Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van James en Esther King Biomedical Research Program (6JK03 en 20K07), en Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 en 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation, en UF Health Cancer Center. Daarnaast willen we Dr. Zachary Osking en Dr. Andrea Lin bedanken voor hun steun tijdens het publicatieproces.

1. In vitro HAT-test
<ol><li>Buffervoorbereiding LET OP: Zie tabel 1 voor bufferrecepten.<ol>
<li>Bereid 5x testbuffer en 6x Natrium Dodecyl Sulfaat (SDS) en bewaar bij -20 °C. Aliquot SDS in 1 mL aliquots.</li>
		<li>Bereid 10x SDS gel running buffer en 10x TBST en op te slaan op kamertemperatuur.</li>
		<li>Bereid 1x transferbuffer voor en bewaar bij 4 °C. LET OP: Controleer het veiligheidsinformatieblad voor alle chemische stoffen die in dit protocol worden gebruikt. SDS, D...

Lysine acetyltransferases (KATs) acetylaat verschillende lysine residuen op histon staarten en transcriptie factoren om gen transcriptie te reguleren2,3. Uit onderzoek in de afgelopen twee decennia is gebleken dat KAT's, zoals CBP/p300, PCAF en GCN5, interageren met oncogene transcriptiefactoren en tumorgroei stimuleren in verschillende vaste tumortypen4,5,9,<...

Lysine acetyltransferases (KAT's) katalyseren de acetylatie van lysineresiduen op zowel histon- als niet-histoneiwitten1,2,3,4. Recent onderzoek toont aan dat DE's en hun acetyltransferase functie kan bevorderen vaste tumorgroei4,5,6,7,8,9. Creb-bindend eiwit (CBP)/p300 zijn bijvoorbeeld twee paralogeuze KAT's die talrijke signaleringstrajecten bij kanker2,3reguleren . CBP/p300 hebben een goed gekarakteriseerde histon acetyltransferase (HAT) functie en katalyseren Histone 3 Lysine 27 acetylatie (H3K27ac)2,4,5,10,11, een belangrijke marker voor actieve versterkers, promotor regio's en actieve gen transcriptie12,13,14. CBP/p300 dienen als kritische co-activators voor pro-groeisignaleringstrajecten in vaste tumoren door transcriptie van oncogenen te activeren door acetylatie van histonen en andere transcriptiefactoren4,9,15,16,17,18.9 Vanwege hun rol in tumorprogressie worden CBP/p300 en andere KAT's onderzocht op de ontwikkeling van nieuwe remmers die hun oncogene functie4,5,6,7,,8,9,18,19,20blokkeren . A-485 en GNE-049 vertegenwoordigen twee succesvolle pogingen om krachtige en specifieke remmers te ontwikkelen voor CBP/p3004,9. Aanvullende remmers worden momenteel onderzocht voor CBP/p300 en andere KAT's.
De kwaliteit van eerder beschreven KAT-remmers (KATi) wordt in twijfel getrokken, waarbij veel remmers met doeleffecten en slechte karakterisering21pronken. Daarom is rigoureuze karakterisering en validatie van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen essentieel voor de ontwikkeling van hoogwaardige chemische sondes. Hier beschreven zijn drie protocollen die een pijplijn vormen voor screening en rigoureus valideren van de potentie en specificiteit van nieuwe KATi, met een specifieke focus op het remmen van de HAT-functie (HATi) van KATs. CBP/p300 en hun remmers worden gebruikt als voorbeelden, maar deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere KAT's die een HAT-functiehebben 7.
Het eerste protocol is een in vitro histon acetyltransferase (HAT) test die gezuiverde recombinant p300 en histonen gebruikt in een gecontroleerde reageerbuisreactie. Deze test is eenvoudig uit te voeren, is kosteneffectief, kan worden gebruikt om verbindingen te screenen in een lage doorvoerinstelling en vereist geen radioactieve materialen. In dit protocol wordt recombinant p300 lysineacetylatie op histonstaarten tijdens een korte incubatieperiode en de niveaus van histonacetylatie gemeten met behulp van standaard immunoblottingsprocedures. De enzymatische reactie kan worden uitgevoerd in de aanwezigheid of afwezigheid van CBP/p300-remmers om te screenen op verbindingen die histonacetylatie verminderen. Bovendien kan de HAT-test worden gebruikt om na te gaan of nieuwe verbindingen selectief zijn voor cbp/p300 door hun activiteit te beoordelen op andere gezuiverde KAT's, zoals PCAF. De HAT-test is een uitstekend uitgangspunt voor het onderzoeken van nieuwe remmers vanwege de eenvoud, lage kosten en de mogelijkheid om de potentie/selectiviteit van een remmer te bepalen. Inderdaad, dit protocol wordt vaak gebruikt in de literatuur als een in vitro scherm5,10. Echter, remmers geïdentificeerd in de HAT-test zijn niet altijd effectief in de celcultuur, omdat een reageerbuis reactie is veel eenvoudiger dan een levend celsysteem. Daarom is het essentieel om remmers verder te karakteriseren in celkweekexperimenten22,23.
