Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra James og Esther King Biomedical Research Program (6JK03 og 20K07), og Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 og 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation, og UF Health Cancer Center. Derudover vil vi gerne takke Dr. Zachary Osking og Dr. Andrea Lin for deres støtte under offentliggørelsesprocessen.

1. In vitro HAT-analyse
<ol><li>Forberedelse af buffer BEMÆRK: Se tabel 1 for bufferopskrifter.<ol>
<li>Der tilberedes 5x analysebuffer og 6x natriumdycylsulfat (SDS), og opbevares ved -20 °C. Aliquot SDS i 1 ml aliquots.</li>
		<li>Forbered 10x SDS gel løbebuffer og 10x TBST og opbevares ved stuetemperatur.</li>
		<li>Der klargørs 1x overførselsbuffer og opbevares ved 4 °C. FORSIGTIG: Kontroller sikkerhedsdatabladet for alle kemikalier, der anvendes i denne protokol. SDS,...

Lysin acetyltransferaser (KATs) acetylate flere lysinrester på histonehaler og transskriptionsfaktorer til regulering af gentranskription2,3. Arbejde i de sidste to årtier har afsløret, at KNG'er, såsom CBP/p300, PCAFogGCN5, interagere med onkogen transskription faktorer og bidrage til at drive tumorvækst i flere solide tumortyper4,,5,9,<sup cl...

Lysin acetyltransferaser (KATs) katalyser acetylation af lysinrester på både histone og ikke-histonproteiner1,2,3,4. Nyere forskning viser, at KATs og deres acetyltransferase funktion kan fremme solid tumor vækst4,,5,,6,,7,,8,9. For eksempel er CREB-bindende protein (CBP)/p300 to paraloge KATs, der regulerer mange signalveje i kræft2,3. CBP/p300 har en vel karakteriseret histon acetyltransferase (HAT) funktion og katalysse Histone 3 Lysin 27 acetylation (H3K27ac)2,4,5,10,11, en vigtig markør for aktive smagsforstærkere, promotor regioner og aktiv gen transskription12,13,14. CBP/p300 fungerer som kritiske co-aktivatorer for pro-vækst signalering veje i faste tumorer ved at aktivere transskription af onkogener gennem acetylation af histonerogandre transskription faktorer4,9,15,16,17,18. På grund af deres rolle i tumor progression, CBP/p300 og andre KATs er under efterforskning for udvikling af nyehæmmere,der blokerer deres onkogen funktion4,5, 6,6,7,,8,9,18,19,20. A-485 og GNE-049 repræsenterer to vellykkede forsøg på at udvikle potente og specifikke hæmmere til CBP/p3004,9. Yderligere inhibitorer er i øjeblikket ved at blive undersøgt for CBP/p300 og andre kats.
Kvaliteten af tidligere beskrevne KAT-hæmmere (KATi) sættes spørgsmålstegn ved, med mange inhibitorer viser off måleffekter og dårlig karakterisering21. Derfor er streng karakterisering og validering af nye lægemiddelkandidater afgørende for udviklingen af kemiske sonder af høj kvalitet. Skitseret her er tre protokoller, der danner en pipeline til screening og strengt validere styrken og specificiteten af nye KATi, med særligt fokus på at hæmme HAT funktion (HATi) af KATs. CBP/p300 og deres hæmmere bruges som eksempler, men disse protokoller kan tilpasses til andre KAT'er, der har hat-funktion7.
Den første protokol er en in vitro histone acetyltransferase (HAT) assay, der udnytter renset rekombinant p300 og histoner i et kontrolleret reagensglas reaktion. Denne analyse er enkel at udføre, er omkostningseffektiv, kan bruges til at screene forbindelser i en lav gennemløb indstilling, og kræver ikke radioaktive materialer. I denne protokol katalyserer rekombinant p300 lysinacetylation på histonehaler i løbet af en kort inkubationstid, og niveauerne af histonacetylation måles ved hjælp af standardimmunoblottingprocedurer. Den enzymatiske reaktion kan udføres i nærvær eller fravær af CBP/p300-hæmmere til at screene for forbindelser, der reducerer histonacetylation. Derudover kan HAT-analysen bruges til at kontrollere, om nye forbindelser er selektive for CBP/p300 ved at vurdere deres aktivitet i forhold til andre rensede KAT'er, såsom PCAF. HAT-analysen er et glimrende udgangspunkt for at undersøge nye hæmmere på grund af sin enkelhed, lave omkostninger, og evnen til at bestemme styrken / selektiviteten af en hæmmer. Faktisk er denne protokol ofte bruges i litteraturen som en in vitro skærm5,10. Men, inhibitorer identificeret i HAT analysen er ikke altid effektive i cellekultur, fordi et reagensglas reaktion er meget enklere end en levende celle system. Det er derfor vigtigt yderligere at karakterisere hæmmere i cellekultureksperimenter22,23.
Den anden protokol i rørledningen er Chromatin Hyperacetylation Hæmning (ChHAI) assay. Denne cellebaserede analyse anvender histone deacetylasehæmmere (HDACi) som et værktøj til at hyperacetylate histoner i kromatin før co-inkubation med en HATi24. Basal histonacetylation kan være lav i cellekultur, hvilket gør det vanskeligt at sonde for via immunoblotting uden tilsætning af en HDACi at øge acetylation. Formålet med ChHAI-analysen er at identificere nye HATi, der kan dæmpe stigningen i histonacetylation forårsaget af HDAC-hæmning. Fordelene ved denne analyse omfatter dens lave omkostninger, relativ lethed at udføre, og brugen af celler i kultur, som giver mere fysiologisk relevans end reagensglas HAT assay. I lighed med HAT-analysen bruger denne protokol standardimmunisering til dataindsamling.
HAT og ChHAI-analyserne giver data om styrken af nye forbindelser til at hæmme global histonacetylation, men giver ikke indsigt i, hvordan disse forbindelser påvirker modifikationer i specifikke genomiske regioner. Derfor er den endelige protokol, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) et cellekultureksperiment, der undersøger DNA-protein interaktioner i bestemte områder af genomet. I ChIP-protokollen krydslinkes kromatin for at bevare DNA-proteininteraktioner. Kromatin udvindes derefter fra celler, og DNA-proteinkomplekset gennemgår selektiv immunoprecipation for det pågældende protein (f.eks. ved hjælp af et antistof, der er specifikt for H3K27ac). DNA'et renses og analyseres derefter ved hjælp af qPCR. For eksempel kan ChIP-qPCR bruges til at afgøre, om en ny HATi nedregulerer histonacetylation på individuelle oncogenes, såsom Cyclin D125. Mens ChIP-qPCR er en almindelig teknik, der anvendes i marken, kan det være svært at optimere4,10,26. Denne protokol indeholder tip til at undgå potentielle faldgruber, der kan opstå under udførelse af ChIP-qPCR-proceduren, og omfatter kvalitetskontrolkontroller, der skal udføres på dataene.
Når disse tre protokoller bruges sammen, giver de mulighed for streng karakterisering og validering af nye HATi. Derudover tilbyder disse metoder mange fordele, fordi de er nemme at udføre, relativt billige og levere data om globale såvel som regionale histon acetylation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

