Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Ce travail a été appuyé par des subventions de James et Esther King Biomedical Research Program (6JK03 et 20K07), et Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 et 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation, et UF Health Cancer Center. De plus, nous tenons à remercier le Dr Zachary Osking et le Dr Andrea Lin pour leur soutien au cours du processus de publication.

1. Essai in vitro de HAT
<ol><li>Préparation tampon REMARQUE : Voir le tableau 1 pour les recettes tampon.<ol>
<li>Préparer le tampon d’essai 5x et le sulfate de Dodecyl de sodium (SDS) et conserver à -20 °C. Aliquot SDS en 1 mL aliquots.</li>
		<li>Préparer 10x gel SDS tampon de fonctionnement et 10x TBST et stocker à température ambiante.</li>
		<li>Préparer le tampon de transfert 1x et conserver à 4 °C. ATTENTION : Vérifiez la fiche de données de sécurité pour...

Lysine acétyltransférases (KATs) acetylate plusieurs résidus de lysine sur les queues d’histone et les facteurs de transcription pour réguler la transcriptiongénique 2,3. Les travaux des deux dernières décennies ont révélé que les KAT, tels que CBP/p300, PCAF et GCN5, interagissent avec les facteurs de transcription oncogène et aident à stimuler la croissance tumorale dans plusieurs types de tumeurs solides4,<sup c...