Het tweede protocol in de pijplijn is de Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) test. Deze cel gebaseerde test maakt gebruik van histone deacetylase remmers (HDACi) als een instrument om histonen hyperacetylate in chromatine voor co-incubatie met een HATi24. Basale histonacetylatie kan laag zijn in de celcultuur, waardoor het moeilijk is om via immunoblotting te sonde zonder de toevoeging van een HDACi om acetylatie te verhogen. Het doel van de ChHAI-test is het identificeren van nieuwe HATi die de toename van histonacetylatie veroorzaakt door HDAC-remming kan verzachten. De voordelen van deze test zijn de lage kosten, relatieve gemak uit te voeren, en het gebruik van cellen in de cultuur, die meer fysiologische relevantie dan de reageerbuis HAT test biedt. Net als bij de HAT-test maakt dit protocol gebruik van standaard immunoblotting voor het verzamelen van gegevens.
De HAT en ChHAI testen geven gegevens over de potentie van nieuwe verbindingen voor het remmen van wereldwijde histonacetylatie, maar geven geen inzicht in hoe deze verbindingen wijzigingen in specifieke genomische regio's beïnvloeden. Daarom is het uiteindelijke protocol, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) een celkweekexperiment dat DNA-eiwitinteracties onderzoekt in specifieke gebieden van het genoom. In het ChIP-protocol wordt chromatine gekoppeld om DNA-eiwitinteracties te behouden. De chromatine wordt vervolgens uit cellen geëxtraheerd en het DNA-eiwitcomplex ondergaat selectieve immunoprecipitatie voor het eiwit van belang (bijvoorbeeld met behulp van een antilichaam specifiek voor H3K27ac). Het DNA wordt vervolgens gezuiverd en geanalyseerd met behulp van qPCR. ChIP-qPCR kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te bepalen of een nieuwe HATi histonacetylatie downreguleert bij individuele oncogenen, zoals Cyclin D125. Hoewel ChIP-qPCR een veelgebruikte techniek is die in het veld wordt gebruikt, kan het moeilijk zijn om4,10,,26te optimaliseren . Dit protocol biedt tips voor het vermijden van mogelijke valkuilen die kunnen optreden tijdens het uitvoeren van de ChIP-qPCR-procedure en bevat kwaliteitscontroles die op de gegevens moeten worden uitgevoerd.
Wanneer ze samen worden gebruikt, maken deze drie protocollen het mogelijk om nieuwe HATi rigoureus te karakteriseren en valideren. Bovendien bieden deze methoden veel voordelen omdat ze gemakkelijk uit te voeren zijn, relatief goedkoop en gegevens te verstrekken over zowel wereldwijde als regionale histonacetylatie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) katalyseren acetylatie van lysineresiduen op histonen en andere eiwitten om chromatinedynamica en genexpressie te reguleren. KATs, zoals CBP/p300, worden intensief onderzocht als therapeutische doelstellingen toe te schrijven aan hun kritieke rol in tumorigenese van diverse kankers. De ontwikkeling van nieuwe kleine molecuulremmers gericht op de histon acetyltransferase (HAT) functie van KATs is uitdagend en vereist robuuste tests die de specificiteit en potentie van potentiële remmers kunnen valideren.
Dit artikel schetst een pijplijn van drie methoden die rigoureuze in vitro validatie voor nieuwe HAT-remmers (HATi) bieden. Deze methoden omvatten een reageerbuis HAT-test, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) test, en Chromatine Immunoprecipitatie-kwantitatieve PCR (ChIP-qPCR). In de HAT-test worden recombinant HAT's geïncubeerd met histonen in een reageerbuisreactie, waardoor specifieke lysineresiduen op de histonstaarten kunnen worden geaced. Deze reactie kan worden geblokkeerd door een HATi en de relatieve niveaus van site-specifieke histonacetylatie kunnen worden gemeten via immunoblotting. Remmers geïdentificeerd in de HAT-test moeten worden bevestigd in de cellulaire omgeving.
De ChHAI-test gebruikt immunoblotting om te screenen op nieuwe HATi die de robuuste hyperacetylatie van histonen verzwakt, veroorzaakt door een histone deacetylase inhibitor (HDACi). De toevoeging van een HDACi is nuttig omdat basale niveaus van histonacetylatie moeilijk te detecteren zijn via immunoblotting.
