Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Stipendien von James und Esther King Biomedical Research Program (6JK03 und 20K07) und Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 und 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation und UF Health Cancer Center unterstützt. Darüber hinaus möchten wir uns bei Dr. Zachary Osking und Dr. Andrea Lin für die Unterstützung während des Publikationsprozesses bedanken.

1. In-vitro-HAT-Test
<ol><li>Puffervorbereitung HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Pufferrezepte.<ol>
<li>5x Assaypuffer und 6x Natriumdodecylsulfat (SDS) vorbereiten und bei -20 °C lagern. Aliquot SDS in 1 ml Aliquots.</li>
		<li>10x SDS-Gellaufpuffer und 10x TBST vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>1x Transferpuffer vorbereiten und bei 4 °C lagern. VORSICHT: Überprüfen Sie das Sicherheitsdatenblatt auf alle in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien. SDS, DTT...

Lysin-Acetyltransferasen (KATs) Acetylat mehrere Lysinrückstände an Histonschwänzen und Transkriptionsfaktoren zur Regulierung der Gentranskription2,3. Die Arbeit der letzten zwei Jahrzehnte hat gezeigt, dass KATs, wie CBP/p300, PCAF und GCN5, mit onkogenen Transkriptionsfaktoren interagieren und dazu beitragen, das Tumorwachstum in mehreren soliden Tumortypen4,5,9<su...

