Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של ג'יימס ואסתר קינג תוכנית מחקר ביו רפואי (6JK03 ו 20K07), ו Bankhead-Coley סרטן תוכנית מחקר (4BF02 ו 6BC03), פלורידה מחלקת הבריאות, פלורידה סרטן השד הקרן, ו UF בריאות סרטן מרכז. בנוסף, ברצוננו להודות לד"ר זכריה אוסקינג וד"ר אנדריאה לין על תמיכתם במהלך תהליך הפרסום.

1. במבחנה כובע תסה
<ol><li>הכנת מאגר הערה: ראה טבלה 1 לקבלת מתכוני מאגר.<ol>
<li>הכן מאגר הבחנה של 5x ו-6 דודיום דודציל סולפט (SDS) ואחסן ב-20°C. אליקוט SDS ב 1 מ"ל aliquots.</li>
		<li>הכן מאגר ריצה של ג'ל SDS 10x ו-TBST של 10x ומאחסנים בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הכן מאגר העברה אחד ואחסן ב- 4 °C. התראה: בדוק את ג...

לייסין אצטילtransferases (KATs) אצטילאט כמה שאריות ליאזין על זנבות histone ותמלול גורמים לווסתשעתוק גנים 2,,3. עבודה בשני העשורים האחרונים חשפה כי KATs, כגון CBP/p300, PCAF ו GCN5, אינטראקציה עם גורמי שעתוק oncogenic ולעזור להניע גידולים במספר סוגיגידול מוצק 4,<sup class="...

