Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من جيمس واستير كينغ برنامج البحوث الطبية الحيوية (6JK03 و 20K07)، وبرنامج أبحاث السرطان Bankhead-Coley (4BF02 و 6BC03)، ووزارة الصحة في فلوريدا، ومؤسسة فلوريدا لسرطان الثدي، ومركز السرطان الصحي UF. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر الدكتور زاكاري أوكينغ والدكتور أندريا لين على دعمهما خلال عملية النشر.

1. في المختبر قبعة المقايسة
<ol><li>إعداد المخزن المؤقت ملاحظة: راجع الجدول 1 للحصول على وصفات المخزن المؤقت.<ol>
<li>إعداد 5x مخزن مؤقت للمحسان و 6x دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) وتخزينها عند -20 درجة مئوية. Aliquot SDS في 1 مل aliquots.</li>
		<li>إعداد 10x هلام SDS تشغيل العازلة و 10x TBST وتخزينها في ...

ليسين أستيلtransferases (KATs) أسيتيلات عدة بقايا ليسين على ذيول هيستون وعوامل النسخ لتنظيم النسخ الجيني2,3. وقد كشف العمل في العقدين الماضيين أن KATs ، مثل CBP / p300 ، PCAF و GCN5 ، تتفاعل مع عوامل النسخ oncogenic وتساعد على دفع نمو الورم في العديد من أنواع الأورام الصلبة...