Les acétyltransférases de lysine (KATs) catalysent l’acétylation des résidus de lysine sur les protéines histone et non-histone1,2,3,4. Des recherches récentes révèlent que les KAT et leur fonction d’acétyltransférase peuvent favoriser la croissance de tumeur solide4,5,6,7,8,9. Par exemple, les protéines liant le CREB (CBP)/p300 sont deux KAT paralogues qui régulent de nombreuses voies de signalisation dans le cancer2,3. CBP/p300 ont une fonction d’acétyltransférase d’histone bien caractérisée (HAT) et catalysent Histone 3 Lysine 27 acétylation (H3K27ac)2,4,5,10,11, un marqueur important pour les exhausteurs actifs, les régions de promoteur et la transcription active de gène12,13,14. CBP/p300 servent de co-activateurs critiques pour les voies de signalisation pro-croissance dans les tumeurs solides en activant la transcription des oncogènes par acétylation des histones et d’autres facteurs de transcription4,9,15,16,17,18. En raison de leur rôle dans la progression de tumeur, CBP/p300 et d’autres KATs sont à l’étude pour le développement de nouveaux inhibiteurs qui bloquent leur fonction oncogène4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 et GNE-049 représentent deux tentatives réussies de développer des inhibiteurs puissants et spécifiques pour CBP/p3004,9. D’autres inhibiteurs font actuellement l’objet d’une enquête pour le CBP/p300 et d’autres TCA.
La qualité des inhibiteurs kat précédemment décrits (KATi) est remise en question, avec de nombreux inhibiteurs montrant les effets cibles et une mauvaise caractérisation21. Par conséquent, une caractérisation rigoureuse et la validation de nouveaux médicaments candidats sont essentielles au développement de sondes chimiques de haute qualité. Voici trois protocoles qui forment un pipeline pour le dépistage et la validation rigoureuse de la puissance et de la spécificité du nouveau KATi, avec un accent spécifique sur l’inhibition de la fonction HAT (HATi) des KAT. CBP/p300 et leurs inhibiteurs sont utilisés comme exemples, mais ces protocoles peuvent être adaptés pour d’autres KAT qui ont une fonction HAT7.
Le premier protocole est un test in vitro d’acétyltransférase d’histone (HAT) qui utilise le p300 recombinant purifié et les histones dans une réaction contrôlée de tube à essai. Ce test est simple à effectuer, est rentable, peut être utilisé pour filtrer les composés dans un réglage à faible débit, et ne nécessite pas de matières radioactives. Dans ce protocole, le p300 recombinant catalyse l’acétylation de lysine sur les queues d’histone pendant une brève période d’incubation et les niveaux d’acétylation d’histone sont mesurés à l’aide de procédures standard d’immunoblotting. La réaction enzymatique peut être effectuée en présence ou en l’absence d’inhibiteurs CBP/p300 pour dépister les composés qui réduisent l’acétylation de l’histone. En outre, l’essai hat peut être utilisé pour vérifier si les nouveaux composés sont sélectifs pour le CBP/p300 en évaluant leur activité par rapport à d’autres KAT purifiés, tels que le PCAF. L’essai HAT est un excellent point de départ pour étudier de nouveaux inhibiteurs en raison de sa simplicité, faible coût, et la capacité de déterminer la puissance / sélectivité d’un inhibiteur. En effet, ce protocole est souvent utilisé dans la littérature comme un écran in vitro5,10. Cependant, les inhibiteurs identifiés dans l’essai hat ne sont pas toujours efficaces dans la culture cellulaire parce qu’une réaction de tube à essai est beaucoup plus simple qu’un système de cellules vivantes. Par conséquent, il est essentiel de caractériser davantage les inhibiteurs dans les expériences de culture cellulaire22,23.
Le deuxième protocole dans le pipeline est le test d’inhibition de l’hyperacétylation de la chrométine (ChHAI). Ce test à base de cellules utilise des inhibiteurs de la dacetylase histone (HDACi) comme un outil pour hyperacétiller les histones dans la chromatine avant co-incubation avec un HATi24. L’acétylation d’histone basal peut être faible dans la culture cellulaire, ce qui rend difficile de sonder pour par l’immunoblotting sans l’ajout d’un HDACi pour augmenter l’acétylation. Le but de l’essai de ChHAI est d’identifier le roman HATi qui peut atténuer l’augmentation de l’acétylation d’histone provoquée par l’inhibition de HDAC. Les avantages de cet essai incluent son faible coût, la facilité relative à effectuer, et l’utilisation des cellules dans la culture, qui fournit plus de pertinence physiologique que le test de hat de tube à essai. Semblable à l’essai HAT, ce protocole utilise l’immunoblotting standard pour la collecte de données.
Les tests HAT et ChHAI fournissent des données sur la puissance de nouveaux composés pour inhiber l’acétylation de l’histone globale, mais ne fournissent pas de perspicacité dans la façon dont ces composés affectent les modifications dans des régions génomiques spécifiques. Par conséquent, le protocole final, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) est une expérience de culture cellulaire qui étudie les interactions ADN-protéines à des régions spécifiques du génome. Dans le protocole ChIP, la chromatine est croisée pour préserver les interactions ADN-protéines. La chromatine est ensuite extraite des cellules et le complexe ADN-protéine subit une immunoprécipitation sélective pour la protéine d’intérêt (p. ex., à l’aide d’un anticorps spécifique au H3K27ac). L’ADN est ensuite purifié et analysé à l’aide de qPCR. Par exemple, ChIP-qPCR peut être utilisé pour déterminer si un roman HATi downregulates histone acétylation à des oncogènes individuels, tels que Cyclin D125. Bien que ChIP-qPCR soit une technique courante utilisée sur le terrain, il peut être difficile d’optimiser4,,10,26. Ce protocole fournit des conseils pour éviter les pièges potentiels qui peuvent se produire lors de l’exécution de la procédure ChIP-qPCR et comprend des contrôles de qualité qui doivent être effectués sur les données.
Lorsqu’ils sont utilisés ensemble, ces trois protocoles permettent la caractérisation rigoureuse et la validation du nouveau HATi. En outre, ces méthodes offrent de nombreux avantages parce qu’elles sont faciles à exécuter, relativement bon marché et fournissent des données sur l’acétylation mondiale ainsi que régionale d’histone.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