De HAT en ChHAI testen meten wereldwijde veranderingen in histon acetylatie, maar geven geen informatie over acetylatie in specifieke genomische regio's. Daarom wordt ChIP-qPCR gebruikt om de effecten van HATi op histonacetylatieniveaus op genregulerende elementen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door selectieve immunoprecipitatie van histon-DNA complexen en analyse van het gezuiverde DNA via qPCR. Samen, deze drie tests zorgen voor de zorgvuldige validatie van de specificiteit, potentie, en werkingsmechanisme van de nieuwe HATi.

De in vitro histon acetyltransferase (HAT) test kan worden gebruikt om te sonde voor verbindingen die p300 HAT activiteit remmen in de richting van een histon substraat. Figuur 1A biedt een experimenteel schema voor de HAT-test. Anacardzuur, een bekende HATi3,38, werd gebruikt in deze test in een concentratiebereik van 12,5-100 μM. Bij 100 μM, anacardzuur downreguleert p300 gekatalyseerd histon acetylatie op Histone 3, Lysines 9 en...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Remmers van histonacetyltransferases (HAT's, ook bekend als lysine acetyltransferasen), zoals CBP/p300, zijn potentiële therapieën voor de behandeling van kanker. Er zijn echter rigoureuze methoden nodig om deze remmers te valideren. Drie in vitro methoden voor validatie omvatten HAT-tests met recombinant acetyltransferases, immunoblotting voor histonacetylatie in de celcultuur en ChIP-qPCR.

Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Deze protocollen zijn belangrijk omdat ze gedetailleerde stappen bieden voor validatie van de potentie en selectiviteit van nieuwe HAT-remmers, die belangrijke onderzoeksinstrumenten en potentiële therapieën zijn. De technieken die in deze video worden aangetoond zijn gemakkelijk uit te voeren en geven informatie over de effecten van HAT-remmers op wereldwijde en regionale histonacetylatie. Ze maken het mogelijk om epigenetische regulatie van genexpressie te begrijpen.Aandacht voor de details is van cruciaal belang. Het is belangrijk om de protocollen stap voor stap te volgen. Begin met het voorbereiden van de enzymatische reactie in een 10 microliter volume in een 0,2 milliliter PCR buis volgens manuscript aanwijzingen.Vervolgens incubeer het volledige reactiemengsel bij 30 graden Celsius gedurende een uur in een PCR thermische cycler. Voeg ondertussen twee mercaptoethanol toe met een verhouding van één tot 10 aan de 6X SDS-monsterbuffer. Verwijder monsters uit de PCR thermische cycler en voeg twee microliters van de voorbereide SDS monster buffer aan elke reactie mix.Verwarm de monsters vijf minuten lang op 95 graden Celsius op een hitteblok en koel ze af op ijs. Bewaar de monsters op min 20 of min 80 graden Celsius of ga verder met gelelektroforese en immunoblotting. Zaad 100,000 MCF-7 cellen in een milliliter van celcultuur medium in elke put van een 12-well plaat en laat de cellen groeien tot 80 tot 90%samenvloeiing.Wanneer de cellen de gewenste samenvloeiing bereiken, het medium celkweek uit putten vier, vijf en zes, en pipet een milliliter van drie micromolar MS275 in medium in elke put. Dan aspirate de cel cultuur medium uit putten een, twee, en drie, en pipet een milliliter verdunde DMSO in elke put. Breng de cellen vier uur terug naar de couveuse om ophoping van geacetyleerde histonen mogelijk te maken in cellen die zijn blootgesteld aan MS275.Terwijl de cellen uitbroeden, bereiden verdunningen van A-485 in DMSO volgens manuscript richtingen. Wanneer de incubatie is voltooid, aspirate het medium uit de putten en voeg de verdunningen. Breng de cellen terug naar de couveuse en kweek ze gedurende 20 uur, vervolgens het celcultuurmedium uit de putten aan te halen en was de cellen met een milliliter PBS.Aspirate de PBS en voeg 100 microliters van passieve lyse buffer. Bewaar de plaat op min 80 graden Celsius 's nachts. Pipette 100 microliter van geson soniceerde chromatine uit cellen behandeld met DMSO in twee 1,5 milliliter buizen, dan pipette 400 microliters van ChIP verdunning buffer aan elke buis om het totale volume te brengen tot 500 microliter.Verwijder vijf microliter van de oplossing uit een van de buizen en bewaar deze bij min 20 graden Celsius als DMSO-ingang. Bereid twee buizen met gesonische chromatine uit cellen behandeld met A-485 op dezelfde manier. Gebruik een pipet om de IgG en H3K27 acetyl antistoffen toe te voegen aan de DMSO en A-485 monsters.Voeg vervolgens 20 microliter eiwit Een magnetische kralen aan elke buis, ervoor te zorgen dat de kralen goed zijn opgesuspend. Draai de monsters 's nachts op vier graden