ليسين أستيل ترانسفيراديس (KATs) تحفيز أستيل من بقايا ليسين على كل من البروتينات هيستون وغير هيستون1,2,3,4. كشفت الأبحاث الحديثة أن KATs ووظيفة الأسيتيل ترانسفيراز يمكن أن تعزز نمو الورم الصلب4،5،6،7،8،9. على سبيل المثال، بروتين الكريب الملزم (CBP)/p300 هما KATs البارالوجين التي تنظم العديد من مسارات الإشارات في السرطان2،3. CBP/p300 لديها جيدا تتميز هييتيلترانزفيراز (HAT) وظيفة وتحفيز هيستون 3 Lysine 27 أستيل (H3K27ac)2,4,5,10,11, علامة هامة لمعززات النشطة, مناطق المروج والنسخ الجيني النشط12,13,14. CBP/p300 بمثابة المنشطات المشاركة الحرجة Pro-growth signals pathways في الأورام الصلبة عن طريق تفعيل النسخ من أونكوجين من خلال أستيل من histyles وعوامل النسخ الأخرى4,9,15,16,17,18.9 نظرا لدورها في تطور الورم، CBP/p300 وغيرها من الـ KATs هي قيد التحقيق لتطوير مثبطات الرواية التي تمنع وظيفتها oncogenic4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 و GNE-049 تمثل محاولتين ناجحتين لتطوير مثبطات قوية ومحددة لCBP/p3004,9. ويجري حالياً فحص مثبطات إضافية لـ CBP/p300 وغيرها من الـ KATs.
ويجري الآن مسألة نوعية مثبطات KAT الموصوفة سابقا (KATi) في التشكيك، مع العديد من مثبطات الرياء الآثار المستهدفة وسوء توصيف21. ولذلك ، توصيف صارمة والتحقق من المرشحين المخدرات جديدة أمر ضروري لتطوير تحقيقات كيميائية عالية الجودة. المبينة هنا هي ثلاثة بروتوكولات التي تشكل خط أنابيب لفحص والتحقق بدقة من قوة وخصوصية رواية KATi ، مع التركيز بشكل خاص على تثبيط وظيفة HAT (HATi) من KATs. يستخدم CBP/p300 ومثبطاتها كأمثلة ، ولكن يمكن تكييف هذه البروتوكولات لغيرها من كاوت التي لها وظيفةHAT 7.
البروتوكول الأول هو في المختبر acetyltransferase (HAT) المقايسة التي تستخدم تنقية p300 وhistones في تفاعل أنبوب اختبار تسيطر عليها. هذا المقايسة بسيطة لأداء، هو فعالة من حيث التكلفة، ويمكن استخدامها لفحص المركبات في إعداد الإنتاجية المنخفضة، ولا تتطلب مواد مشعة. في هذا البروتوكول، يتم قياس p300 المؤتلفة lylyzes lysine acetylation على ذيول هيستون خلال فترة حضانة قصيرة ومستويات أسيتيل هيستون باستخدام إجراءات المناعة القياسية. يمكن إجراء التفاعل الأنزيمي في وجود أو عدم وجود مثبطات CBP/p300 لفحص المركبات التي تقلل من أستيلستون. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مقايسة HAT للتحقق مما إذا كانت المركبات الجديدة انتقائية لCBP/p300 من خلال تقييم نشاطها ضد غيرها من الكاتس المنقى، مثل PCAF. إن مقايسة HAT هي نقطة انطلاق ممتازة للتحقيق في مثبطات الرواية نظرًا لبساطتها ، وانخفاض تكلفتها ، والقدرة على تحديد فاعلية / انتقائية المانع. في الواقع، وغالبا ما يستخدم هذا البروتوكول في الأدب كشاشة في المختبر5،10. ومع ذلك، فإن مثبطات تحديد في اختبار HAT ليست فعالة دائما في ثقافة الخلية لأن رد فعل أنبوب الاختبار هو أبسط بكثير من نظام الخلايا الحية. ولذلك، فمن الضروري أن مزيد من تحديد خصائص مثبطات في تجارب ثقافة الخلية22،23.
البروتوكول الثاني في خط الأنابيب هو Chromatin Hyperacetylation تثبيط (ChHAI) المقايسة. هذه الخلية القائمة على المقايسة يستخدم مثبطات deacetylase هيستون (HDACi) كأداة لhyperacetylate الهستون في الكروماتين قبل المشاركة في الحضانة مع HATi24. يمكن أن يكون استيليه هينيلستون القاعدي منخفضًا في ثقافة الخلية ، مما يجعل من الصعب التحقيق فيه عن طريق التلطخ المناعي دون إضافة HDACi لزيادة الأسيتيلية. الغرض من مقايسة ChHAI هو تحديد رواية HATi التي يمكن أن تُثبِّت من الزيادة في أسيتيل هيستون الناجمة عن تثبيط HDAC. وتشمل مزايا هذا الفحص تكلفتها المنخفضة وسهولة الأداء النسبية واستخدام الخلايا في الثقافة، مما يوفر أهمية فسيولوجية أكثر من اختبار أنبوب الاختبار HAT. على غرار مقايسة HAT، يستخدم هذا البروتوكول مناعة معيارية لجمع البيانات.
