Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

这项工作得到了詹姆斯和埃丝特·金生物医学研究计划（6JK03和20K07）以及Bankhead-Coley癌症研究计划（4BF02和6BC03）、佛罗里达州卫生部、佛罗里达州乳腺癌基金会和UF健康癌症中心的赠款的支持。此外，我们要感谢扎卡里·奥斯金博士和安德里亚·林博士在出版过程中给予的支持。

1. 体外帽子测定
<ol><li>缓冲准备 注：有关缓冲区配方，请参阅表 1。<ol>
<li>准备5x测定缓冲液和6x硫酸钠（SDS），并在-20°C下储存。 1 mL 等分中的等分 Sds。</li>
		<li>准备 10 倍 SDS 凝胶运行缓冲液和 10 倍 TBST，并在室温下储存。</li>
		<li>准备 1x 传输缓冲液，并在 4 °C 下存放。 注意：检查本协议中使用的所有化学品的安全数据手册。SDS、DTT 和蓝个兄弟酚是有毒的，不?...

莱辛乙酰转移酶（KATs）乙酰酸酯在组蛋白尾部和转录因子上有几个莱辛残留物，以调节基因转录2，3。2过去二十年的工作显示，KAT，如CBP/p300，PCAF和GCN5，与致癌转录因子相互作用，并有助于推动肿瘤生长在几个实体肿瘤类型4，5，9，15，16，17，18。,5,9,15<su...

莱辛乙酰转移酶（KATs）催化了组蛋白和非组,蛋白1、2、3、4上的乳,2氨酸残留物的3乙酰化。最近的研究表明，KATS及其乙酰转移酶功能可以促进实体肿瘤的生长4，5，6，7，8，9。,5,6,7,8,9例如，CREB结合蛋白（CBP）/p300是两个准体KAT，调节癌症2，3中的许多信号通路。CBP/p300具有良好的表观乙酰转移酶（HAT）功能和催化组蛋白3莱辛27乙酰化（H3K27ac）2，4，5，10，11，一个重要的标记活性增强剂，启动子区域和活性基因转录2,4,5,10,111212，13，14。,13,14CBP/p300通过组蛋白和其他转录因子,,,4、9、15、16、17、18激活肿瘤的转录,174，9作为实体肿瘤中促进生长信号通路的关键联合活性剂。1516由于CBP/p300在肿瘤进展中的作用，CBP/p300和其他KAT正在研究开发新的抑制剂，阻止其肿瘤功能44，5，6，7，8，9，18，19，20。,5,6,7,8,9,18,19,20A-485和GNE-049代表了两个成功的尝试，以开发有效的和特定的抑制剂CBP/p30044，99。目前正在对CBP/p300和其他KAT的其他抑制剂进行调查。
前面描述的KAT抑制剂（KATi）的质量受到质疑，许多抑制剂表现出靶向效应和不良表征21。因此，对新药候选药物进行严格的鉴定和验证对于开发高质量的化学探针至关重要。此处概述的三种协议构成了筛选和严格验证新型 KATi 的效力和特异性的管道，具体侧重于抑制 KAT 的 HAT 功能 （HATi）。CBP/p300 及其抑制剂用作示例，但这些协议可适用于具有 HAT 功能7的其他 KAT。
第一个协议是体外组蛋白转移酶（HAT）测定，利用纯化重组p300和组蛋白在受控试管反应。这种测定操作简单，性价比高，可用于在低通量环境中筛选化合物，不需要放射性物质。在该协议中，重组p300催化组蛋白尾部的乳氨酸乙酰化在短暂的潜伏期，组蛋白乙酰化水平使用标准的免疫印迹程序测量。酶反应可以在CBP/p300抑制剂存在或不存在的情况下进行，以筛选减少组蛋白乙酰化的化合物。此外，HAT测定可用于通过评估新化合物与其他纯化KAT（如PCAF）的活性，来验证新化合物是否对CBP/p300具有选择性。HAT 测定是研究新型抑制剂的极好起点，因为它简单、成本低，并且能够确定抑制剂的功效/选择性。事实上，这个协议经常在文献中用作体外屏幕5,5，10。然而，在帽子检测中识别的抑制剂并不总是有效的细胞培养，因为试管反应比活细胞系统简单得多。因此，在细胞培养实验22、23中进一步描述抑制剂是十分必要的。
管道中的第二个协议是染色质超乙酰抑制（ChHAI）测定。这种基于细胞的测定利用组蛋白去乙酰酶抑制剂（HDACi）作为工具，在与HATi 24共同孵化之前，在染色质中超乙酰化组蛋白。基础组蛋白乙酰化在细胞培养中可能很低，因此如果不添加HDACi来增加乙酰化，就很难通过免疫印迹进行探查。ChHAI测定的目的是确定新的HATi，可以抑制HDAC抑制引起的组蛋白乙酰化的增加。这种测定的优点包括成本低，相对易于执行，以及细胞在培养中的使用，这提供了比试管帽子检测更多的生理相关性。与 HAT 检测类似，此协议使用标准免疫印迹进行数据收集。
HAT 和 ChHAI 检测提供了有关新化合物抑制全球组蛋白乙酰化效力的数据，但没有提供这些化合物如何影响特定基因组区域的修饰的见解。因此，最终的协议，染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR）是一个细胞培养实验，研究DNA-蛋白质相互作用在基因组的特定区域。在ChIP协议中，染色质是交联的，以保持DNA蛋白相互作用。然后从细胞中提取染色质，DNA-蛋白质复合物对感兴趣的蛋白质进行选择性免疫沉淀（例如，使用H3K27ac特异性抗体）。然后使用 qPCR 对 DNA 进行纯化和分析。例如，ChIP-qPCR 可用于确定一种新的 HATi 是否对单个肿瘤的组蛋白乙酰化进行调节，例如 Cyclin D125。虽然ChIP-qPCR是该领域常用的技术，但很难优化4、10、26。,264,该协议提供了避免执行 ChIP-qPCR 过程时可能发生的潜在陷阱的提示，包括应对数据执行的质量控制检查。
当一起使用时，这三种协议允许对新型HATi进行严格的表征和验证。此外，这些方法提供了许多优点，因为它们易于执行，相对便宜，并提供全球和区域组蛋白乙酰化的数据。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