Lysin acetyltransferaser (KATs) katalyse acetylation af lysinrester på histoner og andre proteiner til regulering af kromatindynamik og genekspression. KATs, såsom CBP/p300, er under intens undersøgelse som terapeutiske mål på grund af deres kritiske rolle i tumorigenesis af forskellige kræftformer. Udviklingen af nye små molekylehæmmere rettet mod histone acetyltransferase (HAT) funktion af KATs er udfordrende og kræver robuste analyser, der kan validere specificitet og styrken af potentielle hæmmere.
Denne artikel skitserer en pipeline af tre metoder, der giver streng in vitro validering for nye HAT-hæmmere (HATi). Disse metoder omfatter et reagensglas HAT-analyse, Chromatin Hyperacetylation Hæmning (ChHAI) analyse, og Chromatin Immunoprecipitation-kvantitative PCR (ChIP-qPCR). I HAT-analysen inkuberes rekombinant HAT'er med histoner i et reagensglas, hvilket giver mulighed for acetylation af specifikke lysinrester på histonehalerne. Denne reaktion kan blokeres af en HATi, og de relative niveauer af stedsspecifikke histoneacetylation kan måles via immunblotting. Inhibitorer identificeret i HAT-analysen skal bekræftes i cellemiljøet.
ChHAI-analysen bruger immunoblotting til at screene for nye HATi, der dæmper den robuste hyperacetylation af histoner fremkaldt af en histone deacetylasehæmmer (HDACi). Tilføjelsen af en HDACi er nyttigt, fordi basale niveauer af histon acetylation kan være svært at opdage via immunoblotting.
HAT- og ChHAI-analyserne måler globale ændringer i histonacetylation, men giver ikke oplysninger om acetylation i specifikke genomiske regioner. Derfor anvendes ChIP-qPCR til at undersøge virkningerne af HATi på histonacetylationsniveauer ved genregulerende elementer. Dette opnås gennem selektiv immunudfrielse af histone-DNA-komplekser og analyse af det rensede DNA gennem qPCR. Tilsammen giver disse tre analyser mulighed for omhyggelig validering af specifikke forhold, styrke og virkningsmekanisme af nye HATi.