تقدم مقايسات HAT و ChHAI بيانات حول قوة المركبات الجديدة لمنع أسيتيل الهيستون العالمي ، ولكنها لا توفر نظرة ثاقبة حول كيفية تأثير هذه المركبات على التعديلات في مناطق جينومية محددة. ولذلك، فإن البروتوكول النهائي، Chromatin المناعية-الكمّي البوليميراز سلسلة التفاعل (ChIP-qPCR) هو تجربة ثقافة الخلية التي تحقق التفاعلات الحمض النووي البروتين في مناطق محددة من الجينوم. في بروتوكول ChIP، يتم ربط الكروماتين للحفاظ على تفاعلات الحمض النووي والبروتين. ثم يتم استخراج الكروماتين من الخلايا ويخضع مركب البروتينات الحمض النووي للمناعة الانتقائية للبروتين الذي يهم (على سبيل المثال، باستخدام جسم مضاد محدد لH3K27ac). ثم يتم تنقية الحمض النووي وتحليله باستخدام qPCR. على سبيل المثال، يمكن استخدام ChIP-qPCR لتحديد ما إذا كانت رواية HATi downregulates acetylation هينيستون في oncogenes الفردية، مثل Cyclin D125. في حين ChIP-qPCR هو أسلوب شائع يستخدم في هذا المجال، يمكن أن يكون من الصعب تحسين4،10،26. يوفر هذا البروتوكول تلميحات لتجنب المخاطر المحتملة التي يمكن أن تحدث أثناء تنفيذ إجراء ChIP-qPCR ويتضمن تدقيقات مراقبة الجودة التي يجب تنفيذها على البيانات.
عند استخدامها معا، وهذه البروتوكولات الثلاثة تسمح لتوصيف صارم والتحقق من صحة رواية HATi. بالإضافة إلى ذلك، هذه الأساليب توفر العديد من المزايا لأنها سهلة الأداء، رخيصة نسبيا وتوفير البيانات عن الأسيتيل هيستون العالمية وكذلك الإقليمية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) تحفيز أستيل من بقايا ليسين على histones والبروتينات الأخرى لتنظيم ديناميات الكروماتين والتعبير الجيني. تخضع الـ KATs، مثل CBP/p300، لتحقيق مكثف كأهداف علاجية بسبب دورها الحاسم في الأورام السرطانية المتنوعة. إن تطوير مثبطات جزيء صغير جديدة تستهدف وظيفة أسيتيلtransferase (HAT) من منتجات الطاقة المعدنية الكويتية (هات) يمثل تحدياً ويتطلب مقايسات قوية يمكنها التحقق من خصوصية وفاعلية المثبطات المحتملة.
توضح هذه المقالة خط أنابيب من ثلاث طرق توفر التحقق من صحة في المختبر الصارم لمثبطات HAT جديدة (HATi). وتشمل هذه الطرق اختبار اختبار أنبوب قبعة المقايسة, كروماتين فرط الacetylation تثبيط (ChHAI) اختبار, وChromatin المناعي-PCR الكمية (ChIP-qPCR). في مقايسة HAT، يتم احتضان HATs المؤتلف مع الهستونات في تفاعل أنبوب الاختبار، مما يسمح لالآستيل من بقايا ليسين محددة على ذيول الحجر. ويمكن منع هذا التفاعل بواسطة HATi ويمكن قياس المستويات النسبية من أسيتيل هينيستون محددة الموقع عن طريق المناعة. مثبطات محددة في قبعة المقايسة تحتاج إلى تأكيد في البيئة الخلوية.
يستخدم مقايسة ChHAI مناعيًا لفحص HATi رواية أن تخفيف فرط acetylation قوية من النغمات الناجمة عن مثبط deacetylase هيستون (HDACi). إضافة HDACi مفيد لأن مستويات القاعدية من أسيتيل هينيستون يمكن أن يكون من الصعب الكشف عن طريق المناعة.
ويقيس مقايستا هات وتشهاي التغيرات العالمية في أسيتيل الهيستون، ولكن لا تقدمان معلومات بشأن أسيتيل في مناطق جينية محددة. ولذلك، يتم استخدام ChIP-qPCR للتحقيق في آثار HATi على مستويات أستيل هيستون في العناصر التنظيمية الجينات. ويتم ذلك من خلال التحلل المناعي الانتقائي لمجمعات هيستون-دنا وتحليل الحمض النووي المنقى من خلال qPCR. معا، هذه المقايسات الثلاثة تسمح للتحقق الدقيق من خصوصية، قوة، وآلية العمل من رواية HATi.