לייסין אצטילtransferases (KATs) לדלל את האצטילציה של שאריות לייסין על חלבונים histone ולאהיסטון 1,,2,,3,,4. מחקרים אחרונים מגלים כי KATs ותפקוד אצטילטרנספראז שלהם יכול לקדם צמיחה גידול מוצק4,5,6,7,8,9. לדוגמה, חלבון מחייב CREB (CBP)/p300 הם שני KATs פרלוגים המסדירים מסלולי איתות רביםבסרטן 2,3. CBP/p300 יש פונקציה אצטילטרנספראז היסטון מאופיינת היטב (HAT) ללקט את Histone 3 ליסין 27 אצטילציה (H3K27ac)2,,4,,5,,10,,11, סמן חשוב עבור משפרי פעיל, אזורי קידום ותעתוקגנים פעיל 12,,13,,14. CBP/p300 לשמש כמפעילים שותף קריטי עבור נתיבי איתות פרו-צמיחה בגידולים מוצקים על ידי הפעלת שעתוק של אונקוגנים באמצעות אצטילציה של היסטון ותמלולגורמים אחרים 4,,9,,15,16,,17,18. בשל תפקידם בהתקדמות הגידול, CBP/p300 ו KATs אחרים נמצאים תחת חקירה לפיתוח מעכבי רומן החוסמים את הפונקציה האונקוגניתשלהם 4,,5,6,,7,8,,9,,18,,19,,20. A-485 ו GNE-049 מייצגים שני ניסיונות מוצלחים לפתח מעכבים חזקים וספציפיים עבור CBP/p3004,9. מעכבים נוספים נמצאים כעת תחת חקירה עבור CBP/p300 ו KATs אחרים.
האיכות של מעכבי KAT שתוארו קודם לכן (KATi) נקרא בשאלה, עם מעכבים רבים להשוויץ השפעות היעד ואפיון גרוע21. לכן, אפיון קפדני ואימות של מועמדים לסמים חדשניים חיוני לפיתוח של בדיקות כימיות באיכות גבוהה. להלן שלושה פרוטוקולים הנוהרים צינור לסינון ומאמתים בקפדנות את העוצמה והספנות של הרומן KATi, עם דגש ספציפי על עיכוב פונקציית HAT (HATi) של KATs. CBP/p300 והמעכבים שלהם משמשים כדוגמאות, אך פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים עבור KATs אחרים בעלי פונקציית HAT7.
הפרוטוקול הראשון הוא אצטילטרנספראז היסטון במבחנה (HAT) תסיסה המשתמשת p300 רקומביננטי מטוהרים והישטונים בתגובה מבוקרת צינור. תוואי זה הוא פשוט לביצוע, הוא חסכוני, ניתן להשתמש בו כדי לסנן תרכובות בהגדרת תפוקה נמוכה, ואינו דורש חומרים רדיואקטיביים. בפרוטוקול זה, p300 קתליציה רקומביננטי אצטילציה ליאזין על זנבות histone במהלך תקופת דגירה קצרה ואת רמות האצטילציה histone נמדדים באמצעות נהלי אימונובולוט סטנדרטיים. התגובה האנזימטית יכולה להתבצע בנוכחות או בהיעדר מעכבי CBP/p300 כדי לסנן עבור תרכובות להפחית אצטילציה histone. בנוסף, ניתן להשתמש ב-HAT כדי לוודא אם תרכובות חדשניות הן סלקטיביות עבור CBP/p300 על-ידי הערכת פעילותן מול KAT מטוהרים אחרים, כגון PCAF. Assay כובע הוא נקודת התחלה מצוינת לחקירת מעכבי רומן בשל הפשטות שלה, עלות נמוכה, ואת היכולת לקבוע את העוצמה / לקטיביות של מעכב. אכן, פרוטוקול זה משמש לעתים קרובות בספרות כמסכים במבחנה5,10. עם זאת, מעכבים שזוהו ב- HAT assay לא תמיד יעילים בתרבות התא כי תגובת מבחנה היא הרבה יותר פשוטה מאשר מערכת תא חי. לכן, זה חיוני כדי לאפיין מעכבים נוספים בניסויים תרבות התא22,23.
הפרוטוקול השני בצינור הוא עיכוב Hyperacetylation כרומטין (ChHAI) אסה. זה תא מבוסס assay מנצל מעכבי deacetylase histone (HDACi) ככלי היסטונים hyperacetylate בכרומטין לפני דגירה שיתופית עם HATi24. אצטילציה היסטון בסיס יכול להיות נמוך בתרבות התא, מה שהופך את זה קשה בדיקה באמצעות immunoblotting ללא תוספת של HDACi כדי להגדיל את האצטילציה. מטרת ההסדה ChHAI היא לזהות את הרומן HATi שיכול להקטין את העלייה באצטילציה היסטון הנגרמת על ידי עיכוב HDAC. היתרונות של אסיי זה כוללים את העלות הנמוכה שלה, קלות יחסית לבצע, ואת השימוש בתאים בתרבות, אשר מספק רלוונטיות פיזיולוגית יותר מאשר צינור הבדיקה HAT assay. בדומה ל- HAT assay, פרוטוקול זה משתמש ב- immunoblotting סטנדרטי לאיסוף נתונים.
ASSay HAT ו ChHAI לספק נתונים על העוצמה של תרכובות חדשניות לעיכוב אצטילציה histone העולמי, אבל אינם מספקים תובנה כיצד תרכובות אלה משפיעות על שינויים באזורים גנומיים ספציפיים. לכן, הפרוטוקול הסופי, כרומטין Immunoprecipitation-כמוות פולימראז תגובת שרשרת (ChIP-qPCR) הוא ניסוי תרבות התא החוקר אינטראקציות DNA-חלבון באזורים ספציפיים של הגנום. בפרוטוקול ChIP, כרומטין הוא crosslinked כדי לשמר אינטראקציות חלבון DNA. הכרומטין מופק לאחר מכן מתאי ותסביך חלבון ה-DNA עובר פירוק חיסוני סלקטיבי עבור חלבון של עניין (למשל, באמצעות נוגדן ספציפי עבור H3K27ac). לאחר מכן ה-DNA מטוהר וניתח באמצעות qPCR. לדוגמה, ChIP-qPCR יכול לשמש כדי לקבוע אם רומן HATi downregulates אצטילציה histone באונקוגנים בודדים, כגון Cyclin D125. בעוד ChIP-qPCR היא טכניקה נפוצה בשימוש בתחום, זה יכול להיות קשה לייעל4,10,26. פרוטוקול זה מספק עצות למניעת מלכודות פוטנציאליות שעלולות להתרחש בעת ביצוע הליך ChIP-qPCR וכולל בדיקות בקרת איכות שיש לבצע בנתונים.
כאשר נעשה שימוש יחד, שלושת הפרוטוקולים הללו מאפשרים אפיון קפדני ואימות של הרומן HATi. בנוסף, שיטות אלה מציעות יתרונות רבים כי הם קלים לביצוע, זול יחסית ולספק נתונים על אצטילציה histone גלובלית, כמו גם אזורית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

