Name: x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00
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Agradecemos a Martine Roovers por revisar este documento y dar comentarios constructivos. El acceso a la línea de haz Próxima 2 (sincrotrón SOLEIL) estaba dentro de los grupos de asignación de bloques 20151139.

1. Producción y purificación del recombinante TmPep1050
NOTA: A continuación se describe el procedimiento de clonación y purificación de tmpep1050 de tipo salvaje adaptado de un estudio anterior11. Alternativamente, la clonación se puede hacer usando un gen sintético. Para generar variantes TmPep1050, se puede realizar mutagénesis dirigida por el sitio siguiendo, por ejemplo, las reacciones de imprimación única en el método30del protocol...

El protocolo descrito aquí permite comprender la transición dimer-dodecamer de TmPep1050 a nivel estructural. La metodología fue experimentada anteriormente para determinar la estructura de ambos oligómeros TmPep105011. El paso más difícil fue encontrar condiciones que promuevan la disociación de los dodecamers en dimers estables. Tales condiciones tenían que ser lo suficientemente suaves como para permitir la reasociación de los dimers en los dodecamers cuando se añadió el cofactor de ...

La oligomerización es un proceso predominante que dicta las funciones biológicas de muchas proteínas. En Escherichia coli, se estima que sólo el 35% de las proteínas son monoméricas1. Algunas proteínas, llamadas morfeínas, pueden incluso adoptar varios estados oligoméricos con subunidades que tienen una estructura distinta en cada estado oligomérico2. La transición entre sus estados oligoméricos es a menudo un medio para regular la actividad proteica ya que cada estado oligomérico puede tener una actividad o función específica diferente. Varios ejemplos de morfeeeinas han sido bien documentados en la literatura, en particular el porphobilinogen synthase3, HPr kinasa/phosphatase4, Lon proteasa5, lactato deshidrogenasa6, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa7, pirateuvasa8, cito de lactato9, y ribonusa10 . Recientemente, describimos el M42 aminopeptidasa TmPep1050, otro ejemplo de enzima con comportamiento similar a la morfeína, cuya actividad depende de sus estados oligoméricos11. La transición entre sus estados oligoméricos está mediada por sus cofactores metálicos que inducen varias modificaciones estructurales de las subunidades.
La familia M42 aminopeptidasa pertenece al clan MH12,13,y se distribuye ampliamente entre Bacterias y Archaea14. Los aminopeptidases M42 son enzimas dinucleares genuinas degradando péptidos hasta 35 residuos de aminoácidos en longitud15. Adoptan una peculiar estructura en forma de tetraedro hecha de 12 subunidades con sus sitios activos orientados hacia una cavidad interna. Tal disposición se describe a menudo como una nano-compartimentación de la actividad para evitar la proteólisis incontrolada. La función fisiológica de las aminopeptidasas M42 puede estar asociada con el proteosoma, péptidos hidrolizantes resultantes de la degradación de proteínas16,17. Pyrococcus horikoshii posee cuatro Aminopeptidases M42, cada uno presentando especificidades distintas pero complementarias18,19,20,21. Singularmente, heterocomplejos hechos de dos tipos diferentes de subunidades se han descrito en P. horikoshii, sugiriendo la existencia de complejos peptidasome22,23.
Varias estructuras de M42 aminopeptidases se han descrito en la literatura11,16,18,19,20,24,25,26. La subunidad se compone de dos dominios distintos, un dominio catalítico y un dominio de dimerización. El dominio catalítico adopta un pliegue común α/β conservado en todo el clan MH, siendo el dominio catalítico arquetípico la aminopeptidasa Ap1 de Vibrio proteolyticus27. El dominio de dimerización adopta un pliegue similar a laPDS 16 y puede tener, además de su papel en la oligomerización, un papel en el control del acceso al sustrato y la unión en la cavidad interna11. Como el bloque de construcción básico es un dimer, el dodecamer se describe a menudo como la asociación de seis dimers, cada dimer se coloca en cada borde del tetraedro16. La oligomerización de los aminopeptidases M42 depende de la disponibilidad de sus cofactores metálicos. Los iones metálicos divalentes, a menudo Zn2+ y Co2+,participan catalíticamente en la unión a péptidos y la hidrólisis. Se encuentran en dos sitios de enlace distintos, a saber, los sitios M1 y M2. Los dos iones metálicos también conducen y afinan finamente la oligomerización como se demuestra para PhTET2, PhTET3, PfTET3 y TmPep105011,24,28,29. Cuando se agotan los cofactores metálicos, el dodecamer se desmonta en dimers, como en PhTET2, PhTET3, y TmPep105011,16,28,o incluso monómeros, como en PhTET2 y PfTET324,29.
Aquí se presenta un protocolo utilizado para estudiar las estructuras de los oligómeros TmPep1050. Este protocolo es un conjunto de métodos comunes que incluyen purificación de proteínas, cribado de actividad proteolítica, cristalización, difracción de rayos X y reemplazo molecular. Se enfatizan las sutilezas inherentes al tratamiento de las metaloenzimas, la oligomerización de proteínas, la cristalización de proteínas y el reemplazo molecular. También se presenta un caso de estudio para mostrar si los dodecamers TMPep1050 pueden disociarse aún más en monómeros o no. Para abordar esta pregunta, se ha estudiado una variante TmPep1050, TmPep1050H60A H307A,cuyos sitios de unión de metales se ven deteriorados al mutar His-60 (sitio M2) e His-307 (sitio M1) a los residuos de Ala. Este protocolo puede ser acomodado para estudiar otros Aminopeptidases M42 o cualquier metaloenzimas con comportamiento morfeina-como.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13, 137-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://www.ccp4.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen II</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyXtal 15-well tool</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>132007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli PPY strain</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>see reference 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli XL1 blue strain</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Standard</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1511901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litholoops</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine-p-nitroanilide</td>
			<td>Bachem AG</td>
			<td>40010720025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neggia plugin</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>N/A</td>
			<td>visit https://www.dectris.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBAD-TOPO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K430001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www.phenix-online.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Phe</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17014702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Q</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17094705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17104301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima MSB8 strain</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 43589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TmCD00089984</td>
			<td>DNASU Plasmid Repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xdsme</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://github.com/legrandp/xdsme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