Lysin-Acetyltransferasen (KATs) katalysieren die Acetylierung von Lysinrückständen auf Histon- und Nicht-Histonproteinen1,2,3,4. Jüngste Forschung zeigt, dass KATs und ihre Acetyltransferase-Funktion solidesTumorwachstum4,5,6,7,8,9fördern kann. Zum Beispiel sind CREB-bindendes Protein (CBP)/p300 zwei paralogende KATs, die zahlreiche Signalwege bei Krebs regulieren2,3. CBP/p300 haben eine gut charakterisierte Histon-Acetyltransferase (HAT)-Funktion und katalysieren Histon 3 Lysin 27 Acetylierung (H3K27ac)2,4,5,10,11, ein wichtiger Marker für aktive Enhancer, Promotorregionen und aktive Gentranskription12,13,14. CBP/p300 dienen als kritische Co-Aktivatoren für wachstumsfördernde Signalwege bei soliden Tumoren durch Aktivierung der Transkription von Onkogenen durch Acetylierung von Histonen und anderen Transkriptionsfaktoren4,9,15,16,17,18. Aufgrund ihrer Rolle bei der Tumorprogression werden CBP/p300 und andere KATs für die Entwicklung neuartiger Inhibitoren untersucht, die ihre onkogene Funktion blockieren4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 und GNE-049 stellen zwei erfolgreiche Versuche dar, potente und spezifische Inhibitoren für CBP/p3004,9zu entwickeln. Weitere Inhibitoren werden derzeit für CBP/p300 und andere KATs untersucht.
Die Qualität der zuvor beschriebenen KAT-Hemmer (KATi) wird in Frage gestellt, wobei viele Inhibitoren Zielwirkungen und eine schlechte Charakterisierung zeigen21. Daher ist eine strenge Charakterisierung und Validierung neuartiger Wirkstoffkandidaten für die Entwicklung hochwertiger chemischer Sonden unerlässlich. Hier sind drei Protokolle beschrieben, die eine Pipeline zum Screening bilden und die Wirksamkeit und Spezifität neuartiger KATi streng validieren, mit einem besonderen Schwerpunkt auf der Hemmung der HAT-Funktion (HATi) von KATs. CBP/p300 und ihre Inhibitoren werden als Beispiele verwendet, aber diese Protokolle können für andere KATs angepasst werden, die eine HAT-Funktion haben7.
Das erste Protokoll ist ein In-vitro-Histon-Acetyltransferase (HAT)-Assay, der gereinigte rekombinante p300 und Histone in einer kontrollierten Reagenzröhrenreaktion verwendet. Dieser Test ist einfach durchzuführen, ist kostengünstig, kann verwendet werden, um Verbindungen in einer niedrigen Durchsatzeinstellung zu überprüfen, und erfordert keine radioaktiven Materialien. In diesem Protokoll werden rekombinante p300 Katalysen Lysin-Acetylierung an Histonschwänzen während einer kurzen Inkubationszeit und die Konzentrationen der Histonacetylierung mit Standard-Immunoblotting-Verfahren gemessen. Die enzymatische Reaktion kann in Gegenwart oder Abwesenheit von CBP/p300-Inhibitoren durchgeführt werden, um auf Verbindungen zu überprüfen, die die Histonacetylierung reduzieren. Darüber hinaus kann der HAT-Test verwendet werden, um zu überprüfen, ob neuartige Verbindungen selektiv für CBP/p300 sind, indem ihre Aktivität mit anderen gereinigten KATs, wie PCAF, bewertet wird. Der HAT-Test ist ein ausgezeichneter Ausgangspunkt für die Untersuchung neuartiger Inhibitoren aufgrund seiner Einfachheit, niedrigen Kosten und der Fähigkeit, die Wirksamkeit/Selektivität eines Inhibitors zu bestimmen. Tatsächlich wird dieses Protokoll in der Literatur oft als In-vitro-Bildschirmverwendet 5,10. Jedoch, Inhibitoren im HAT-Assay identifiziert sind nicht immer wirksam in der Zellkultur, weil eine Reagenzglasreaktion ist viel einfacher als ein lebendes Zellsystem. Daher ist es wichtig, Inhibitoren in Zellkulturexperimenten weiter zu charakterisieren22,23.
Das zweite Protokoll in der Pipeline ist der Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) Assay. Dieser zellbasierte Assay nutzt Histon-Deacetylase-Inhibitoren (HDACi) als Werkzeug, um Histonen in Chromatin vor der Co-Inkubation mit einem HATi24zu hyperacetylate Histone in Chromatin. Basal-Histon-Acetylierung kann in der Zellkultur niedrig sein, was es schwierig macht, über Immunoblotting zu sondieren, ohne dass ein HDACi hinzugefügt wird, um die Acetylierung zu erhöhen. Der Zweck des ChHAI-Assays ist es, neuartige HATi zu identifizieren, die die Zunahme der Histonacetylierung durch HDAC-Hemmung abschwächen können. Die Vorteile dieses Tests sind seine niedrigen Kosten, relative Leichtigkeit zu erfüllen, und die Verwendung von Zellen in der Kultur, die mehr physiologische Relevanz als das Reagenzglas HAT Assay bietet. Ähnlich wie der HAT-Test verwendet dieses Protokoll Standard-Immunoblotting für die Datenerfassung.
Die HAT- und ChHAI-Assays liefern Daten über die Wirksamkeit neuartiger Verbindungen zur Hemmung der globalen Histonacetylierung, geben aber keinen Einblick, wie diese Verbindungen Modifikationen in bestimmten genomischen Regionen beeinflussen. Daher ist das endgültige Protokoll, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR), ein Zellkulturexperiment, das DNA-Protein-Wechselwirkungen an bestimmten Regionen des Genoms untersucht. Im ChIP-Protokoll ist Chromatin vernetzt, um DNA-Protein-Wechselwirkungen zu erhalten. Das Chromatin wird dann aus Zellen extrahiert und der DNA-Protein-Komplex erhält eine selektive Immunpräzipitation für das Protein von Interesse (z.B. mit einem Antikörper speziell für H3K27ac). Die DNA wird dann gereinigt und mit qPCR analysiert. Beispielsweise kann ChIP-qPCR verwendet werden, um festzustellen, ob ein neuartiges HATi die Histonacetylierung bei einzelnen Onkogenen, wie Cyclin D125, herunterreguliert. Während ChIP-qPCR eine gängige Technik ist, die im Feld verwendet wird, kann es schwierig sein,4,10,26zu optimieren. Dieses Protokoll enthält Tipps zur Vermeidung potenzieller Fallstricke, die bei der Ausführung der ChIP-qPCR-Prozedur auftreten können, und enthält Qualitätskontrollen, die für die Daten durchgeführt werden sollten.
Zusammen ermöglichen diese drei Protokolle die strenge Charakterisierung und Validierung neuartiger HATi. Darüber hinaus bieten diese Methoden viele Vorteile, da sie einfach durchzuführen, relativ günstig sind und Daten über globale sowie regionale Histon-Acetylierung liefern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

