Name: x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

Vi tackar Martine Roovers för korrekturläsning av detta dokument och ger konstruktiva kommentarer. Access till Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) var inom Block Allocation Groups 20151139.

1. Produktion och rening av rekombinant TmPep1050
OBS: Härefter beskrivs kloningsproceduren och rening av wild-type TmPep1050 anpassad från en tidigare studie11. Alternativt kan kloningen göras med hjälp av en syntetisk gen. För att generera TmPep1050-varianter kan site directed mutagenesis utföras efter till exempel enkelprimerreaktionerna i metoden för parallel protocol (SPRINP)30. Reningsprotokollet kan användas för TmPep1050-varianter....

Det protokoll som beskrivs häri gör det möjligt att förstå dimer-dodecamer övergången av TmPep1050 på strukturell nivå. Metoden upplevdes tidigare för att fastställa strukturen för både TmPep1050 oligomerer11. Det mest utmanande steget var att hitta villkor som främjar dissociation av dodecamers i stabila dimers. Sådana villkor måste vara mild nog att tillåta reassociation av dimers i dodecamers när metalljon kofaktorn lades till. Avskiljandet av oligomers var också ett kritiskt...

Oligomerisering är en dominerande process som dikterar de biologiska funktionerna hos många proteiner. I Escherichia coli, uppskattas det att endast 35% av proteinerna är monomeriska1. Vissa proteiner, som kallas morpheeins, kan även anta flera oligomeric stater med underenheter har distinkt struktur i varje oligomeric tillstånd2. Övergången mellan deras oligomeric tillstånd är ofta ett medelvärde för att reglera protein aktivitet som varje oligomeric tillstånd kan ha en annan specifik aktivitet eller funktion. Flera exempel på morfeeiner har dokumenterats väl i litteraturen, 4 , Lonprotease5,lakt dehydrogenas6, glyceraldehyde-3-fosfat dehydrogenas7, pyruvatkins8, citratsyntas9, och ribonucase A10. Nyligen beskrev vi M42 aminopeptidase TmPep1050, ett annat exempel på enzym med morpheein-liknande beteende, vars aktivitet beror på dess oligomeric stater11. Övergången mellan dess oligomeric tillstånd förmedlas av dess metalliska kofaktorer som inducerar flera strukturella ändringar av underenheterna.
M42 aminopeptidase familjen tillhör MHklanen 12,13, och är allmänt fördelad bland Bakterier och Archaea14. Den M42 aminopeptidases är äkta dinukleära enzymer förnedrande peptider upp till 35 aminosyra rester i längd15. De antar en säregen tetraederformad struktur gjord av 12 subenheter med sina aktiva platser orienterade mot en inre hålighet. Ett sådant arrangemang beskrivs ofta som en nano-compartmentalization av verksamheten för att undvika okontrollerad proteolys. Den fysiologiska funktionen hos M42-aminopeptidaserna kan vara förknippad med de proteasom, hydrolyserande peptider somhärrör från proteinnedbrytning 16,17. Pyrococcus horikoshii besitter fyra M42 aminopeptidases, var och en presenterar distinkta men kompletterande särdrag18,19,20,21. Singularly, heterokomplex gjorda av två olika typer av underenheter har beskrivits i P. horikoshii, vilket tyder på förekomsten av peptidasome komplex22,23.
Flera strukturer av M42 aminopeptidases har beskrivits ilitteraturen 11,16,18,19,20,24,25,26. Underenheten är sammansatt av två distinkta domäner, en katalytisk domän och en dimeriseringsdomän. Den katalytiska domänen antar en gemensam α/β faldig bevaras i hela MH klanen, den arketypiska katalytiska domänen är aminopeptidase Ap1 av Vibrio proteolyticus27. Dimeriseringsdomänen antar en PDZ-liknande fold16 och kan ha, förutom sin roll i oligomeriseringen, en roll i att kontrollera substratåtkomst och bindning i den inre håligheten11. Eftersom den grundläggande byggstenen är en dimer, är dodecamer ofta beskrivs som sammanslutning av sex dimers, varje dimer placeras vid varje kant av tetraeder16. Den oligomerization av M42 aminopeptidases förlitar sig på tillgången på dess metall kofaktorer. Divalent metalljoner, ofta Zn2+ och Co2+, är katalytiskt involverade i peptidbindningen och hydrolysen. De finns i två distinkta bindningsplatser, nämligen M1- och M2-platser. De två metalljonerna kör också ochfinjusteraroligomeriseringen som den demonstreras för PhTET2, PhTET3, PfTET3, och TmPep1050 11,24,28,29. När metallkofaktorerna är uttömda, de isär de dodecamer i dimers, som i PhTET2, PhTET3, och TmPep105011,16,28, eller ens monomerer, som i PhTET2 och PfTET324,29.
Presenteras här är ett protokoll som används för att studera strukturerna i TmPep1050 oligomerer. Detta protokoll är en uppsättning vanliga metoder inklusive protein rening, proteolytic aktivitet screening, kristallisering, röntgen diffraktion, och molekylär ersättning. Subtiliteter inneboende att hantera metalloenzymer, protein oligomerization, protein kristallisering och molekylär ersättning betonas. Ett fall av studie presenteras också för att visa om TmPep1050 dodecamers kan ytterligare dissociate i monomerer eller inte. För att ta itu med denna fråga, en TmPep1050 variant, TmPep1050H60A H307A, har studerats vars metall bindningsställen är nedsatt genom att mutera His-60 (M2 plats) och His-307 (M1 plats) till Ala rester. Detta protokoll kan rymmas för att studera andra M42 aminopeptidases eller någon metalloenzymes med morpheein-liknande beteende.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13, 137-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70664-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://www.ccp4.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen I</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen II</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyXtal 15-well tool</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>132007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli PPY strain</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>see reference 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli XL1 blue strain</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4038-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Filtration Standard</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1511901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litholoops</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine-p-nitroanilide</td>
			<td>Bachem AG</td>
			<td>40010720025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natrix 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neggia plugin</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>N/A</td>
			<td>visit https://www.dectris.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td>
			<td>NeXtal</td>
			<td>130727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBAD-TOPO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K430001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://www.phenix-online.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 1</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt RX 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Phe</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17014702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source 15Q</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17094705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 prep grade</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17104301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima MSB8 strain</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 43589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TmCD00089984</td>
			<td>DNASU Plasmid Repository</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xdsme</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>visit https://github.com/legrandp/xdsme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray crystallography to study the oligomeric state transition of the thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