Los aminopeptidases M42 forman complejos funcionalmente activos hechos de 12 subunidades. Su proceso de montaje parece estar regulado por sus cofactores de iones metálicos que desencadenan una transición dimer-dodecamer. Tras la unión de iones metálicos, se producen varias modificaciones estructurales en el sitio activo y en la interfaz de interacción, dando forma a los dimers para promover el autoensamble. Para observar tales modificaciones, los oligómeros estables deben aislarse antes del estudio estructural. Reportado aquí es un método que permite la purificación de dodecamers estables y dimers de TmPep1050, un M42 aminopeptidasa de T. maritima,y su determinación de la estructura por cristalografía de rayos X. Los dimers se preparaban a partir de dodecamers mediante la eliminación de iones metálicos con un agente quelante. Sin su cofactor, los dodecamers se volvieron menos estables y se disociaron por completo al calentarse. Las estructuras oligoméricas fueron resueltas por el enfoque de reemplazo molecular sencillo. Para ilustrar la metodología, la estructura de una variante TmPep1050, totalmente deteriorada en la unión de iones metálicos, se presenta mostrando ninguna descomposición adicional de dimers a monómeros.

Para estudiar una posible disociación dodecamer en monómeros en TmPep1050, los codones His-60 e His-307 fueron reemplazados por codón de alanina usando un gen sintético. Este gen fue clonado en vector pBAD para la expresión y purificación de la variante tmPep1050 correspondiente posteriormente denominada TmPep1050H60A H307A. La cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 3B) mostró que la proteína purificada tenía un peso molecular aparente de 56 kDa (el peso molecula...

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X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Este protocolo ha sido desarrollado para estudiar la transición dimer-dodecamer de TmPep1050, un M42 aminopeptidasa, a nivel estructural. Es una tubería sencilla que va desde la purificación de proteínas hasta el procesamiento de datos de rayos X. La cristalgénesis, la indexación de conjuntos de datos y el reemplazo molecular se han enfatizado a través de un caso de estudio, la variante TmPep1050H60A H307A.

