Name: x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

Vi takker Martine Roovers for korrekturlesing av dette papiret og gi konstruktive kommentarer. Tilgang til Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) var innenfor Block Allocation Groups 20151139.

1. Produksjon og rensing av rekombinant TmPep1050
MERK: Heretter er beskrevet kloning prosedyre og rensing av vill-type TmPep1050 tilpasset fra en tidligere studie11. Alternativt kan kloningen gjøres ved hjelp av et syntetisk gen. Hvis du vil generere TmPep1050-varianter, kan områderettet mutagenese utføres følgende, for eksempel én primerreaksjonene i parallellprotokoll (SPRINP)-metoden30. Renseprotokollen kan brukes for TmPep1050-varianter. ...

Protokollen som er beskrevet her, gjør det mulig å forstå den dimer-dodecamer overgangen til TmPep1050 på strukturnivå. Metodikken ble opplevd tidligere for å bestemme strukturen til både TmPep1050 oligomers11. Det mest utfordrende trinnet var å finne forhold som fremmet dissosiasjon av dodecamers til stabile dimers. Slike forhold måtte være milde nok til å tillate reassociation av dimers i dodecamers når metallionkofaktoren ble lagt til. Separasjonen av oligomerer var også et kritisk...

Oligomerisering er en dominerende prosess som dikterer de biologiske funksjonene til mange proteiner. I Escherichia colier det anslått at bare 35% av proteinene er monomeriske1. Noen proteiner, kalt morfoseiner, kan til og med vedta flere oligomeriske tilstander med underenheter som har distinkt struktur i hver oligomeriske tilstand2. Overgangen mellom deres oligomeriske tilstander er ofte et middel til å regulere proteinaktivitet, da hver oligomeriske tilstand kan ha en annen spesifikk aktivitet eller funksjon. Flere eksempler på morfoeiner har blitt godt dokumentert i litteraturen, spesielt porphobilinogen synthase3, HPr kinase / fosfat dehydrogenase7, pyruvat dehydrogenase6, glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase7, pyruvat kinase8, citrate synthase9, og ribonuclease A10. Nylig beskrev vi M42 aminopeptidase TmPep1050, et annet eksempel på enzym med morfeeinlignende oppførsel, hvis aktivitet avhenger av oligomeriske tilstander11. Overgangen mellom de oligomeriske statene er mediert av sine metalliske kofaktorer som induserer flere strukturelle modifikasjoner av underenhetene.
M42 aminopeptidase familien tilhører MH klanen12,13, og er utbredt blant bakterier og Arkaea14. M42 aminopeptidasene er ekte dinukleærenzymer som nedbryter peptider opptil 35 aminosyrerester i lengde15. De vedtar en særegen tetrahedron-formet struktur laget av 12 underenheter med sine aktive steder orientert mot et indre hulrom. Et slikt arrangement blir ofte beskrevet som en nano-compartmentalization av aktiviteten for å unngå ukontrollert proteolyse. Den fysiologiske funksjonen til M42 aminopeptidasene kan være forbundet med proteasom, hydrolyserende peptider som følge av proteinnedbrytning16,17. Pyrococcus horikoshii har fire M42 aminopeptidaser, hver presenterer distinkte, men komplementære spesifisiteter18,19,20,21. Entall, heterocomplexes laget av to forskjellige typer underenheter har blitt beskrevet i P. horikoshii, noe som tyder på eksistensen av peptidasome komplekser22,23.
Flere strukturer av M42 aminopeptidaser har blitt beskrevet ilitteraturen 11,16,18,19,20,24,25,26. Underenheten består av to forskjellige domener, et katalytisk domene og et dimmeriseringsdomene. Det katalytiske domenet vedtar en felles α / β fold bevart i hele MH-klanen, det arketypiske katalytiske domenet er aminopeptidase Ap1 av Vibrio proteolyticus27. Dimeriseringdomenet vedtar en PDZ-lignende fold16 og kan ha, i tillegg til sin rolle i oligomeriseringen, en rolle i å kontrollere substrattilgang og binding i det indrehulrommet 11. Som den grunnleggende byggesteinen er en dimer, blir dodecamer ofte beskrevet som foreningen av seks dimers, hver dimer blir plassert på hver kant av tetrahedron16. Oligomeriseringen av M42-aminopeptidasene er avhengig av tilgjengeligheten av metallkofaktorene. Divalente metallioner, ofte Zn2+ og Co2+, er katalytisk involvert i peptidbindingen og hydrolysen. De finnes i to forskjellige bindingssteder, nemlig M1 og M2 nettsteder. De to metallionene kjører og finjusterer også oligomeriseringen som demonstrert for PhTET2, PhTET3, PfTET3 og TmPep105011,24,28,29. Når metallkofaktorene er tømt, demonteres dodecameren i dimers, som i PhTET2, PhTET3 og TmPep105011,16,28eller til og med monomerer, som i PhTET2 og PfTET324,29.
Presentert her er en protokoll som brukes for å studere strukturene til TmPep1050 oligomers. Denne protokollen er et sett med vanlige metoder, inkludert proteinrensing, proteolytisk aktivitetsscreening, krystallisering, røntgendiffraksjon og molekylær erstatning. Finesser som er iboende til å håndtere metalloenzymer, protein oligomerisering, proteinkrystallisering og molekylær erstatning er vektlagt. Et tilfelle av studier er også presentert for å vise om TmPep1050 dodecamers kan ytterligere dissosiere til monomerer eller ikke. For å løse dette spørsmålet har en TmPep1050-variant, TmPep1050H60A H307A, blitt studert hvis metallbindingssteder er svekket ved å mutere His-60 (M2-området) og His-307 (M1-området) til Ala-rester. Denne protokollen kan innkvarteres for å studere andre M42 aminopeptidaser eller metalloenzymer med morfoein-lignende atferd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13, 137-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://www.ccp4.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen II</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyXtal 15-well tool</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>132007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli PPY strain</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>see reference 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli XL1 blue strain</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Standard</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1511901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litholoops</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine-p-nitroanilide</td>
			<td>Bachem AG</td>
			<td>40010720025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neggia plugin</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>N/A</td>
			<td>visit https://www.dectris.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBAD-TOPO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K430001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www.phenix-online.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Phe</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17014702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Q</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17094705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17104301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima MSB8 strain</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 43589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TmCD00089984</td>
			<td>DNASU Plasmid Repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xdsme</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://github.com/legrandp/xdsme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