M42 aminopeptidases bildar funktionellt aktiva komplex gjorda av 12 subenheter. Deras monteringsprocess verkar regleras av deras metalljonkofaktorer som utlöser en dimer-dodecamer-övergång. Vid metalljonbindning förekommer flera strukturella modifieringar i den aktiva platsen och vid interaktionsgränssnittet, som formar dimrar för att främja självmonteringen. För att observera sådana modifieringar måste stabila oligomerer isoleras före strukturell studie. Rapporteras här är en metod som gör det möjligt att rening av stabila dodecamers och dimers av TmPep1050, en M42 aminopeptidase av T. maritima, och deras struktur bestämning genom röntgenkristallografi. Dimers var beredda från dodecamers genom att ta bort metalljoner med en kelatbildare. Utan sin kofaktor blev dodecamers mindre stabila och var helt dissocierade vid uppvärmning. De oligomeric strukturerna löstes genom den enkla molekylära ersättningsstrategin. För att illustrera metodiken presenteras strukturen hos en TmPep1050-variant, helt nedsatt i metalljonbindning, som inte visar någon ytterligare uppdelning av dimers till monomerer.

För att studera en eventuell dodecamer dissociation i monomerer i TmPep1050, hans-60 och hans-307 kodon ersattes av alanin kodon med hjälp av en syntetisk gen. Denna gen var sedan klonas i pBAD vektor för uttryck och rening av motsvarande TmPep1050 variant senare heter TmPep1050H60A H307A. Storlek uteslutning kromatografi (Figur 3B) visade att det renade proteinet hade en uppenbar molekylvikt på 56 kDa (molekylvikt av monomeren är 36,0 kDa). En liknande skenbar molekylvikt, 5...

Watch this Scientific Journal Video about X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 at JoVE.com

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Detta protokoll har utvecklats för att studera dimer-dodecamer övergången av TmPep1050, en M42 aminopeptidase, på den strukturella nivån. Det är en enkel pipeline som börjar från proteinrening till röntgendatabehandling. Crystallogenesis, data set indexering och molekylär ersättning har betonats genom ett fall av studie, TmPep1050H60A H307A variant.