Cristalografía de rayos X para estudiar la transición del estado oligomérico de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidasse TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Este protocolo facilita el estudio de aminopeptidases con diferentes estados oligoméricos y actividades dependientes de la oligomerización que se equilibran entre los dimers inactivos y los dodecamers activos. Esta técnica convencional se puede realizar fácilmente en cualquier laboratorio. Y además de requerir acceso a una instalación de cristalografía de rayos X o de línea de haz, no requiere dispositivos especiales.Con alguna adaptación, este método se puede aplicar a cualquier otra proteína con una actividad o función que dependa de su grado de oligomerización. Para procesar los datos de rayos X, los usuarios deben tener una comprensión mínima de la cristalografía. Invitamos a los usuarios a seguir los entrenamientos, a visitar XDS Wiki, y a ver tutoriales de Phoenix.Para realizar un ensayo de actividad, añadir 25 microlitros de 100 mM de L-Leucina p-Nitroanilida a 965 microlitros de 50 MOPS milimélares, 250 micromolares de cobalto dos cloruro y 10%metanol Pre incubar la mezcla de reacción en un baño seco de 75 grados Celsius, antes de diluir la enzima a una concentración de micromolar final con 50 milivores MOPmolar adicionales. A continuación, añada 10 microlitros de una enzima micromolar a la mezcla de reacción y vórtice la solución resultante antes de devolver la reacción al baño seco de 75 grados Centígrados durante no más de una hora. Cuando la solución se haya vuelto amarilla, detenga la reacción con un mililitro de ácido ácido 20% y vórtice la mezcla antes de permitir que se enfríe a temperatura ambiente.A continuación, transfiera una alícuota de la mezcla de reacción a una célula espectrofotómetro y lea los absorbentes a 410 nanómetros contra una mezcla de reacción incubada sin enzima, como control negativo. Para la preparación de laspoenzimas, agregue 10 microlitros de 1, 10-fenantrolina solución de stock a 890 microlitros de 50 MOPS milimélares, 0.5 sulfato de amonio molar y 100 microlitros de tmPep1050 purificados. Compruebe la pérdida de actividad utilizando el ensayo de actividad como se ha demostrado sin la adición de cobalto de dos cloruros.Después del ensayo, transfiera la muestra a un tubo de diálisis y marque la muestra contra 200 mililitros de 50 MOPS mililolares y 0,5 sulfatos de amonio molar a cuatro grados centígrados. Intercambie el dialato con un tampón fresco tres veces durante la diálisis de 48 horas y recoja la muestra del tubo de diálisis. Usando unidades de ultrafiltración con un corte de 30 kilodalton, concentre la muestra de nuevo en 100 microlitros y compruebe la concentración en un espectrofotómetro de nano volumen a 280 nanómetros.Para preparar los dimers diluir la apoenzima a una concentración de un micromolar en 50 MOPS mililolar y 0,5 sulfato de amonio molar, e incubar la reacción durante dos horas en un baño seco de 75 grados Centígrados. A continuación, concentre la muestra enzimática en la concentración de al menos 50 microlitros y compruebe la cromatografía de exclusión de peso molecular por tamaño. Para mejorar la forma, el tamaño y la cristalinidad de los cristales proteicos, añada el volumen adecuado de solución de cristalización optimizada a una gota de cristal para llevar el volumen de gotas de cristal a 10 microlitros.Transfiera la gota a un microtubo de 1,5 mililitros y añada 90 microlitros más de solución de cristalización al pozo de semillas. Para cada dilución de semillas, agregue 500 microlitros de reactivo de cristalización por pozo al número adecuado de pozos en una placa de cristalización y mezcle dos microlitros de muestra de proteína con dos microlitros de reactivo de cristalización y 0,2 microlitros de semillas en un soporte de cristalización por pozo. A continuación, fije los soportes a cada pozo de reactivo de cristalización.Para la recolección de cristales, llene un baño con nitrógeno líquido y sumerja los viales o la cesta utilizados para la manipulación de muestras en el nitrógeno. El manejo de nitrógeno líquido es peligroso puede causar congelaciones severas. Asegúrese de usar protecciones individuales adecuadas como guantes criogénicos y gafas protectoras para los ojos.Configure bucles de selección de muestras de diferentes tamaños según el tamaño del cristal y utilice un binocular para seleccionar una gota que contenga cristales. A continuación, utilice un bucle para seleccionar suavemente un cristal aislado de un pozo e inmediatamente sumerja el bucle en nitrógeno líquido antes de colocar el bucle en un vial adecuado. Para medir las intensidades de punto de difracción, cree una carpeta desde la que se ejecutará XDS y localice la ruta de acceso