M42 aminopeptidaser danner funksjonelt aktive komplekser laget av 12 underenheter. Deres monteringsprosess ser ut til å være regulert av deres metallionkofaktorer som utløser en dimer-dodecamer overgang. Ved binding av metallion forekommer flere strukturelle modifikasjoner på det aktive stedet og på interaksjonsgrensesnittet, og former dimers for å fremme selvmonteringen. For å observere slike modifikasjoner må stabile oligomerer isoleres før strukturstudier. Rapportert her er en metode som tillater rensing av stabile dodecamers og dimers av TmPep1050, en M42 aminopeptidase av T. maritima, og deres struktur bestemmelse av røntgenkrystallografi. Dimers ble utarbeidet fra dodecamers ved å fjerne metallioner med et chelating middel. Uten sin kofaktor ble dodecamers mindre stabile og ble fullstendig dissosiert ved oppvarming. De oligomeriske strukturene ble løst ved den enkle molekylære erstatningstilnærmingen. For å illustrere metodikken presenteres strukturen til en TmPep1050-variant, helt svekket i metallionbinding, som ikke viser ytterligere nedbryting av dimers til monomerer.

For å studere en mulig dodecamer dissosiasjon til monomerer i TmPep1050, ble His-60 og His-307 codons erstattet av alaninkodon ved hjelp av et syntetisk gen. Dette genet ble deretter klonet i pBAD vektor for uttrykk og rensing av den tilsvarende TmPep1050-varianten senere kalt TmPep1050H60A H307A. Størrelse eksklusjon kromatografi (Figur 3B) viste at renset protein hadde en tilsynelatende molekylvekt på 56 kDa (molekylvekt av monomer er 36,0 kDa). En lignende tilsynelatende mol...

Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Denne protokollen er utviklet for å studere dimer-dodecamer overgangen av TmPep1050, en M42 aminopeptidase, på strukturelt nivå. Det er en enkel rørledning som starter fra proteinrensing til røntgendatabehandling. Krystalllogenese, datasettindeksering og molekylær erstatning har blitt vektlagt gjennom et tilfelle av studier, TmPep1050H60A H307A-variant.