לייסין אצטילtransferases (KATs) אצטילציה זליזה של שאריות לינזין על היסטונים וחלבונים אחרים לווסת דינמיקה כרומטין וביטוי גנים. KATs, כגון CBP/p300, נמצאים תחת חקירה אינטנסיבית כיוקדים טיפוליים בשל תפקידם הקריטי בגידולים של סוגי סרטן מגוונים. הפיתוח של מעכבי מולקולה קטנה רומן מיקוד התפקוד אצטילטרנספראז histone (HAT) של KATs הוא מאתגר ודורש תסרוקות חזקות שיכולות לאמת את הספציפיות והעוצמה של מעכבים פוטנציאליים.
מאמר זה מתאר צינור של שלוש שיטות המספקות אימות קפדני במבחנה עבור מעכבי HAT חדשניים (HATi). שיטות אלה כוללות צינור הבדיקה כובע אסיי, כרומטין Hyperacetylation עיכוב (ChHAI) אסיא, ו PCR כמותי חיסוני כרומטין (ChIP-qPCR). ב-HAT ASSay, ה-HATs הרקומביננטיים מצופים בהסטונים בתגובה למבחנה, ומאפשרים אצטילציה של שאריות לינזין ספציפיות על זנבות האבן. תגובה זו יכולה להיות חסומה על ידי HATi ואת הרמות היחסיות של אצטילציה היסטון ספציפית לאתר ניתן למדוד באמצעות immunoblotting. מעכבים שזוהו ב-HAT Assay צריכים להיות מאושרים בסביבה הסלולרית.
אסיי ChHAI משתמש immunoblotting למסך עבור הרומן HATi כי להקטין את hyperacetylation חזק של היסטונים המושרה על ידי מעכב deacetylase histone (HDACi). התוספת של HDACi הוא מועיל כי רמות בסיס של אצטילציה histone יכול להיות קשה לזהות באמצעות immunoblotting.
ה-HAT ו-ChHAI מודדים שינויים גלובליים באצטילציה של היסטון, אך אינם מספקים מידע אודות אצטילציה באזורים גנומיים ספציפיים. לכן, ChIP-qPCR משמש כדי לחקור את ההשפעות של HATi על רמות אצטילציה histone באלמנטים רגולטוריים גנים. זה מושג באמצעות פירוק חיסוני סלקטיבי של תסביכות היסטון-DNA וניתוח של ה-DNA המטוהר באמצעות qPCR. יחד, שלוש האמורות הללו מאפשרות אימות זהיר של הספציפיות, העוצמה והמנגנון של הפעולה של הרומן HATi.

במבחנה היסטון אצטילטרנספראז (HAT) assay יכול לשמש כדי לבדוק עבור תרכובות לעכב את פעילות p300 HAT לכיוון היסטון. איור 1A מספק תרשים ניסיוני עבור תרשים HAT. חומצה אנאקרדית, HATiידוע 3,38, היה מנוצל בהסכם זה בטווח ריכוז של 12.5-100 μM. ב 100 μM, חומצה אנאקרדית downregulates ...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

מעכבי אצטילtransferases histone (HATs, המכונה גם ליסין אצטילטרנספראזים), כגון CBP/p300, הם טיפוליים פוטנציאליים לטיפול בסרטן. עם זאת, יש צורך בשיטות קפדניות לאימות מעכבים אלה. שלוש שיטות במבחנה לאימות כוללות ASSays HAT עם אצטילטרנספראזים רקומביננטי, immunoblotting עבור אצטילציה היסטון בתרבות התא, ו ChIP-qPCR.