莱辛乙酰转移酶（KATs）催化蛋白酶和其他蛋白质上的乳氨酸残留物的乙酰化，以调节染色质动力学和基因表达。KAT，如CBP/p300，由于它们在多种癌症的肿瘤发生中起着关键作用，正在作为治疗对象进行紧张的研究。针对KATS的组蛋白乙酰转移酶（HAT）功能开发新型小分子抑制剂是具有挑战性的，需要可靠的测定，以验证潜在抑制剂的特异性和效力。
本文概述了三种方法的管道，为新型 HAT 抑制剂 （HATi） 提供严格的体外验证。这些方法包括试管 HAT 测定、染色质超乙酰化抑制（ChHAI）测定和染色质免疫沉淀-定量 PCR （ChIP-qPCR）。在 HAT 检测中，重组的 HATs 在试管反应中用组蛋白孵育，允许组蛋白尾部的特定莱辛残留物乙酰化。这种反应可以通过HATi阻断，可以通过免疫印迹测量位点特异性组蛋白乙酰化的相对水平。在 HAT 检测中识别的抑制剂需要在细胞环境中得到确认。
ChHAI 测定使用免疫印迹来筛选新型 HATi，该哈蒂能够衰减由组蛋白脱乙酰酶抑制剂 （HDACi） 诱导的组蛋白的强健超乙酰化。添加HDACi是有帮助的，因为组蛋白乙酰化的基础水平可能很难通过免疫印迹检测。
HAT 和 ChHAI 测定测量组蛋白乙酰化的全球变化，但没有提供有关特定基因组区域乙酰化的信息。因此，ChIP-qPCR用于研究HATi对基因调控元素组蛋白乙酰化水平的影响。这是通过选择性免疫沉淀组蛋白-DNA复合物和通过qPCR分析纯化DNA实现的。这三种分析方法合在一起，可以仔细验证新HATi的特异性、效力和作用机制。

