluzioni di gruppi spaziali proposte da XDS, in una cartella separata per evitare di ignorare il processo precedente.Dopo aver selezionato la soluzione migliore in base alle statistiche sui dati, immettere i comandi per eseguire XSCALE e XDSCONV. Per determinare la fase senza un elemento di scattering anomalo, utilizzare le coordinate 4P X, Y, per preparare il modello iniziale per la sostituzione molecolare. Dal file PDB, utilizzare l'editor di file PDB Phenix per estrarre il monomero A e troncare i suoi amminoacidi in alanina.Eseguire X triaged con il file di riflessione generato da XDSCONV e la sequenza come input. Controllare il file di registro da Xtriage. Si noti la completezza, il numero di subunità nell'unità asimmetrica, l'anisotropia, la presenza di anelli di ghiaccio e l'evento di gemellaggio.Per eseguire Phaser-MR in Phenix per la sostituzione molecolare, selezionate il file di riflessione, la sequenza e il modello iniziale 4P six Y troncato in polialanina e fate clic su Esegui (Run). al termine, verificare se è stato trovato un modello e controllare il punteggio della sostituzione molecolare. Un punteggio Z del fattore di traduzione di almeno otto indica che la soluzione è definitivamente corretta.Dopo aver determinato la fase mediante sostituzione molecolare, selezionare Esegui compilazione automatica e fare clic su Esegui. Tutti i file richiesti verranno aggiunti automaticamente. Al termine, controllare il modello in COOT e costruire e perfezionare il modello manualmente, in base alla mappa di densità degli elettroni in COOT.Utilizzando questo modello, la sequenza e i dati di diffrazione come input, perfezionare il modello curato manualmente in Phenix, riferendosi a Phenix per aiutare a selezionare la strategia giusta. Dopo il perfezionamento controllare i risultati, il lavoro di perfezionamento e perfezionamento deve diminuire. Gli indicatori di MolProbity devono essere rispettati e gli outlier con bassa correlazione dello spazio reale devono essere limitati.Quando è stato generato il modello più raffinato, eseguire MolProbity sul server ed e controllare eventuali valori anomali identificati dal programma. La cromatografia ad esclusione di dimensioni può essere usata per determinare il peso molecolare apparente della proteina purificata. La condizione di cristallizzazione del peptide, può essere ottimizzata variando il pH rispetto alla concentrazione PEG intorno alla condizione del dimero.Ad esempio, i migliori cristalli TmPep1050 H60A H307A, sono stati ottenuti in citrato di sodio molare 0.1 con un pH di concentrazione di 5,2 e 20%PEG 3350, dopo un ciclo di micro semina per migliorare la microcristalinità. In questa analisi, l'indicizzazione dei dati ha mostrato che il gruppo spaziale del cristallo TmPep1050 H60A H307A era C2221, ma XDS ha proposto un'altra soluzione, il gruppo spaziale MP. La struttura di TmPep1050 H60A H307A, potrebbe essere completata dopo diversi cicli di perfezionamento automatizzato e manuale.Conferma dello stato oligomerico con una superficie di interfaccia di 1.710 angstrom quadrati tra monomeri e un'energia libera di formazione dell'interfaccia di meno 16,2 chilocalorie per talpa. Qui si può osservare un primo piano del sito attivo TmPep1050 H60A H307A rispetto al sito attivo del dimero e del dodecamer TmPep1050. Quando si costruisce un modello, fare attenzione a costruire solo ciò che si vede nella densità degli elettroni per evitare un'interpretazione troppo elevata, i dati, e prendersi il tempo necessario per lucidare il modello.Il peso molecolare del dimero e del dodecamero può anche essere determinato dalla spettrometria di massa nativa. E i metodi possono essere utili per rilevare oligomeri di transizione.

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