Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di James ed Esther King Biomedical Research Program (6JK03 e 20K07), e Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 e 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation e UF Health Cancer Center. Inoltre, vorremmo ringraziare il Dr. Osking e il Dr. Andrea Lin per il loro sostegno durante il processo di pubblicazione.

1. Analisi HAT in vitro
<ol><li>Preparazione del buffer NOTA: vedere la tabella 1 per le ricette del buffer.<ol>
<li>Preparare 5x buffer di analisi e 6x Sodio Dodecyl Sulfate (SDS) e conservare a -20 gradi centigradi. Aliquot SDS in aliquots da 1 mL.</li>
		<li>Preparare 10x SDS gel in esecuzione buffer e 10x TBST e memorizzare a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare il buffer di trasferimento 1x e conservarlo a 4 gradi centigradi. CAUTION: Controllare la scheda dati di sic...

L'acetiltransferasi di l'acetilsione (KAT) acetilate diversi residui di litina sulle code dell'istoneo e sui fattori di trascrizione per regolare la trascrizionegenica 2,3. Il lavoro degli ultimi due decenni ha rivelato che i KAT, come CBP/p300, PCAF e GCN5, interagiscono con i fattori di trascrizione oncogenici e aiutano a guidare la crescita del tumore in diversi tipi di tumore solido4,5,<sup...

L'acetiltransferasi di l'acetilsina (KAT) catalizzare l'acetilazione dei residui di lino sia sulle proteine istonesine che su proteine non istonese1,2,3,4. Recenti ricerche rivelano che i KAT e la loro funzione di acetiltransferase possono promuovere la crescita del tumoresolido 4,5,6,7,8,9. Ad esempio, la proteina legante CREB (CBP)/p300 sono due KA paralogo che regolano numerose vie di segnalazione nelcancro 2,3. CBP/p300 hanno una funzione acetiltransferasi istone ben caratterizzata (HAT) e catalizzare Histone 3 Lysine 27 acetilazione (H3K27ac)2,4,5,10,11, un marcatore importante per potenziatori attivi, regioni promotori e trascrizione genica attiva12,13,14. CBP/p300 servono come co-attivatori critici per le vie di segnalazione pro-crescita nei tumori solidi attivando la trascrizione degli oncogeni attraverso l'acetilazione degli istoni e altri fattori di trascrizione4,9,15,16,17,18. A causa del loro ruolo nella progressione del tumore, CBP/p300 e altri KAT sono sotto inchiesta per lo sviluppo di nuovi inibitori che bloccano la loro funzione oncogenica4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 e GNE-049 rappresentano due tentativi riusciti di sviluppare inibitori potenti e specifici per CBP/p3004,9. Ulteriori inibitori sono attualmente in fase di esame per CBP/p300 e altri KAT.
La qualità degli inibitori KAT precedentemente descritti (KATi) viene messa in discussione, con molti inibitori che mostrano effetti bersaglio e scarsa caratterizzazione21. Pertanto, una rigorosa caratterizzazione e convalida di nuovi farmaci candidati è essenziale per lo sviluppo di sonde chimiche di alta qualità. Qui delineati sono tre protocolli che formano una pipeline per lo screening e convalidano rigorosamente la potenza e la specificità del nuovo KATi, con un focus specifico sull'inibizione della funzione HAT (HATi) dei KAT. CBP/p300 e i loro inibitori sono utilizzati come esempi, ma questi protocolli possono essere adattati per altri KAT che hanno una funzione HAT7.
Il primo protocollo è un saggio di acetiltransferasi istone in vitro (HAT) che utilizza p300 ricombinante purificato e istoni in una reazione controllata in provetta. Questo saggio è semplice da eseguire, è conveniente, può essere utilizzato per lo screening dei composti in un ambiente a bassa produttività e non richiede materiali radioattivi. In questo protocollo, il ricombinante p300 catalizza l'acetilazione della lliina sulle code dell'istone durante un breve periodo di incubazione e i livelli di acetilazione dell'istone vengono misurati utilizzando procedure standard di immunoblotting. La reazione enzimatica può essere eseguita in presenza o assenza di inibitori CBP/p300 per lo screening di composti che riducono l'acetilazione istonea. Inoltre, l'analisi HAT può essere utilizzata per verificare se i nuovi composti sono selettivi per CBP/p300 valutando la loro attività rispetto ad altri KAT purificati, come PCAF. Il test HAT è un ottimo punto di partenza per studiare nuovi inibitori grazie alla sua semplicità, basso costo e alla capacità di determinare la potenza/selettività di un inibitore. Infatti, questo protocollo è spesso utilizzato nella letteratura come uno schermo in vitro5,10. Tuttavia, gli inibitori identificati nel saggio HAT non sono sempre efficaci nella coltura cellulare perché una reazione in provetta è molto più semplice di un sistema cellulare vivente. Pertanto, è essenziale caratterizzare ulteriormente gli inibitori negli esperimenti di colturacellulare 22,23.
Il secondo protocollo in cantiere è il saggio Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI). Questo saggio basato su cellule utilizza inibitori della deacetilase istone (HDACi) come strumento per iperacetizzare gli istoni in cromatina prima della co-incubazione con un HATi24. L'acetilazione dell'istone basale può essere bassa nella coltura cellulare, rendendo difficile la ricerca tramite immunoblotting senza l'aggiunta di un HDACi per aumentare l'acetilazione. Lo scopo del saggio ChHAI è quello di identificare nuovi HATi che possono attenuare l'aumento dell'acetilazione istonea causata dall'inibizione dell'HDAC. I vantaggi di questo saggio includono il suo basso costo, relativa facilità di esecuzione, e l'uso di cellule in coltura, che fornisce più rilevanza fisiologica rispetto al test tube HAT saggio. Simile al saggio HAT, questo protocollo utilizza l'immunoblotting standard per la raccolta dei dati.
I test HAT e ChHAI forniscono dati sulla potenza dei nuovi composti per inibire l'acetilazione degli itoni globali, ma non forniscono informazioni su come questi composti influenzano le modifiche in specifiche regioni genomiche. Pertanto, il protocollo finale, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) è un esperimento di coltura cellulare che studia le interazioni DNA-proteina in specifiche regioni del genoma. Nel protocollo ChIP, la cromatina è interconnessa per preservare le interazioni DNA-proteina. La cromatina viene quindi estratta dalle cellule e il complesso DNA-proteina subisce un'immunoprecipizione selettiva per la proteina di interesse (ad esempio, utilizzando un anticorpo specifico per H3K27ac). Il DNA viene quindi purificato e analizzato utilizzando qPCR. Ad esempio, ChIP-qPCR può essere utilizzato per determinare se un nuovo haTi downregulates histone acetylation at individual oncogenes, come Cyclin D125. Mentre ChIP-qPCR è una tecnica comune utilizzata nel campo, può essere difficile ottimizzare4,10,26. Questo protocollo fornisce suggerimenti per evitare potenziali insidie che possono verificarsi durante l'esecuzione della procedura ChIP-qPCR e include controlli di qualità che devono essere eseguiti sui dati.
Se utilizzati insieme, questi tre protocolli consentono la rigorosa caratterizzazione e convalida del nuovo HATi. Inoltre, questi metodi offrono molti vantaggi perché sono facili da eseguire, relativamente a buon mercato e forniscono dati sull'acetilazione istonea globale e regionale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