Lysin-Acetyltransferasen (KATs) katalysieren die Acetylierung von Lysinrückständen auf Histonen und anderen Proteinen, um die Chromatindynamik und Genexpression zu regulieren. KATs, wie CBP/p300, werden aufgrund ihrer kritischen Rolle bei der Tumorgenese verschiedener Krebsarten intensiv als therapeutische Ziele untersucht. Die Entwicklung neuartiger kleiner Molekülinhibitoren, die auf die Histonacetyltransferase(HAT)-Funktion von KATs abzielen, ist anspruchsvoll und erfordert robuste Tests, die die Spezifität und Wirksamkeit potenzieller Inhibitoren validieren können.
Dieser Artikel skizziert eine Pipeline von drei Methoden, die eine strenge In-vitro-Validierung für neuartige HAT-Hemmer (HATi) bieten. Diese Methoden umfassen einen Testfürhorn HAT, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) Assay, und Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). Im HAT-Test werden rekombinante HATs mit Histonen in einer Reagenzreaktion inkubiert, was eine Acetylierung spezifischer Lysinrückstände an den Histonschwänzen ermöglicht. Diese Reaktion kann durch ein HATi blockiert werden und die relativen Niveaus der standortspezifischen Histonacetylierung können mittels Immunoblotting gemessen werden. Inhibitoren, die im HAT-Test identifiziert wurden, müssen in der zellulären Umgebung bestätigt werden.
Der ChHAI-Assay verwendet Immunoblotting, um neuartige HATi zu prüfen, die die robuste Hyperacetylierung von Histonen dämpfen, die durch einen Histon-Deacetylase-Inhibitor (HDACi) induziert wird. Die Zugabe eines HDACi ist hilfreich, da basalen Niveaus der Histon-Acetylierung kann schwierig sein, über Immunoblotting zu erkennen.
Die HAT- und ChHAI-Assays messen globale Veränderungen in der Histonacetylierung, liefern jedoch keine Informationen über die Acetylierung in bestimmten genomischen Regionen. Daher wird ChIP-qPCR verwendet, um die Auswirkungen von HATi auf Histon-Acetylierungsniveaus bei Gen-Regulierungselementen zu untersuchen. Dies wird durch selektive Immunpräzipitation von Histon-DNA-Komplexen und Analyse der gereinigten DNA durch qPCR erreicht. Zusammen ermöglichen diese drei Assays eine sorgfältige Validierung der Spezifität, Potenz und des Wirkmechanismus neuartiger HATi.

Der In-vitro-Histon-Acetyltransferase (HAT)-Assay kann verwendet werden, um nach Verbindungen zu suchen, die die p300 HAT-Aktivität in Richtung eines Histonsubstrats hemmen. Abbildung 1A enthält einen experimentellen Schaltplan für den HAT-Test. Anacardinsäure, eine bekannte HATi3,38, wurde in diesem Test in einem Konzentrationsbereich von 12,5-100 m verwendet. Bei 100 m reguliert Anacardinsäure p300 katalysierte Histon-Acetylie...

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Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Inhibitoren von Histonacetyltransferasen (HATs, auch bekannt als Lysin-Acetyltransferasen), wie CBP/p300, sind potenzielle Therapeutika zur Behandlung von Krebs. Es sind jedoch strenge Methoden zur Validierung dieser Inhibitoren erforderlich. Drei In-vitro-Methoden zur Validierung umfassen HAT-Assays mit rekombinanten Acetyltransferasen, Immunoblotting für Histonacetylierung in der Zellkultur und ChIP-qPCR.