Røntgenkrystallografi for å studere oligomerisk tilstand overgang av Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Denne protokollen forenkler studiet av aminopeptidaser med forskjellige oligomeriske tilstander og oligomeriseringsavhengige aktiviteter som balanseres mellom inaktive dimers og aktive dodecamers. Denne konvensjonelle teknikken kan enkelt utføres i alle laboratorier. Og bortsett fra å kreve tilgang til en strålelinje eller røntgenkrystallografi anlegg, krever ikke spesielle enheter.Med noen tilpasning kan denne metoden brukes på et annet protein med en aktivitet eller funksjon som er avhengig av graden av oligomerisering. For å behandle røntgendataene må brukerne ha en minimal forståelse av krystallografi. Vi inviterer brukere til å følge opplæring, besøke XDS Wiki, og å se Phenix tutorials.For å utføre en aktivitetsanalyse, legg til 25 mikroliter på 100 mM L-Leucine p-Nitroanilide til 965 mikroliter på 50 millimolar MOPS, 250 mikromolar kobolt to klorid og 10% metanol Pre inkubere reaksjonsblandingen i et 75 grader Celsius tørt bad, før du fortynner enzymet til en mikromolar endelig konsentrasjon med ytterligere 50 millimolar MOPS. Deretter legger du til 10 mikroliter av ett mikromolarenzym til reaksjonsblandingen og virvler den resulterende løsningen før du returnerer reaksjonen til 75 grader Celsius tørt bad i ikke mer enn en time. Når oppløsningen har blitt gul, stopp reaksjonen med en milliliter 20% sur syre og vortex blandingen før den avkjøles til romtemperatur.Deretter overfører du en aliquot av reaksjonsblandingen til en spektrofotometercelle og leser absorberene ved 410 nanometer mot en inkubert reaksjonsblanding uten enzym, som en negativ kontroll. For apoenzympreparat, tilsett 10 mikroliter av 1, 10-fenantroid lagerløsning til 890 mikroliter på 50 millimolar MOPS, 0,5 molar ammoniumsulfat og 100 mikroliter renset TmPep1050. Kontroller aktivitetstapet ved hjelp av aktivitetsanalysen som vist uten tilsetning av kobolt toklorid.Etter analysen, overfør prøven til et dialyserør og dialyser prøven mot 200 milliliter på 50 millimolar MOPS og 0,5 molar ammoniumsulfat ved fire grader Celsius. Byr dialysatet med frisk buffer tre ganger i løpet av 48-timers dialyse og samle prøve fra dialyserøret. Bruk ultrafiltreringsenheter med en 30 kilodalton cutoff, konsentrat prøven tilbake til 100 mikroliter og kontroller konsentrasjonen på et nanovolumspektrofotometer ved 280 nanometer.For å forberede dimers fortynne apoenzymet til en mikromolar konsentrasjon i 50 millimolar MOPS og 0,5 molar ammoniumsulfat, og inkubere reaksjonen i to timer i et 75 grader Celsius tørt bad. Konsentrat deretter enzymprøven til når minst 50 mikroliterkonsentrasjon og kontrollerer den molekylære vekten etter størrelsesekskludering kromatografi. For å forbedre formen, størrelsen og krystalliniteten til proteinkrys krystallene, legg til riktig volum av optimalisert krystalliseringsløsning til en dråpe krystaller for å bringe krystalldråpevolumet til 10 mikroliter.Overfør dråpen til et 1,5 milliliter mikrorør og tilsett 90 flere mikroliter krystalliseringsløsning til den seedede brønnen. For hver frøfortynning, tilsett 500 mikroliter krystalliseringsreagens per brønn til riktig antall brønner i en krystalliseringsplate og bland to mikroliter proteinprøve med to mikroliter krystalliseringsreagens og 0,2 mikroliter frø i en krystalliseringsstøtte per brønn. Fest deretter støttene på hver brønn av krystalliseringsreagens.For krystallplukking, fyll et bad med flytende nitrogen og stup eventuelle hetteglass eller kurv som brukes til prøvehåndtering i nitrogenet. Håndtering av flytende nitrogen er farlig det kan forårsake alvorlige frostskader. Pass på å bruke riktig individuell beskyttelse som kryogene hansker og vernebriller.Sett opp prøveplukkingsløkker av forskjellige størrelser i henhold til krystallstørrelsen, og bruk en kikkert til å velge en dråpe som inneholder krystaller. Bruk deretter en løkke til å forsiktig velge en isolert krystall fra en brønn og umiddelbart stupe løkken i flytende nitrogen før du plasserer løkken i et passende hetteglass. Hvis du vil måle punktintensiteter for diffraksjon, oppretter du en mappe der XDS skal kjøres og finne banen til bildene.Hvis du vil kjøre xdsme, skriver du inn kommandoen i et terminalvindu. Etter at XDS er avsluttet jobben sjekke riktig lp-fil og oppmerksom på sannsynligheten for plass gruppe fastsettelse, data fullstendighet, høyeste oppløsning, krystall mosaikkitet og datakvalitet. Når du har sjekket XDS meningsløs logg for å få sannsynligheten for plassgrupper, bruk kommandoene til å kjøre xdsme med forskjellige plassgruppeløsninger foreslått av XDS, i en