X-Ray Kristallografi att studera oligomeric staten Övergång av Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Detta protokoll underlättar studiet av aminopeptidases med olika oligomeric tillstånd och oligomerization-beroende aktiviteter som är balanserad mellan inaktiva dimers och aktiva dodecamers. Denna konventionella teknik kan enkelt utföras i alla lab. Och bortsett från att kräva tillgång till en strållinje eller röntgen kristallografi anläggning, inte kräver speciella enheter.Med viss anpassning kan denna metod tillämpas på något annat protein med en aktivitet eller funktion som är beroende av dess grad av oligomerisering. För att bearbeta röntgendatan måste användarna ha en minimal förståelse av kristallografi. Vi inbjuder användare att följa utbildningar, att besöka XDS Wiki, och att titta på Phenix tutorials.För att utföra en aktivitetsanalys, tillsätt 25 mikroliter av 100 mM L-Leucin p-Nitroanilide till 965 mikroliter på 50 millimolar MOPS, 250 mikromolarkobolt tvåklorid och 10%metanol Pre incubate reaktionen mix i en 75 grader Celsius torrt bad, innan späda enzymet till en en mikromol slutlig koncentration med ytterligare 50 millimolar MOPS. Därefter lägger du till 10 mikroliter av ett mikromolarenzym till reaktionsblandningen och virlar den resulterande lösningen innan du returnerar reaktionen till 75 grader Celsius torrt bad i högst en timme. När lösningen har blivit gul, stoppa reaktionen med en milliliter av 20%sur syra och vortexa blandningen innan den kan svalna till rumstemperatur.Överför sedan en alikvot av reaktionsmixen till en spektrofotometercell och avläs absorbenterna vid 410 nanometer mot en inkuberad reaktionsmix utan enzym, som en negativ kontroll. För apoenzympreparat, tillsätt 10 mikroliter av 1, 10-fenanthroline stamlösning till 890 mikroliter på 50 millimolar MOPS, 0,5 molar ammoniumsulfat och 100 mikroliter av renad TmPep1050. Kontrollera aktivitetsförlusten med hjälp av aktivitetsanalysen som visats utan tillsats av kobolt tvåklorid.Efter analysen överför du provet till ett dialysrör och dialysera provet mot 200 milliliter på 50 millimolar MOPS och 0,5 molar ammoniumsulfat vid fyra grader Celsius. Byt dialysaten med färsk buffert tre gånger under 48 timmars dialys och samla in prov från dialysröret. Med hjälp av ultrafiltreringsenheter med en 30 kilodaltons cutoff koncentrerar du provet tillbaka till 100 mikroliter och kontrollerar koncentrationen på en nanovolymspektrofotometer vid 280 nanometer.För att förbereda dimers späda apoenzymet till en en mikromolarkoncentration i 50 millimolar MOPS och 0,5 molar ammoniumsulfat, och inkubera reaktionen i två timmar i ett 75 grader Celsius torrt bad. Koncentrera sedan enzymprovet till när minst 50 mikroliterkoncentration och kontrollera molekylvikten efter storleksbeknestkromatografi. För att förbättra form, storlek och kristallitet av proteinkristallerna, tillsätt lämplig volym av optimerad kristallisering lösning till en droppe kristaller för att få kristall droppvolymen till 10 mikroliter.Överför droppen till ett 1,5 milliliter mikrorör och tillsätt 90 fler mikroliter av kristalliseringslösning till den sådde brunnen. För varje fröutspädning, tillsätt 500 mikroliter av kristallisationsreagens per brunn till lämpligt antal brunnar i en kristallisationsplatta och blanda två mikroliter proteinprov med två mikroliter av kristalliseringsreagens och 0,2 mikroliter frön i en kristalliseringsstöd per brunn. Fixera sedan stöden på varje brunn av kristalliseringsreagens.För kristallplock, fyll ett bad med flytande kväve och kasta in eventuella injektionsflaska eller korg som används för provhantering i kvävet. Hantering av flytande kväve är farligt det kan orsaka allvarliga köldskador. Var noga med att bära ordentliga individuella skydd som kryogena handskar och skyddande ögonglasögon.Ställ in provplockningsslingor i olika storlekar enligt kristallstorleken och använd en kikare för att välja en droppe som innehåller kristaller. Använd sedan en slinga för att försiktigt välja en isolerad kristall från en brunn och omedelbart kasta slingan i flytande kväve innan du placerar slingan i en lämplig injektionsflaska. Om du vill mäta diffraktionsdekoriteter skapar du en mapp från vilken XDS kommer att köras och leta upp sökvägen till bilderna.Om du vill köra xdsme anger du kommandot i ett terminalfönster. Efter XDS har avslutat jobbet kontrollera rätt lp-fil och notera sannolikheten för rymdgruppen bestämning, data fullständighet, den högsta upplösningen, kristall mosaicity och datakvalitet. När du har kontrollerat XDS meningslösa loggen för att erhålla sannolikheten för utrymme grupper, använd kommandona för att köra om xdsme med olika utrymme