体外组蛋白乙酰转移酶（HAT）测定可用于探寻抑制p300 HAT活性的化合物对组蛋白基质。图 1A提供了 HAT 测定的实验原理图。Anacardic酸，一种已知的HATi3，38，在12.5-100μM的浓度范围内被用于此测定。3,在100μM时，甲酸下调节p300催化组蛋白乙酰化在组酮3，Lysines 9和18对控制DMSO处理（图1B，车道5对车道1）。这种测?...

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Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

组蛋白乙酰转移酶（HATs，也称为碱基乙酰转移酶）的抑制剂，如CBP/p300，是治疗癌症的潜在疗法。然而，需要严格的方法来验证这些抑制剂。三种体外验证方法包括使用重组乙酰转移酶进行帽子检测、细胞培养中组蛋白乙酰化的免疫印迹和ChIP-qPCR。

验证组蛋白乙酰转移酶抑制剂的检测

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

这些协议之所以重要，是因为它们为验证新型 HAT 抑制剂的功效和选择性提供了详细的步骤，而新型 HAT 抑制剂是重要的研究工具和潜在的治疗方法。本视频中演示的技术易于执行，并提供有关 HAT 抑制剂对全局和区域组蛋白乙酰化的影响的信息。它们使得理解基因表达的表观遗传调控成为可能。关注细节至关重要。逐步遵循协议非常重要。首先根据手稿方向，在 0.2 毫升 PCR 管内制备 10 微升体积的酶反应。然后在PCR热循环器中孵育30摄氏度下的完整反应混合物一小时。同时，在 6X SDS 样品缓冲液中，以 1 比 10 的比例添加两个甲醇。从 PCR 热循环器中去除样品，并将制备的 SDS 样品缓冲液的两微升添加到每个反应混合物中。将样品加热到95摄氏度，在热块上加热5分钟，然后在冰上冷却。将样品储存在零下20或零下80摄氏度，或进行凝胶电泳和免疫印迹。将10万个MCF-7细胞在一毫升细胞培养培养中放入12井板的每个井中，使细胞生长到80至90%的汇合。当细胞达到所需的汇合时，从孔四、五和六吸出细胞培养，将移液器一毫升的三微摩尔MS275以中等进入每口井。然后从井一、二、三中吸出细胞培养基，将一毫升稀释的DMSO移液器吸入每口井中。将细胞返回到培养箱4小时，以在暴露于MS275的细胞中积累乙酰基细胞。当细胞孵育时，根据手稿指示在DMSO中准备稀释的 A-485。孵育完成后，从井中吸出介质并添加稀释剂。将细胞返回培养箱并培养20小时，然后从孔中吸出细胞培养培养，然后用一毫升PBS清洗细胞。吸气PBS，并添加100微升无源解液缓冲液。将盘子存放在零下80摄氏度的一夜之间。移液100微升的声波染色质从用DMSO处理的细胞放入两个1.5毫升管，然后移液器400微升的ChIP稀释缓冲液到每个管，使总体积达到500微升。从其中一个管中取出溶液的五微升，并将其储存在零下 20 摄氏度，作为 DMSO 输入。从用A-485治疗的细胞中，用声波染色质准备两个管子。使用移液器将IgG和H3K27乙酰抗体添加到DMSO和 A-485样品中。然后在每个管中加入20微升蛋白质 A 磁珠，确保珠子重新悬浮良好。在四摄氏度下将样品旋转一夜。使用磁性分离器将蛋白质分解为磁性珠，在不干扰磁珠的情况下去除上清液。用500微升将珠子洗至1毫升低盐洗涤缓冲液，并在4摄氏度下旋转5分钟。快速旋转下来，用磁性分离器对珠子进行颗粒化，然后取出上流水线。使用高盐洗涤缓冲液、氯化锂洗涤缓冲液和TE缓冲液重复洗涤过程。使用 TE 缓冲液清洗后，从冰柜中取出输入样品并将其放在冰上。解冻蛋白酶K的等分，然后用磁性分离器对珠子进行颗粒化，然后从珠子上取出TE缓冲液。在每个样品（包括输入样品）中加入100微升ChIP洗脱缓冲液和1微升蛋白酶K，并使用热循环器在62摄氏度下摇动2小时。孵育后，将样品加热至95摄氏度10分钟，然后冷却至室温。用磁性分离器将磁珠混合，将含有DNA的上能液转移到新的1.5毫升管中。