Les acétyltransférases de lysine (KATs) catalysent l’acétylation des résidus de lysine sur les histones et d’autres protéines pour réguler la dynamique de la chromatine et l’expression des gènes. KaTs, tels que CBP/p300, font l’objet d’une étude intense en tant que cibles thérapeutiques en raison de leur rôle critique dans la tumeur de divers cancers. Le développement de nouveaux inhibiteurs de petites molécules ciblant la fonction d’acétyltransférase histone (HAT) des KAT est difficile et nécessite des essais robustes qui peuvent valider la spécificité et la puissance des inhibiteurs potentiels.
Cet article décrit un pipeline de trois méthodes qui fournissent une validation in vitro rigoureuse pour les nouveaux inhibiteurs de la HAT (HATi). Ces méthodes incluent un test hat de tube d’essai, l’essai d’inhibition d’hyperacétylation de chromatine (ChHAI), et le PCR immunoprécipitation-quantitative de chromatine (ChIP-qPCR). Dans l’essai hat, les HAT recombinants sont incubés avec des histones dans une réaction de tube à essai, permettant l’acétylation des résidus spécifiques de lysine sur les queues d’histone. Cette réaction peut être bloquée par un HATi et les niveaux relatifs d’acétylation d’histone spécifique au site peuvent être mesurés par immunoblotting. Les inhibiteurs identifiés dans l’essai de la HAT doivent être confirmés dans l’environnement cellulaire.
L’essai de ChHAI utilise l’immunoblotting pour dépister le nouveau HATi qui atténue l’hyperacétylation robuste des histones induite par un inhibiteur de la déacétylase d’histone (HDACi). L’ajout d’un HDACi est utile parce que les niveaux basaux de l’acétylation histone peut être difficile à détecter par immunoblotting.
Les tests HAT et ChHAI mesurent les changements globaux dans l’acétylation de l’histone, mais ne fournissent pas d’informations concernant l’acétylation dans des régions génomiques spécifiques. Par conséquent, ChIP-qPCR est utilisé pour étudier les effets de HATi sur les niveaux d’acétylation de l’histone aux éléments de régulation des gènes. Ceci est accompli par l’immunoprécipitation sélective des complexes histone-ADN et l’analyse de l’ADN purifié par qPCR. Ensemble, ces trois essais permettent la validation minutieuse de la spécificité, de la puissance et du mécanisme d’action du nouveau HATi.

L’essai in vitro d’acétyltransférase d’histone (HAT) peut être employé pour sonder pour des composés qui inhibent l’activité de p300 HAT vers un substrat d’histone. La figure 1A fournit un schéma expérimental pour l’essai HAT. L’acide anacardique, un HATi3,38connu, a été utilisé dans ce test dans une gamme de concentration de 12,5 à 100 μM. À 100 μM, l’acide anacardique descend par la p300 catalysé l?...

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Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Les inhibiteurs de l’hétone acétyltransférases (HATs, également connu sous le nom d’acétyltransférases de lysine), tels que CBP/p300, sont des traitements potentiels pour traiter le cancer. Cependant, des méthodes rigoureuses pour valider ces inhibiteurs sont nécessaires. Trois méthodes in vitro pour la validation incluent des essais de HAT avec des acétyltransférases recombinantes, l’immunoblotting pour l’acétylation d’histone dans la culture cellulaire, et ChIP-qPCR.