In vitro histone acetyltransferase (HAT) assay kan bruges til at sonde for forbindelser, der hæmmer p300 HAT aktivitet mod en histone substrat. Figur 1A giver et eksperimentelt skematisk for HAT-analysen. Anakarinsyre, en kendt HATi3,38, blev udnyttet i denne analyse i en koncentration spænder fra 12.5-100 μM. Ved 100 μM nedregulerer anacardinsyre p300 histonacetylation ved Histone 3, Lysines 9 og 18 versus kontrol-DMSO-behandlin...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Hæmmere af histone acetyltransferaser (HATs, også kendt som lysin acetyltransferases), såsom CBP/p300, er potentielle terapeutiske til behandling af kræft. Men, strenge metoder til validering af disse hæmmere er nødvendige. Tre in vitro metoder til validering omfatter HAT assays med rekombinant acetyltransferaser, immunoblotting for histone acetylation i cellekultur, og ChIP-qPCR.

Analyser til validering af Histone Acetyltransferase hæmmere

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Disse protokoller er betydelige, fordi de giver detaljerede trin til validering af styrken og selektiviteten af nye HAT-hæmmere, som er vigtige forskningsværktøjer og potentielle terapeutiske. De teknikker, der demonstreres i denne video er nemme at udføre og give oplysninger om virkningerne af HAT-hæmmere på globale og regionale histone acetylation. De gør det muligt at forstå epigenetisk regulering af genekspression.Opmærksomhed på detaljerne er kritisk. Det er vigtigt at følge protokollerne trin for trin. Begynd med at forberede den enzymatiske reaktion i et 10 mikrolitervolumen inde i et 0,2 milliliter PCR-rør i henhold til manuskriptretninger.Derefter inkuberes den komplette reaktionsblanding ved 30 grader Celsius i en time i en PCR termiskcykelr. I mellemtiden tilføjes to mercaptoethanol i et 1 til 10-forhold til 6X SDS-prøvebufferen. Fjern prøverne fra PCR-termiskcykelcyklus, og der tilsættes to mikroliter af den forberedte SDS-prøvebuffer til hver reaktionsblanding.Varm prøverne til 95 grader Celsius i fem minutter på en varmeblok, og afkøl dem derefter på is. Prøverne opbevares på minus 20 eller minus 80 grader Celsius, eller der skal fortsættes med gelelektrophorsis og immunblotting. Seed 100, 000 MCF-7 celler i en milliliter cellekultur medium i hver brønd af en 12-brønd plade og lad cellerne til at vokse til 80 til 90% sammenløb.Når cellerne når det ønskede sammenløb, aspirere cellekulturmediet fra brønde fire, fem og seks, og pipette en milliliter af tre mikromolar MS275 i medium ind i hver brønd. Derefter aspirere cellekultur medium fra brønde en, to og tre, og pipette en milliliter fortyndet DMSO i hver brønd. Cellerne returneres til inkubatoren i fire timer for at give mulighed for akkumulering af acetylerede histoner i celler, der udsættes for MS275.Mens cellerne inkuberes, forberede fortyndinger af A-485 i DMSO i henhold til manuskript retninger. Når inkubationen er færdig, aspirere mediet fra brøndene og tilsæt fortyndinger. Returner cellerne til inkubatoren og kultur dem i 20 timer, derefter aspirere cellekultur medium fra brøndene og vaske cellerne med en milliliter PBS.Aspirere PBS og tilsæt 100 mikroliter af passiv lysis buffer. Opbevar pladen på minus 80 grader Celsius natten over. Pipette 100 mikroliter af sonikeret kromatin fra celler behandlet med DMSO i to 1,5 milliliterrør, derefter pipette 400 mikroliter ChIP fortynding buffer til hvert rør til at bringe den samlede volumen op til 500 mikroliter.Fjern fem mikroliter af opløsningen fra et af rørene og opbevar den ved minus 20 grader Celsius som DMSO-indgang. Forbered to rør med sonikeret kromatin fra celler behandlet med A-485 på samme måde. Brug en pipette til at tilføje IgG og H3K27 acetyl antistoffer til DMSO og A-485 prøver.Derefter tilsættes 20 mikroliter protein En magnetisk perler til hvert rør, og sørg for, at perlerne er godt resuspenderet. Drej prøverne natten over ved fire grader Celsius. Pellet proteinet En magnetisk perler ved hjælp af en magnetisk separator og fjern supernatanten uden at forstyrre perlerne.Vask perlerne med 500 mikroliter til en milliliter lav salt vask buffer og rotere dem i fem minutter ved fire grader Celsius. Udfør en hurtig spin ned, pellet perlerne med en magnetisk separator og fjern supernatanten. Gentag vaskeproceduren med høj saltvaskbuffer, lithiumchloridvaskbuffer