a las imágenes.Para ejecutar xdsme, introduzca el comando en una ventana de terminal. Una vez finalizado XDS, compruebe el archivo lp correcto y anote la probabilidad de la determinación del grupo espacial, la integridad de los datos, la resolución más alta, la mosaico de cristales y la calidad de los datos. Después de comprobar el registro sin sentido XDS para obtener la probabilidad de grupos de espacio, utilice los comandos para volver a ejecutar xdsme con diferentes soluciones de grupos de espacio propuestas por XDS, en una carpeta independiente para evitar reemplazar el proceso anterior.Después de seleccionar la mejor solución basada en las estadísticas de datos, escriba los comandos para ejecutar XSCALE y XDSCONV. Para determinar la fase sin un elemento de dispersión anómalo, utilice coordenadas 4P X, Y, para preparar el modelo inicial para el reemplazo molecular. Desde el archivo PDB, utilice el editor de archivos Phenix PDB para extraer el monómero A y truncar sus aminoácidos en alanina.Ejecute X triaged con el archivo de reflexión generado por XDSCONV y la secuencia como entradas. Compruebe el archivo de registro de Xtriage. Tenga en cuenta la integridad, el número de subunidades en la unidad asimétrica, la anisotropía, la presencia de anillos de hielo y la ocurrencia de hermanamiento.Para ejecutar Phaser-MR en Phoenix para su reemplazo molecular, seleccione el archivo de reflexión, la secuencia y el modelo 4P seis Y inicial truncado en polialanina y haga clic en Ejecutar. al finalizar, compruebe si se ha encontrado un modelo y compruebe la puntuación del reemplazo molecular. Una puntuación Z del factor de traducción de al menos ocho, indica que la solución es definitivamente correcta.Después de determinar la fase por reemplazo molecular, seleccione Ejecutar compilación automática y haga clic en Ejecutar. Todos los archivos necesarios se añadirán automáticamente. Al finalizar, compruebe el modelo en COOT y construya y refina el modelo manualmente, de acuerdo con el mapa de densidad de electrones en COOT.Usando este modelo, la secuencia y los datos de difracción como entradas, refinar el modelo curado manualmente en Phoenix, refiriéndose a Phoenix para ayudar a seleccionar la estrategia correcta. Después de la comprobación de refinamiento de los resultados, el trabajo libre de refinamiento y refinamiento debe disminuir. Los indicadores MolProbity deben ser respetados y los valores atípicos con baja correlación de espacio real, deben ser limitados.Cuando se haya generado el mejor modelo refinado, ejecute MolProbity en el servidor y compruebe los valores atípicos identificados por el programa. La cromatografía de exclusión de tamaño se puede utilizar para determinar el peso molecular aparente de la proteína purificada. La condición de cristalización del péptido, se puede optimizar variando el pH frente a la concentración de PEG alrededor de la condición del dimer.Por ejemplo, los mejores cristales tmPep1050 H60A H307A, se obtuvieron en citrato de sodio molar 0.1 con un pH de 5.2 y 20%PEG 3350 de concentración, después de un ciclo de micro siembra para mejorar la micro cristalinidad. En este análisis, la indexación de datos mostró que el grupo espacial del cristal TmPep1050 H60A H307A era C2221, pero XDS propuso otra solución, el grupo espacial MP. La estructura de TmPep1050 H60A H307A, podría completarse después de varios ciclos de refinamiento automatizado y manual.Confirmando el estado oligomérico con una superficie de interfaz de 1.710 angstroms cuadrados entre ambos monómeros y una energía libre de formación de interfaz de menos 16,2 kilocalorías por lunar. Aquí, se puede observar un primer plano del sitio activo TmPep1050 H60A H307A en comparación con el sitio activo del dimer TmPep1050 y dodecamer. Al construir un modelo, tenga cuidado de construir solo lo que se ve en la densidad de electrones para evitar la interpretación excesiva, los datos y tomarse el tiempo para pulir su modelo.El peso molecular del dimer y el dodecamer también se puede determinar mediante espectrometría de masas nativa. Y los métodos pueden ser útiles para detectar oligómeros de transición.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Preparación y entrega de microcristales de proteínas en fase cúbica lipídico para la serie de femtosegundo Cristalografía

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Investigación

Bioquímica

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caracterización de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por cristalografía de rayos x y técnicas biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Estudios estructurales de las macromoléculas en solución mediante dispersión de rayos-x de ángulo pequeño

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