في المختبر acetyltransferase (HAT) يمكن استخدام مقايسة للتحقيق في المركبات التي تمنع p300 هات النشاط نحو الركيزة حجر. الشكل 1A يوفر تخطيطيا تجريبيا لمقتايس HAT. تم استخدام حمض Anacardic ، وهو معروف HATi3،38، في هذا الفحص في نطاق تركيز من 12.5-100 μM. في 100 μM، حمض الأنكار...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

مثبطات acetyltransferases هيستون (HATs، المعروف أيضا باسم lysine أستيل ترانسفيراليس)، مثل CBP/p300، هي العلاجات المحتملة لعلاج السرطان. ومع ذلك، هناك حاجة إلى أساليب صارمة للتحقق من صحة هذه المثبطات. ثلاث طرق في المختبر للتحقق من الصحة وتشمل المقايسات HAT مع أسيتيل ترانسفيرات المؤتلف، المناعية لاستيل هيستون في ثقافة الخلية، وChip-qPCR.

مقايسات للتحقق من صحة مثبطات هيستون أسيتيل ترانسفيراز

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

هذه البروتوكولات مهمة لأنها توفر خطوات مفصلة للتحقق من فاعلية وانتقائية مثبطات HAT الجديدة ، والتي هي أدوات بحثية مهمة وعلاجات محتملة. التقنيات التي أظهرت في هذا الفيديو هي سهلة لأداء وتوفير معلومات حول آثار مثبطات HAT على أستيل هينيستون العالمية والإقليمية. أنها تجعل من الممكن لفهم تنظيم اللاجينية للتعبير الجيني.الاهتمام بالتفاصيل أمر بالغ الأهمية. من المهم اتباع البروتوكولات خطوة بخطوة. ابدأ بإعداد التفاعل الأنزيمي في حجم 10 ميكرولتر داخل أنبوب PCR 0.2 ملليلتر وفقًا لاتجاهات المخطوطة.ثم احتضان خليط التفاعل الكامل في 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في دورة حرارية PCR. وفي الوقت نفسه، إضافة اثنين mercaptoethanol بنسبة واحد إلى 10 إلى المخزن المؤقت عينة 6X SDS. إزالة عينات من دورة حرارية PCR وإضافة اثنين microliters من المخزن المؤقت عينة SDS المعدة إلى كل مزيج التفاعل.سخني العينات إلى 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق على كتلة حرارية ثم تبرد على الجليد. تخزين العينات في ناقص 20 أو ناقص 80 درجة مئوية أو المضي قدما مع الكهرباء هلام ومناعة. البذور 100، 000 MCF-7 الخلايا في ملليلتر واحد من خلية ثقافة المتوسطة في كل بئر من لوحة 12-well والسماح للخلايا لتنمو إلى 80 إلى 90٪ التقاء.عندما تصل الخلايا إلى الالتقاء المطلوب ، تتبخر متوسطة زراعة الخلية من الآبار أربعة وخمسة وستة ، وماصة ملليلتر واحد من ثلاثة ميكرومولار MS275 في المتوسط في كل بئر. ثم التعرق متوسطة ثقافة الخلية من الآبار واحد واثنين وثلاثة، وماصة ملليلتر واحد من DMSO المخفف في كل بئر. إعادة الخلايا إلى الحاضنة لمدة أربع ساعات للسماح لتراكم الهستونات الأسيتلات في الخلايا المعرضة لMS275.في حين أن الخلايا هي احتضان، وإعداد التخفيف من A-485 في DMSO وفقا لتوجيهات المخطوطات. عند الانتهاء من الحضانة ، تعرق المتوسطة من الآبار وتضيف التخفيفات. إعادة الخلايا إلى الحاضنة وثقافتها لمدة 20 ساعة، ثم pirate الخلية ثقافة المتوسطة من الآبار وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.التعرق في برنامج تلفزيوني وإضافة 100 ميكرولترات من العازلة التحلل السلبي. تخزين لوحة في ناقص 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ماصة 100 ميكرولترات من كروماتين سونيكاتيد من الخلايا المعالجة مع DMSO إلى اثنين من أنابيب 1.5 ملليلتر، ثم ماص 400 ميكرولترات من 300 500 ميكرولترات من تخفيف هدحام ChIP إلى كل أنبوب لجعل حجم يصل إلى 500 ميكرولتر.إزالة خمسة ميكرولترات من الحل من أحد الأنابيب وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية كمدخل DMSO. إعداد أنبوبين مع كروماتين سونيكاتيد من الخلايا المعالجة ب A-485 بنفس الطريقة. استخدم ماصة لإضافة الأجسام المضادة للأسيتيل IgG وH3K27 إلى عينات DMSO و A-485.ثم إضافة 20 ميكرولترات من البروتين الخرز المغناطيسي لكل أنبوب، والتأكد من أن يتم resuspended الخرز بشكل جيد. تدوير العينات بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. بيليه البروتين الخرز المغناطيسي باستخدام فاصل المغناطيسي وإزالة supernatant دون إزعاج الخرز.غسل الخرز مع 500 ميكرولتر إلى ملليلتر واحد من انخفاض الملح غسل العازلة وتدويرها لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. أداء تدور سريعة إلى أسفل، بيليه الخرز مع فاصل المغناطيسي وإزالة supernatant. كرر إجراء الغسيل مع ارتفاع العازلة غسل الملح، كلوريد الليثيوم غسل العازلة، وتي العازلة.