Tests de validation des inhibiteurs de l’histone d’acétyltransférase

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Ces protocoles sont importants parce qu’ils fournissent des étapes détaillées pour la validation de la puissance et de la sélectivité des nouveaux inhibiteurs de la HAT, qui sont d’importants outils de recherche et des thérapeutiques potentielles. Les techniques démontrées dans cette vidéo sont faciles à exécuter et fournissent des informations sur les effets des inhibiteurs de la HAT sur l’acétylation histone mondiale et régionale. Ils permettent de comprendre la régulation épigénétique de l’expression des gènes.L’attention portée aux détails est essentielle. Il est important de suivre les protocoles étape par étape. Commencez par préparer la réaction enzymatique dans un volume de 10 microlitres à l’intérieur d’un tube PCR de 0,2 millilitre selon les instructions manuscrites.Puis incuber le mélange de réaction complet à 30 degrés Celsius pendant une heure dans un cycleur thermique PCR. Pendant ce temps, ajouter deux mercaptoéthanol à un rapport d’un à 10 au tampon échantillon 6X SDS. Retirez les échantillons du cycleur thermique PCR et ajoutez deux microlitres du tampon d’échantillon SDS préparé à chaque mélange de réaction.Chauffer les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes sur un bloc de chaleur, puis les refroidir sur la glace. Conservez les échantillons à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius ou procédez à l’électrophorésie du gel et à l’immunoblotting. Graine 100 000 cellules MCF-7 dans un millilitre de milieu de culture cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 12 puits et permettre aux cellules de croître à 80 à 90% de confluence.Lorsque les cellules atteignent la confluence désirée, aspirer le milieu de culture cellulaire à partir des puits quatre, cinq et six, et pipette un millilitre de trois micromolaire MS275 en milieu dans chaque puits. Ensuite, aspirez le milieu de culture cellulaire à partir des puits un, deux et trois, et pipette un millilitre de DMSO dilué dans chaque puits. Retourner les cellules dans l’incubateur pendant quatre heures pour permettre l’accumulation d’histones acétylées dans les cellules exposées au MS275.Pendant que les cellules couvent, préparez des dilutions d’A-485 dans DMSO selon les directives manuscrites. Lorsque l’incubation est terminée, aspirer le milieu des puits et ajouter les dilutions. Retournez les cellules à l’incubateur et culturez-les pendant 20 heures, puis aspirez le milieu de culture cellulaire des puits et lavez les cellules avec un millilitre de PBS.Aspirez le PBS et ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse passive. Conservez la plaque à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Pipette 100 microlitres de chromatine sonique à partir de cellules traitées avec DMSO en deux tubes de 1,5 millilitre, puis pipette 400 microlitres de tampon de dilution ChIP à chaque tube pour porter le volume total jusqu’à 500 microlitres.Retirez cinq microlitres de la solution de l’un des tubes et rangez-les à moins 20 degrés Celsius sous forme d’entrée DMSO. Préparer deux tubes avec de la chromatine sonique à partir de cellules traitées avec A-485 de la même manière. Utilisez une pipette pour ajouter les anticorps d’acétyl IgG et H3K27 aux échantillons DMSO et A-485.Ajoutez ensuite 20 microlitres de protéines A perles magnétiques à chaque tube, en s’assurant que les perles sont bien résuspendues. Faites pivoter les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Pelleter la protéine A perles magnétiques à l’aide d’un séparateur magnétique et enlever le supernatant sans déranger les perles.Lavez les perles avec 500 microlitres à un millilitre de tampon de lavage à faible teneur en sel et faites-les pivoter pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Effectuez une rotation rapide vers le bas, pelleter les perles avec un séparateur magnétique et enlever le supernatant. Répétez la procédure de lavage avec tampon de lavage à haute teneur en sel, tampon de lavage au chlorure de lithium, et tampon TE.Après le lavage avec tampon TE, retirer les échantillons d’entrée du congélateur et les mettre sur la glace. Décongeler un aliquot de proteinase K, puis pelleter les perles à l’aide d’un séparateur magnétique et enlever le tampon TE des perles. Ajouter 100 microlitres de tampon d’élitution ChIP et un microlitre de proteinase K à chaque échantillon, y compris les échantillons d’entrée et les incuber avec secouant à 62 