grupplösningar som föreslagits av XDS, i en separat mapp för att undvika att åsidosätta den tidigare processen.När du har valt den bästa lösningen baserat på datastatistiken anger du kommandona för att köra XSCALE och XDSCONV. För att bestämma fasen utan en avvikande spridningsartikel, använd 4P X, Y-koordinater, för att förbereda startmodellen för molekylär ersättning. Från PDB-filen, använd Fileditorn Phenix PDB för att extrahera A monomeren och för att trunkera dess aminosyror i alanin.Kör X triaged med reflektionsfilen som genereras av XDSCONV och sekvensen som ingångar. Kontrollera loggfilen från Xtriage. Notera fullständigheten, antalet underenheter i den asymmetriska enheten, anisotropin, förekomsten av isringar och vänortsförekomsten.Om du vill köra Phaser-MR i Phenix för molekylär ersättning väljer du reflektionsfilen, sekvensen och start 4P sex Y-modellen trunkerad i polyalanin och klickar på Kör. efter avslutad, kontrollera om en modell har hittats och kontrollera poängen för den molekylära ersättningen. En översättningsfaktor Z-poäng på minst åtta, indikerar att lösningen är slutgiltigt korrekt.När du har fastställt fasen genom molekylär ersättning väljer du Kör Auto build och klickar på Kör. Alla de filer som krävs kommer automatiskt att läggas till. Vid färdigställande, kontrollera modellen i COOT och bygga och förfina modellen manuellt, enligt elektrontäthetskartan i COOT.Med hjälp av denna modell, sekvensen och de diffraktion data som ingångar, förfina manuellt kurerade modellen i Phenix, med hänvisning till Phenix att hjälpa till att välja rätt strategi. Efter förfining kontrollera resultaten, förfining fri och förfining arbete måste minska. MolProbity indikatorer måste respekteras och avvikare med låg verkliga utrymme korrelation, måste begränsas.När den bästa raffinerade modellen har genererats, kör MolProbity på servern och kontrollera eventuella extremvärden identifieras av programmet. Storlek uteslutningskromatografi kan användas för att bestämma den skenbara molekylvikten för det renade proteinet. Kristallisationen skick av peptiden, kan optimeras genom att variera pH kontra PEG koncentrationen runt tillståndet i dimer.Till exempel, den bästa TmPep1050 H60A H307A kristaller, erhölls i 0,1 molar natriumcitrat med ett pH på 5,2 och 20%PEG 3350 koncentration, efter en cykel av mikro sådd för att förbättra mikrokristalliteten. I denna analys visade dataindexering att rymdgruppen för TmPep1050 H60A H307A-kristallen var C2221, men XDS föreslog en annan lösning, MP-rymdgruppen. Strukturen på TmPep1050 H60A H307A, kunde slutföras efter flera cykler av automatiserad och manuell förfining.Bekräftar det oligomeriska tillståndet med en gränssnittsyta på 1, 710 kvadratiska ångströms mellan både monomerer och en fri energi av gränssnittsbildning av minus 16,2 kilokalorier per mol. Här kan en närbild av TmPep1050 H60A H307A aktiva platsen jämfört med den aktiva platsen för TmPep1050 dimer och dodecamer observeras. När du bygger en modell noga med att bygga bara vad du ser i elektron densitet för att undvika över tolkning, data, och att ta sig tid att polera din modell.Molekylvikten för dimer och dodecamer kan också bestämmas av inhemska masspektrometri. Och metoderna kan vara användbara för att upptäcka övergångs oligomerer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Beredning och leverans av protein mikrokristaller i lipida kubiska fasen för Serial Femtosecond Kristallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Att kombinera röntgenkristallografi med små Angle X-Ray Scattering att modellera ostrukturerade regioner av Nsa1 från S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan av röntgenkristallografi och biofysiska tekniker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturella studier av makromolekyler i lösningen med små Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En allt-i-ett-provhållare för makro molekyl ära röntgenkristallografi med minimal bakgrunds spridning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cell odling på Kiselnitridmembran och Kryopreparation för Synchrotron röntgenfluorescens Nanoanalys

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening för Thermotoga maritima membran-bundna Pyrofosfatashämmare

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimera tillväxten av endotiapepsinkristaller för seriella kristallografiexperiment

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

De automatiserade kristallografiledningarna vid EMBL HTX-anläggningen i Grenoble

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening för att erhålla kristallträffar för proteinkristallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...