og TE-buffer.Efter vask med TE buffer, fjerne input prøver fra fryseren og læg dem på is. Tø en aliquot af proteinase K, derefter pellet perlerne ved hjælp af en magnetisk separator og fjern TE buffer fra perlerne. Der tilsættes 100 mikroliter ChIP-elution-buffer og en mikroliter proteinase K til hver prøve, herunder inputprøverne, og der inkuberes dem med omrystning ved 62 grader Celsius i to timer ved hjælp af en termocykmager.Efter inkubationen opvarmes prøverne til 95 grader Celsius i 10 minutter, og afkøles dem derefter til stuetemperatur. Pellet de magnetiske perler med en magnetisk separator og overføre DNA-holdige supernatant til en ny 1,5 milliliter rør. Rens DNA'et ved hjælp af et standard PCR-oprydningssæt, og kør qPCR.In vitro histone acetyltransferase-analysen blev anvendt til at undersøge virkningen af anacardinsyre på p300 HAT-aktivitet mod et histoneubstrat. Der blev testet et koncentrationsområde, og der blev ikke føjet acetyl-CoA til den negative kontrolreaktion. Immunoblotresultaterne blev kvantificeret med ImageJ, der viste en klar reduktion i acetyl H3K18 og acetyl H3K9 ved 100 mikromolaranakardisyre sammenlignet med DMSO-kontrollen.I chromatin hyper-acetylation hæmningsanalyse, behandling af MCF-7 celler med HDACi MS275 stærkt upregulated acetylation af histone 3 på flere lysin rester. De basale niveauer af acetyl H3K18 og acetyl H3K27 var lave, viser fordelene ved at tilføje en HDACi i ChHAI assay. Tilføjelsen af A-485 i celler forbehandlet med MS275 dæmper den øgede histoneacetylation ved H3K18 og H3K27, men ikke H3K9.Immunoblotresultaterne blev også kvantificeret med ImageJ. ChIP qPCR blev brugt til at undersøge virkningerne af HAT-hæmmere på genregulerende elementer, der styrer oncogene ekspression. I DMSO-prøven frembragte DET DNA, der blev udfældet af IgG-kontrolantistoffet, en højere ct-værdi end acetyl H3K27-antistoffet i qPCR-reaktionen for cyclin D1-promotoren, hvilket indikerer, at den ikke-specifikke IgG-kontrol udfældede mindre DNA histonekomplekser end acetyl H3K27-specifikt antistof hos promotoren.Sammenlignet med DMSO-kontrollen reducerede A-485 acetyl H3K27-berigelsen ved cyclin D1-promotoren. Vigtigere er det, A-485 er kendt for at reducere acetyl H3K27 i cellekultur. Når du forsøger denne protokol, huske på, at før inkubation trin in vitro HAT og ChHAI assays er afgørende og bør ikke glemmes.Det er også vigtigt at huske at gemme inputprøverne og undgå tab af perlerne under ChIP. Efter at have udført disse procedurer, ChIP-seq er en ekstra metode, der kan udføres for at få globale oplysninger om histone acetylation på lovgivningsmæssige elementer for hele genomet. Disse protokoller er nyttige for forskere til omhyggeligt at validere nye HAT-hæmmere og for at undgå at offentliggøre kemiske lavkvalitetssonder i litteraturen.De validerede HAT-hæmmere kan gennemgå yderligere udvikling som potentielle behandlingslinjer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Analyser til Undersøgelse makrofag og Mikroglia Stimulering af glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Prækliniske vurdering af Bioactivity af Anticancer cumarin OT48 af Spheroids, koloni dannelse Assays og zebrafisk Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Vurdering af resistens over for tyrosin Kinase hæmmere af en afhøring af signaltransduktionsveje af antistof Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Undersøgelse af genetiske afhængigheder ved hjælp af CRISPR-Cas9-baserede konkurrence Assays

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Gær som et chassis til udvikling af funktionelle assays til undersøgelse af humane P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering af virkningerne af Migrastatiske hæmmere på 3D tumor Spheroid invasion af høj opløsning Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kombineret brug af hale vene metastase assays og Real-Time in vivo billeddannelse at kvantificere brystkræft metastatisk kolonisering og byrde i lungerne

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Vurdering af cellulære målengagement ved SHP2 (PTPN11) Fosfatasehæmmere

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identifikation af EGFR- og RAS-hæmmere ved hjælp af Caenorhabditis-eliminer

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...