degrés Celsius pendant deux heures à l’aide d’un thermocyclre.Après l’incubation, chauffer les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis les refroidir à température ambiante. Pelleter les perles magnétiques à l’intérieur d’un séparateur magnétique et transférer le supernatant contenant de l’ADN dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Purifier l’ADN à l’aide d’un kit de nettoyage PCR standard et exécuter qPCR.L’analyse in vitro d’acétyltransferase d’histone a été employée pour étudier l’effet de l’acide anacardique sur l’activité de HAT de p300 vers un substrat d’histone. Une plage de concentration a été testée et l’acétyl-CoA n’a pas été ajouté à la réaction de contrôle négative. Les résultats d’immunoblot ont été quantifiés avec ImageJ, montrant une réduction claire de l’acétyl H3K18 et de l’acétyl H3K9 à l’acide anacardique de 100 micromolaire comparé au contrôle de DMSO.Dans l’essai d’inhibition d’inhibition d’hyper-acétylation de chromatine, traitement des cellules de MCF-7 avec HDACi MS275 acétylation fortement augmentée de l’histone 3 sur plusieurs résidus de lysine. Les niveaux basaux d’acétyl H3K18 et d’acétyl H3K27 étaient faibles, montrant les avantages d’ajouter un HDACi dans l’essai de ChHAI. L’ajout d’A-485 dans les cellules prétraitées avec MS275 atténue l’acétylation accrue d’histone à H3K18 et H3K27, mais pas H3K9.Les résultats immunoblots ont également été quantifiés avec ImageJ. ChIP qPCR a été utilisé pour étudier les effets des inhibiteurs de la HAT sur les éléments de régulation génétique qui contrôlent l’expression oncogène. Dans l’échantillon DMSO, l’ADN précipité par l’anticorps de contrôle IgG a produit une valeur ct plus élevée que l’anticorps acétyl H3K27 dans la réaction qPCR pour le promoteur de la cycline D1, ce qui indique que le contrôle IgG non spécifique a précipité moins de complexes d’histone d’ADN que l’anticorps spécifique de l’acétyle H3K27 au promoteur.Comparé au contrôle de DMSO, A-485 a réduit l’enrichissement d’acétyl H3K27 au promoteur de cyclin D1. Fait important, A-485 est connu pour réduire considérablement l’acétyl H3K27 dans la culture cellulaire. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que les étapes de pré-incubation des tests HAT et ChHAI in vitro sont essentielles et ne doivent pas être oubliées.Il est également important de se rappeler d’enregistrer les échantillons d’entrée et d’éviter la perte des perles pendant chip. Après avoir effectué ces procédures, ChIP-seq est une méthode supplémentaire qui peut être exécutée pour obtenir des informations globales sur l’acétylation de l’histone à des éléments réglementaires pour l’ensemble du génome. Ces protocoles sont utiles aux scientifiques pour valider soigneusement les nouveaux inhibiteurs de la HAT et éviter de publier des sondes chimiques de mauvaise qualité dans la littérature.Les inhibiteurs validés de la HAT peuvent subir d’autres développements en tant que thérapeutiques potentielles.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Assays pour étudier macrophage et microglie Stimulation de glioblastome Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Évaluation préclinique de la bioactivité de la OT48 de coumarine anticancéreux par sphéroïdes, colonie Formation essais et xénogreffes de poisson-zèbre

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Évaluation de la résistance aux inhibiteurs de Tyrosine Kinase par un interrogatoire des voies de Transduction de Signal par les alignements d’anticorps

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Épreuves d’imagerie de cellules vivantes pour étude glioblastome Brain Tumor Stem Cell Migration et Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Enquête de dépendances génétiques utilisant la concurrence fondée sur les Cas9-CRISPR

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Levure comme un châssis pour le développement des essais fonctionnels pour étudier l'homme P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caractérisation des effets des inhibiteurs migrastatiques sur l'invasion sphéroïde de tumeur 3D par microscopie confocale de haute résolution

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de l'imagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Évaluation de l’engagement des cibles cellulaires par inhibiteurs de la phosphatase SHP2 (PTPN11)

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification des inhibiteurs de l’EGFR et du SRA à l’aide de Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...