بعد الغسيل مع المخزن المؤقت TE، وإزالة عينات المدخلات من الثلاجة ووضعها على الجليد. ذوبان aliquot من البروتينات K، ثم بيليه الخرز باستخدام فاصل المغناطيسي وإزالة العازلة TE من الخرز. إضافة 100 ميكرولترات من الحاجز chIP elution وميكروتير واحد من البروتينات K إلى كل عينة بما في ذلك عينات المدخلات واحتضان لهم مع اهتزاز في 62 درجة مئوية لمدة ساعتين باستخدام ثيركلوسير.بعد الحضانة ، قم بتسخين العينات إلى 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم تبريدها إلى درجة حرارة الغرفة. بيليه الخرز المغناطيسي مع فاصل المغناطيسي ونقل ناظر الحمض النووي التي تحتوي على أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنظيف PCR القياسية وتشغيل qPCR.في المختبر استيتيل ترانسفيراز استيناس تم استخدام التحقيق في تأثير حمض الأناكارديك على نشاط p300 HAT نحو الركيزة حجر. تم اختبار نطاق تركيز ولم يتم إضافة أسيتيل-CoA إلى رد فعل التحكم السلبي. تم تحديد نتائج الناع بالمناعة مع ImageJ ، مما يظهر انخفاضًا واضحًا في الأسيتيل H3K18 و Acetyl H3K9 في 100 حمض anacardlar micromolar مقارنة بعنص تحكم DMSO.في chromatin فرط acetylation اختبار تثبيط, علاج الخلايا MCF-7 مع HDACi MS275 بقوة أعلى من الأسيتيل من هيستون 3 على العديد من بقايا اللين. كانت المستويات القاعدية من الأسيتيل H3K18 وH3K27 الأسيتيل منخفضة، مما يدل على فوائد إضافة HDACi في مقايسة تشاي. إن إضافة A-485 في الخلايا المعالجة مسبقًا باستخدام MS275 يخفف من زيادة أستيل حجر الهيستون في H3K18 و H3K27، ولكن ليس H3K9.كما تم تحديد نتائج مناعية كميا مع ImageJ. تم استخدام ChIP qPCR للتحقيق في آثار مثبطات HAT في العناصر التنظيمية الجينية التي تتحكم في التعبير عن الأوكوجيني. في عينة DMSO، أنتجت الحمض النووي التي عجلت بها الأجسام المضادة IgG التحكم قيمة أعلى Ct من الأجسام المضادة أسيتيل H3K27 في تفاعل qPCR لمروج Cyclin D1، مما يشير إلى أن التحكم غير محددة IgG عجلت أقل مجمعات هيوستون الحمض النووي من الأجسام المضادة H3K27 أسيتيل محددة في المروج.مقارنة مع التحكم DMSO، A-485 خفض إثراء أسيتيل H3K27 في المروج D1 cyclin. الأهم من ذلك، A-485 هو معروف للحد بشكل كبير من أسيتيل H3K27 في الخلية. عند محاولة هذا البروتوكول، نضع في اعتبارنا أن الخطوات قبل الحضانة من في المختبر هات ومجايسات ChHAI ضرورية ويجب ألا تنسى.من المهم أيضا أن نتذكر لحفظ عينات المدخلات وتجنب فقدان الخرز أثناء برنامج ChIP. بعد تنفيذ هذه الإجراءات، ChIP-seq هو طريقة إضافية التي يمكن تنفيذها للحصول على معلومات عالمية حول acetylation هيستون في العناصر التنظيمية للجينوم بأكمله. هذه البروتوكولات مفيدة للعلماء للتحقق بعناية من صحة مثبطات HAT الجديدة وتجنب نشر مسابير كيميائية منخفضة الجودة في الأدب.يمكن أن تخضع مثبطات HAT التي تم التحقق من صحتها لمزيد من التطوير كعواد علاجية محتملة.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture فحوصات لدراسة البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة تحفيز من ورم أرومي دبقي الغزو

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

التقييم السريري بيواكتيفيتي OT48 الكومارين السرطان الماغنيسيوم وفحوصات تشكيل مستعمرة، وتكثيفها الزرد

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

تقييم للمقاومة إلى تيروزين كيناز مثبطات تجواب مسارات توصيل الإشارات بجسم صفائف

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

تحقيق تبعيات الجينية باستخدام فحوصات كريسبر-Cas9-تعتمد المنافسة

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

الخميرة كهيكل لتطوير الاختبارات الوظيفية لدراسة P53 الإنسان

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

توصيف آثار مثبطات Migrastatic على غزو الورم 3D Spheroid من قبل عالية الدقة المجهرية البؤرية

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

الجمع بين استخدام الذيل الوريد الانبثاث الاختبارات والوقت الحقيقي في التصوير فيفو لقياس سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والعبء في الرئتين

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

تقييم المشاركة المستهدفة الخلوية من قبل SHP2 (PTPN11) مثبطات Phosphatase

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

تحديد مثبطات EGFR و RAS باستخدام إليجانات Caenorhabditis

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...