תסרוקות לאימות מעכבי אצטילטרנספראז היסטון

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

פרוטוקולים אלה הם משמעותיים כי הם מספקים צעדים מפורטים לאימות העוצמה והבחירה של מעכבי HAT הרומן, שהם כלי מחקר חשובים וטיפולים פוטנציאליים. הטכניקות המודגמות בסרטון זה קלות לביצוע ומספקות מידע על ההשפעות של מעכבי HAT על אצטילציה היסטון גלובלית ואזורית. הם מאפשרים להבין ויסות אפיגנטי של ביטוי גנים.תשומת הלב לפרטים היא קריטית. חשוב לפעול בהתאם לפרוטוקולים צעד אחר צעד. התחל בהכנת התגובה האנזימטית בנפח של 10 מיקרוליטר בתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר בהתאם לכיווני כתב היד.ואז להחגירה את תערובת התגובה המלאה ב 30 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת במחזור תרמי PCR. בינתיים, להוסיף שני mercaptoethanol ביחס אחד עד 10 למאגר מדגם SDS 6X. הסר דגימות מהמחזור התרמי PCR והוסף שני מיקרוליטרים של מאגר מדגם SDS מוכן לכל תערובת תגובה.מחממים את הדגימות ל-95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות על גוש חום, ואז מקררים אותן על קרח. לאחסן את הדגימות במינוס 20 או מינוס 80 מעלות צלזיוס או להמשיך עם אלקטרופורזה ג'ל immunoblotting. זרעים 100, 000 MCF-7 תאים במיליליטר אחד של מדיום תרבות התא לתוך כל באר של צלחת 12 באר ולאפשר לתאים לגדול ל 80 עד 90%confluency.כאשר התאים מגיעים לקונפליה הרצויה, שאפו את מדיום תרבות התא מ בארות ארבע, חמש ושש, ופיפטה מיליליטר אחד של שלושה מיקרומולרים MS275 במדיום לתוך כל באר. לאחר מכן שאפו את מדיום תרבות התאים מ בארות 1, 2 ו-3, ו-pipette מיליליטר אחד של DMSO מדולל לתוך כל באר. להחזיר את התאים לאנקובטור במשך ארבע שעות כדי לאפשר הצטברות של היסטון אצטילאט בתאים חשופים MS275.בזמן שהתאים דגירה, להכין דילול של A-485 ב DMSO על פי הוראות כתב היד. כאשר הדגירה הסתיימה, שאפו את המדיום מה בארות ומוסיפים את הדילולים. מחזירים את התאים לאנקובטור ומתרבים אותם במשך 20 שעות, ואז שאפו את מדיום תרבות התאים מה בארות ושטפו את התאים במיליליטר אחד של PBS.שאפו את ה-PBS והוסיפו 100 מיקרוליטרים של מאגר ת ליסיס פסיבי. לאחסן את הצלחת במינוס 80 מעלות צלזיוס לילה. פיפטה 100 מיקרוליטרים של כרומטין קולי מתאים שטופלו ב- DMSO לשני צינורות 1.5 מיליליטר, ואז פיפטה 400 מיקרוליטרים של מאגר דילול ChIP לכל צינור כדי להביא את הנפח הכולל עד 500 מיקרוליטר.הסר חמישה מיקרוליטרים של הפתרון מאחד הצינורות ולאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס כקלט DMSO. הכינו שני צינורות עם כרומטין קולי מתאים שטופלו ב-A-485 באותו אופן. השתמש פיפטה כדי להוסיף את נוגדני אצטיל IgG ו H3K27 לדגימות DMSO ו- A-485.לאחר מכן מוסיפים 20 מיקרוליטרים של חלבון חרוזים מגנטיים לכל צינור, מוודאים כי חרוזים הם resuspended היטב. סובב את הדגימות בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. גלולה החלבון חרוזים מגנטיים באמצעות מפריד מגנטי ולהסיר את supernatant מבלי להפריע את חרוזים.לשטוף את חרוזים עם 500 microliters למיליליטר אחד של חיץ לשטוף מלח נמוך ולסובב אותם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. בצע ספין מהיר למטה, גלולה את חרוזים עם מפריד מגנטי ולהסיר את supernatant. חזור על הליך הכביסה עם מאגר שטיפת מלח גבוה, מאגר שטיפת ליתיום כלורי ומאגר TE.