Celsius. Pellet het eiwit Een magnetische kralen met behulp van een magnetische afscheider en verwijder de supernatant zonder verstoring van de kralen.Was de kralen met 500 microliter tot een milliliter lage zoutwasbuffer en draai ze vijf minuten op vier graden Celsius. Voer een snelle spin down, pellet de kralen met een magnetische afscheider en verwijder de supernatant. Herhaal de wasprocedure met een hoge zoutwasbuffer, een wasbuffer voor lithiumchloride en een TE-buffer.Na de was met TE-buffer, verwijder de input monsters uit de vriezer en zet ze op ijs. Ontdooi een aliquot van proteinase K, pellet de kralen met behulp van een magnetische afscheider en verwijder de TE-buffer uit de kralen. Voeg 100 microliters chip elution buffer en een microliter van proteinase K aan elk monster met inbegrip van de input monsters en incubeer ze met schudden op 62 graden Celsius gedurende twee uur met behulp van een thermocycler.Verwarm na de incubatie de monsters gedurende 10 minuten tot 95 graden Celsius en koel ze af tot kamertemperatuur. Pellet de magnetische kralen met een magnetische afscheider en breng het DNA-bevattende supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Zuiver het DNA met behulp van een standaard PCR cleanup kit en voer qPCR uit.De in vitro histon acetyltransferase test werd gebruikt om het effect van anacardzuur op p300 HAT activiteit te onderzoeken naar een histon substraat. Een concentratiebereik werd getest en acetyl-CoA werd niet toegevoegd aan de negatieve controlereactie. De immunoblot resultaten werden gekwantificeerd met ImageJ, waaruit een duidelijke vermindering van acetyl H3K18 en acetyl H3K9 op 100 micromolar anacardic zuur in vergelijking met de DMSO controle.In de chromatine hyper-acetylatie remmingstest, behandeling van MCF-7 cellen met HDACi MS275 sterk upregulated acetylation van histone 3 op verschillende lysine residuen. De basale niveaus van acetyl H3K18 en acetyl H3K27 waren laag, waaruit de voordelen van het toevoegen van een HDACi in de ChHAI test. De toevoeging van A-485 in cellen die zijn voorbehandeld met MS275 verzwakt de verhoogde histonacetylatie bij H3K18 en H3K27, maar niet H3K9.De immunoblot resultaten werden ook gekwantificeerd met ImageJ. ChIP qPCR werd gebruikt om de effecten van HAT-remmers te onderzoeken op genregulerende elementen die de oncogene expressie controleren. In het DMSO-monster produceerde het DNA dat door het IgG-bestrijdingsantilichaam werd neergeslagen een hogere Ct-waarde dan het acetyl H3K27-antilichaam in de qPCR-reactie voor de cyclische D1-promotor, wat aangeeft dat de niet-specifieke IgG-controle minder DNA-histoncomplexen neerpelde dan het acetyl H3K27-specifieke antilichaam bij de promotor.Vergeleken met de DMSO controle, A-485 verminderde acetyl H3K27 verrijking bij de cyclische D1 promotor. Belangrijk is dat A-485 is bekend dat aanzienlijk te verminderen acetyl H3K27 in celcultuur. Houd er bij een poging dit protocol rekening mee dat de pre-incubatiestappen van de in vitro HAT en ChHAI-tests essentieel zijn en niet mogen worden vergeten.Het is ook belangrijk om te onthouden om de input monsters op te slaan en om verlies van de kralen tijdens ChIP te voorkomen. Na het uitvoeren van deze procedures is ChIP-seq een aanvullende methode die kan worden uitgevoerd om wereldwijde informatie over histonacetylatie te verkrijgen bij regulerende elementen voor het hele genoom. Deze protocollen zijn nuttig voor wetenschappers om nieuwe HAT-remmers zorgvuldig te valideren en te voorkomen dat er chemische sondes van lage kwaliteit in de literatuur worden gepubliceerd.De gevalideerde HAT-remmers kunnen zich verder ontwikkelen als potentiële therapieën.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Preklinische beoordeling van het topicale van de antikanker cumarine-OT48 door spheroïden, kolonie vorming Assays en Zebrafish Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Beoordeling van weerstand tegen Tyrosine Kinase remmers door een ondervraging van signaaltransductie trajecten door antilichaam Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Onderzoek naar genetische afhankelijkheden met behulp van CRISPR-Cas9-concurrentie op basis van testen

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Gist als chassis voor het ontwikkelen van functionele assays voor het bestuderen van menselijke P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Beoordeling van Cellular Target Engagement door SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identificatie van EGFR- en RAS-remmers met Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...