使用标准 PCR 清理套件净化 DNA 并运行 qPCR。体外组蛋白乙酰转移酶测定用于研究甲酸对p300 HAT活性对组蛋白基质的影响。测试了浓度范围，乙酰-CoA没有添加到阴性控制反应中。与DMSO控制相比，100微摩尔甲酸的乙酰H3K18和乙酰H3K9的免疫布洛特结果被量化。在染色质超乙酰化抑制测定中，用HDACi MS275对MCF-7细胞进行强调节组蛋白3的乙酰化，对几种莱辛残留物进行调节。乙酰H3K18和乙酰H3K27的基底水平较低，显示了在ChHAI测定中添加HDACi的好处。在MS275预处理的细胞中添加的 A-485 会衰减 H3K18 和 H3K27 中增加的组蛋白乙酰化，但不是 H3K9。免疫布洛特结果也用 ImageJ 进行量化。ChIP qPCR 用于研究 HAT 抑制剂对控制基因表达的基因调控元素的影响。在DMSO样品中，IgG控制抗体沉淀的DNA在环素D1促进剂的qPCR反应中产生的CT值高于乙酰H3K27抗体，表明非特异性IgG控制沉淀的DNA组蛋白复合物比反应器中的乙酰H3K27特异性抗体少。与DMSO控制相比，A-485降低了环素D1启动子的乙酰H3K27浓缩量。重要的是，A-485已知可以显著减少细胞培养中的乙酰H3K27。尝试此协议时，请记住，体外 HAT 和 ChHAI 检测的预孵化步骤至关重要，不应被遗忘。同样重要的是要记住保存输入样本，并避免在 ChIP 期间丢失珠子。执行这些程序后，ChIP-seq 是一种额外的方法，可以执行，以获得有关整个基因组调控元素的组蛋白乙酰化的全局信息。这些协议有助于科学家仔细验证新的 HAT 抑制剂，并避免在文献中发布低质量的化学探针。经过验证的 HAT 抑制剂可以作为潜在的治疗方法进行进一步开发。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

共培养化验，以研究胶质母细胞瘤入侵的巨噬细胞和小胶质细胞刺激

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

科研

癌症研究

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

球体、菌落形成测定和斑马鱼移植对抗癌香豆素 OT48 生物活性的临床前评价

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

用抗体阵列对信号转导通路的审问对酪氨酸激酶抑制剂的抗性评价

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

活体细胞成像技术研究胶质瘤脑干细胞的迁移和侵袭

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

基于 crispr-cas9 的竞争检测对遗传依赖性的调查

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

酵母作为开发功能分析研究人类P53的机箱

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

通过高分辨率共聚焦显微镜对3D肿瘤球体入侵的影响表征

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

结合使用尾静脉转移分析与实时 Vivo 成像，以量化乳腺癌转移殖民化和肺负担

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

通过 SHP2 （PTPN11） 磷酸酶抑制剂评估细胞目标参与度

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

使用卡诺哈布迪炎埃莱甘斯识别 EGFR 和 RAS 抑制剂

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...