לאחר הכביסה עם מאגר TE, להסיר את דגימות הקלט מהמקפיא ולשים אותם על קרח. להפשיר aliquot של proteinase K, ולאחר מכן גלולה את חרוזים באמצעות מפריד מגנטי ולהסיר את מאגר TE מן חרוזים. הוסף 100 מיקרוליטרים של חיץ אלוטיון ChIP ומיקרוליטר אחד של proteinase K לכל מדגם כולל דגימות הקלט ודגירה אותם עם רועד ב 62 מעלות צלזיוס במשך שעתיים באמצעות תרמוצ'ילר.לאחר הדגירה, מחממים את הדגימות ל-95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ואז מקררים אותן לטמפרטורת החדר. גלולה את חרוזים מגנטיים עם מפריד מגנטי ולהעביר את על טבעי המכיל DNA לצינור חדש 1.5 מיליליטר. לטהר את ה-DNA באמצעות ערכת ניקוי PCR סטנדרטי ולהפעיל qPCR.ההיסטרו היסטון אצטילטרנספראז משמש כדי לחקור את ההשפעה של חומצה אנקרדית על פעילות p300 HAT כלפי מצע היסטון. טווח ריכוז נבדק ואצטיל-CoA לא נוספה לתגובת הבקרה השלילית. תוצאות immunoblot היו לכמת עם ImageJ, מראה ירידה ברורה אצטיל H3K18 ו אצטיל H3K9 ב 100 מיקרומולרית חומצה אנקרדית בהשוואה לבקרת DMSO.בדיכוי עיכוב אצטילציה-יתר כרומטין, טיפול בתאי MCF-7 עם HDACi MS275 אצטילציה מווסתת בחוזקה של היסטון 3 על מספר שאריות ליזין. רמות בסיס של אצטיל H3K18 ו אצטיל H3K27 היו נמוכים, מראה את היתרונות של הוספת HDACi בהצגת ChHAI. התוספת של A-485 בתאים שטופלו מראש עם MS275 מזרזת את האצטילציה המוגברת של אבן היסטון ב- H3K18 ו- H3K27, אך לא H3K9.תוצאות האימונובלות גם כומתו עם ImageJ. ChIP qPCR שימש כדי לחקור את ההשפעות של מעכבי HAT על אלמנטים רגולטוריים גנים השליטה ביטוי oncogene. בדגימה DMSO, ה-DNA זירז על ידי נוגדן בקרת IgG הפיק ערך Ct גבוה יותר מאשר נוגדן H3K27 אצטיל בתגובת qPCR עבור מקדם D1 ציקלין, המציין כי בקרת IgG לא ספציפי זירז פחות קומפלקסים histone DNA מאשר נוגדן H3K27 אצטיל ספציפי אצל האמרגן.בהשוואה לבקרת DMSO, A-485 הפחית את העשרת האצטיל H3K27 אצל מקדם D1 ציקלין. חשוב לציין, A-485 ידוע להפחית באופן משמעותי אצטיל H3K27 בתרבות התא. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי צעדי טרום הדגירה של המשגיחים במבחנה HAT ו ChHAI הם חיוניים ולא צריך לשכוח.חשוב גם לזכור לשמור את דגימות הקלט כדי למנוע אובדן של חרוזים במהלך ChIP. לאחר ביצוע הליכים אלה, ChIP-seq היא שיטה נוספת שניתן לבצע כדי לקבל מידע גלובלי על אצטילציה היסטון באלמנטים רגולטוריים עבור הגנום כולו. פרוטוקולים אלה מועילים למדענים לאמת בזהירות מעכבי HAT חדשניים ולהימנע מפרסום בדיקות כימיות באיכות נמוכה בספרות.מעכבי HAT מאומתים יכולים לעבור התפתחות נוספת כטיפולים פוטנציאליים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

הערכת פרה Bioactivity של OT48 נגד סרטן קומרין Spheroids, מבחני היווצרות המושבה ועל דג זברה Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

הערכה של התנגדות מעכבי טירוזין קינאז על ידי חקירה של האות התמרה חושית מסלולים על-ידי מערכים נוגדן

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי SHP2 (PTPN11) מעכבי פוספטאז

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות אלגנים של Caenorhabditis

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...