egen mappe for å unngå å overstyre den forrige prosessen.Når du har valgt den beste løsningen basert på datastatistikken, skriver du inn kommandoene for å kjøre XSCALE og XDSCONV. For å bestemme fasen uten et uregelmessig spredningselement, bruk 4P X, Y-koordinater, for å forberede startmodellen for molekylær utskifting. Fra PDB-filen bruker du Phenix PDB-filredigeringsprogrammet til å trekke ut A-monomeren og avkorte aminosyrene i alanin.Kjør X triaged med refleksjonsfilen generert av XDSCONV og sekvensen som innganger. Sjekk loggfilen fra Xtriage. Legg merke til fullstendigheten, antall underenheter i den asymmetriske enheten, anisotropien, tilstedeværelsen av isringer og twinning-forekomsten.Hvis du vil kjøre Phaser-MR i Phenix for molekylær erstatning, velger du refleksjonsfilen, sekvensen og den første 4P seks Y-modellen avkortet i polyalanin og klikker Kjør. ved ferdigstillelse, sjekk om en modell er funnet og sjekk poengsummen for molekylær erstatning. En oversettelsesfaktor Z score på minst åtte, indikerer at løsningen er definitivt riktig.Når du har bestemt fasen ved molekylær erstatning, velger du Kjør automatisk bygging og klikker Kjør. Alle nødvendige filer vil bli automatisk lagt til. Når du er ferdig, kontrollerer du modellen i COOT og bygger og finjusterer modellen manuelt, i henhold til kartet for elektrontetthet i COOT.Ved hjelp av denne modellen, sekvensen og diffraksjonsdataene som innganger, finjusterer den manuelt kurerte modellen i Phenix, med henvisning til Phenix for å bidra til å velge riktig strategi. Etter raffinement sjekke resultatene, raffinement gratis og raffinement arbeid må reduseres. MolProbity indikatorer må respekteres og outliers med lav reell plass korrelasjon, må være begrenset.Når den beste raffinerte modellen er generert, kjører du MolProbity på serveren og kontrollerer eventuelle outliers identifisert av programmet. Størrelse eksklusjon kromatografi kan brukes til å bestemme den tilsynelatende molekylvekten av renset protein. Krystalliseringstilstanden til peptidet, kan optimaliseres ved å variere pH versus PEG-konsentrasjonen rundt tilstanden til dimeren.For eksempel ble de beste TmPep1050 H60A H307A-krystallene oppnådd i 0,1 molarnatriumsitrat med en pH på 5,2 og 20% PEG 3350 konsentrasjon, etter en syklus med mikrosåing for å forbedre mikrokrystalliniteten. I denne analysen viste dataindeksering at romgruppen til TmPep1050 H60A H307A-krystallen var C2221, men XDS foreslo en annen løsning, MP-romgruppen. Strukturen til TmPep1050 H60A H307A, kunne fullføres etter flere sykluser med automatisert og manuell raffinement.Bekrefter den oligomeriske tilstanden med en grensesnittoverflate på 1, 710 firkantede angstroms mellom både monomerer og en fri energi av grensesnittdannelse på minus 16,2 kilokalorier per mol. Her kan et nærbilde av TmPep1050 H60A H307A aktivt sted sammenlignet med det aktive stedet for TmPep1050 dimer og dodecamer observeres. Når du bygger en modell, må du bare bygge det du ser i elektrontettheten for å unngå over tolkning, dataene og ta deg tid til å polere modellen din.Den molekylære vekten av dimer og dodecamer kan også bestemmes av innfødt massespektrometri. Og metodene kan være nyttige for å oppdage overgang oligomers.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Utarbeidelse og innlevering av Protein microcrystals i lipidic Cubic fase for Serial femtosecond Krystallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Kombinere Røntgenkrystallografi med liten vinkel X-Ray spredning modell ustrukturert regioner i Nsa1 fra S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakteristikk av glykoproteiner med immunglobulin Fold av Røntgenkrystallografi og Biofysiske teknikker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle studier av makromolekyler i løsning med liten vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En alt-i-ett sample holder for makro molekylære X-ray Crystallography med minimal bakgrunn spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cell kultur på Silicon nitride membraner og Cryopreparation for Synchrotron X-ray fluorescens nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga Maritima membran bundne Pyrophosphatase hemmere

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimalisering av veksten av endothiapepsinkrystaller for serielle krystallografieksperimenter

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

De automatiserte krystallografirørledningene ved EMBL HTX-anlegget i Grenoble

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Høy gjennomstrømningsscreening for å oppnå krystalltreff for proteinkrystallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...