Assays zur Validierung von Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Diese Protokolle sind wichtig, weil sie detaillierte Schritte zur Validierung der Wirksamkeit und Selektivität neuartiger HAT-Hemmer bieten, die wichtige Forschungsinstrumente und potenzielle Therapeutika sind. Die in diesem Video demonstrierten Techniken sind einfach durchzuführen und liefern Informationen über die Auswirkungen von HAT-Hemmern auf die globale und regionale Histonacetylierung. Sie ermöglichen es, die epigenetische Regulation der Genexpression zu verstehen.Die Liebe zum Detail ist entscheidend. Es ist wichtig, die Protokolle Schritt für Schritt zu befolgen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der enzymatischen Reaktion in einem 10-Mikroliter-Volumen in einem 0,2 Milliliter PCR-Rohr nach Manuskriptanweisungen.Dann inkubieren Sie das komplette Reaktionsgemisch bei 30 Grad Celsius für eine Stunde in einem PCR-Thermocycler. Fügen Sie in der Zwischenzeit zwei Mercaptoethanol im Verhältnis eins bis zehn zum 6X SDS-Probenpuffer hinzu. Entfernen Sie Proben aus dem PCR-Thermocycler und fügen Sie jedem Reaktionsmix zwei Mikroliter des vorbereiteten SDS-Probenpuffers hinzu.Die Proben auf 95 Grad Celsius auf einem Wärmeblock auf 95 Grad Celsius erhitzen und dann auf Eis abkühlen. Bewahren Sie die Proben bei minus 20 oder minus 80 Grad Celsius auf oder fahren Sie mit Gelelektrophorese und Immunoblotting fort. Samen 100, 000 MCF-7-Zellen in einem Milliliter Zellkulturmedium in jeden Brunnen einer 12-Well-Platte und lassen die Zellen bis zu 80 bis 90% Konfluenz wachsen.Wenn die Zellen die gewünschte Konfluenz erreichen, aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus den Brunnen vier, fünf und sechs und Pipette einen Milliliter von drei Mikromolaren MS275 in Medium in jedem Brunnen. Dann aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus den Brunnen eins, zwei und drei, und Pipette einen Milliliter verdünnten DMSO in jeden Brunnen. Geben Sie die Zellen für vier Stunden in den Inkubator zurück, um die Ansammlung von acetylierten Histonen in Zellen, die MS275 ausgesetzt sind, zu ermöglichen.Während die Zellen inkubieren, bereiten Verdünnungen von A-485 in DMSO nach Manuskriptrichtungen vor. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, das Medium aus den Brunnen aspirieren und die Verdünnungen hinzufügen. Bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück und kultiumieren Sie sie für 20 Stunden, dann saugen Sie das Zellkulturmedium aus den Brunnen und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter PBS.Aspirieren Sie die PBS und fügen Sie 100 Mikroliter passiveLyse Puffer. Lagern Sie die Platte bei minus 80 Grad Celsius über Nacht. Pipette 100 Mikroliter beschalltes Chromatin aus Zellen, die mit DMSO behandelt werden, in zwei 1,5-Milliliter-Röhren, dann Pipette 400 Mikroliter ChIP-Verdünnungspuffer in jedes Rohr, um das Gesamtvolumen auf 500 Mikroliter zu bringen.Entfernen Sie fünf Mikroliter der Lösung aus einem der Rohre und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius als DMSO-Eingang. Bereiten Sie zwei Röhren mit beschalltem Chromatin aus Zellen vor, die auf die gleiche Weise mit A-485 behandelt werden. Verwenden Sie eine Pipette, um die Acetyl-Antikörper IgG und H3K27 zu den DMSO- und A-485-Proben hinzuzufügen.Dann fügen Sie 20 Mikroliter Protein A magnetische Perlen zu jeder Röhre, um sicherzustellen, dass die Perlen gut resuspended sind. Drehen Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius. Pellet das Protein A magnetische Perlen mit einem magnetischen Separator und entfernen Sie den Überstand, ohne die Perlen zu stören.Die Perlen mit 500 Mikrolitern auf einen Milliliter Salzwaschpuffer waschen und fünf Minuten bei vier Grad Celsius drehen. Führen Sie einen schnellen Spin down durch, pellet die Perlen mit einem magnetischen Separator und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit hohem Salzwaschpuffer, Lithiumchlorid-Waschpuffer und TE-Puffer.Nach dem Waschen mit TE-Puffer die Eingangsproben aus dem Gefrierschrank entfernen und auf Eis legen. Einen Aliquot aus Proteinase K auftauen, dann die Perlen mit einem magnetischen Separator pellet und den TE-Puffer aus den Perlen entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter ChIP-Elutionspuffer und einen Mikroliter Proteinase K zu jeder Probe einschließlich der Eingangsproben hinzu und inkubieren Sie sie mit Schütteln bei 62 Grad Celsius für zwei Stunden mit einem Thermocycler.Nach der Inkubation die Proben 10 Minuten auf 95 Grad Celsius erhitzen und dann auf Raumtemperatur abkühlen. Pellet die magnetischen Perlen mit einem magnetischen Separator und übertragen Sie den DNA-haltigen Überstand auf eine neue 1,5 Milliliter Tube. Reinigen Sie die DNA mit einem Standard-PCR-Bereinigungskit und führen Sie qPCR aus.Der In-vitro-Histon-Acetyltransferase-Assay wurde verwendet, um die Wirkung von Anacardinsäure auf die p300 HAT-Aktivität auf ein Histonsubstrat zu untersuchen. Ein Konzentrationsbereich wurde getestet und Acetyl-CoA wurde der negativen Kontrollreaktion nicht hinzugefügt. Die Immunoblot-Ergebnisse wurden mit ImageJ quantifiziert, was eine deutliche Reduktion von Acetyl H3K18 und Acetyl H3K9 bei 100 Mikromolar-Anacardsäure im Vergleich zur DMSO-Kontrolle zeigte.Im Chromatin-Hyper-Acetylierungs-Inhibitionstest, Behandlung von MCF-7-Zellen mit HDACi MS275 stark upreguliertAcetylierung von Histon 3 auf mehreren Lysin-Rückständen. Die Basalwerte von Acetyl H3K18 und Acetyl H3K27 waren niedrig, was die Vorteile der Zugabe eines HDACi im ChHAI-Assay zeigt. Die Zugabe von A-485 in Zellen, die mit MS275 vorbehandelt werden, dämt die erhöhte Histonacetylierung bei H3K18 und H3K27 ab, nicht jedoch H3K9.Die Immunoblot-Ergebnisse wurden auch mit ImageJ quantifiziert. ChIP qPCR wurde verwendet, um die Auswirkungen von HAT-Hemmern auf Gen-Regulierungselemente zu untersuchen, die die Onkogenexpression steuern. In der DMSO-Probe ergab die durch den IgG-Kontrollantikörper gefällte DNA einen höheren Ct-Wert als der Acetyl-H3K27-Antikörper in der qPCR-Reaktion für den Cyclin-D1-Promotor, was darauf hindeutet, dass die unspezifische IgG-Kontrolle weniger DNA-Histonkomplexe auslöste als der Acetyl-H3K27-spezifische Antikörper am Promotor.Im Vergleich zur DMSO-Steuerung reduzierte A-485 die Acetyl-H3K27-Anreicherung am Cyclin-D1-Promotor. Wichtig ist, A-485 ist bekannt, acetyl H3K27 in der Zellkultur deutlich zu reduzieren. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass die Vorinkubationsschritte der In-vitro-HAT- und ChHAI-Assays unerlässlich sind und nicht vergessen werden sollten.Es ist auch wichtig, daran zu denken, die Eingabeproben zu speichern und den Verlust der Perlen während ChIP zu vermeiden. Nach der Durchführung dieser Verfahren ist ChIP-seq eine zusätzliche Methode, die ausgeführt werden kann, um globale Informationen über Histon-Acetylierung an regulatorischen Elementen für das gesamte Genom zu erhalten. Diese Protokolle sind hilfreich für Wissenschaftler, um neuartige HAT-Hemmer sorgfältig zu validieren und die Veröffentlichung minderwertiger chemischer Sonden in der Literatur zu vermeiden.Die validierten HAT-Inhibitoren können als potenzielle Therapeutika weiterentwickelt werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

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Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Forschung

Krebsforschung

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Präklinische Bewertung der Bioaktivität der Anti-Krebs Cumarin OT48 Sphäroide, Kolonie Bildung Assays und Zebrafisch Xenotransplantate

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen Tyrosin-Kinase-Inhibitoren durch eine Befragung von Signal Transduction Bahnen durch Antikörper-Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

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Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Charakterisierung der Auswirkungen von Migrastatischen Inhibitoren auf die 3D-Tumorsphäroid-Invasion durch hochauflösende Konfokalmikroskopie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

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Bewertung des zellulären Zielengagements durch SHP2 (PTPN11) Phosphatase-Inhibitoren

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

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Identifizierung von EGFR- und RAS-Inhibitoren mittels Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...