L'acetiltransferasi della lniina (KAT) catalizzare l'acetilazione dei residui di litina sugli istoni e su altre proteine per regolare la dinamica della cromatina e l'espressione genica. I T-A, come il CBP/p300, sono oggetto di un'intensa indagine in quanto obiettivi terapeutici a causa del loro ruolo critico nella tumorigenesi di diversi tipi di cancro. Lo sviluppo di nuovi inibitori di piccole molecole che prendono di mira la funzione dell'acetiltransferasi istone (HAT) dei KAT è impegnativo e richiede robusti saggi in grado di convalidare la specificità e la potenza dei potenziali inibitori.
Questo articolo descrive una pipeline di tre metodi che forniscono una rigorosa convalida in vitro per i nuovi inibitori HAT (HATi). Questi metodi includono un test tube di prova HAT, chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) saggio, e Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). Nel saggio HAT, i TEST ricombinanti vengono incubati con istoni in una reazione in provetta, consentendo l'acetilazione di specifici residui di litina sulle code istonese. Questa reazione può essere bloccata da un HATi e i livelli relativi di acetilazione istone specifica del sito possono essere misurati tramite immunoblotting. Gli inibitori identificati nel saggio HAT devono essere confermati nell'ambiente cellulare.
Il saggio ChHAI utilizza l'immunoblotting per lo screening per i nuovi HATi che attenuano la robusta iperacetilazione degli istoni indotti da un inibitore della deacetilase istonea (HDACi). L'aggiunta di un HDACi è utile perché i livelli basali di acetilazione istone può essere difficile da rilevare tramite immunoblotting.
I saggi HAT e ChHAI misurano i cambiamenti globali nell'acetilazione degli itoni, ma non forniscono informazioni sull'acetilazione in specifiche regioni genomiche. Pertanto, ChIP-qPCR viene utilizzato per studiare gli effetti di HATi sui livelli di acetilazione degli itoni a elementi regolatori genici. Ciò si ottiene attraverso l'immunoprecipizione selettiva dei complessi istone-DNA e l'analisi del DNA purificato attraverso il qPCR. Insieme, questi tre saggi permettono un'attenta convalida della specificità, della potenza e del meccanismo d'azione del nuovo HATi.

L'analisi dell'acetiltransferasi dell'istone in vitro (HAT) può essere utilizzata per sondare i composti che inibiscono l'attività p300 HAT verso un substrato istonetico. Figura 1A fornisce uno schema sperimentale per il test HAT. L'acido anacardico, un noto HATi3,38, è stato utilizzato in questo saggio in un intervallo di concentrazione da 12.5-100 . A 100 M, l'acido anacardico regola p300 catalizzato l'acetilazione istonetica a ...

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Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Gli inibitori dei l'acetiltransferasi dell'istone (HAT, noto anche come lisina acetiltransferasi), come CBP/p300, sono potenziali terapie per il trattamento del cancro. Tuttavia, sono necessari metodi rigorosi per convalidare questi inibitori. Tre metodi in vitro per la convalida includono i saggi HAT con acetiltransferasi ricombinanti, l'immunoblotting per l'acetilazione degli istoni nella coltura cellulare e ChIP-qPCR.

Analisi per la convalida degli inibitori dell'acetiltransferasi di Histone

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Questi protocolli sono significativi perché forniscono passaggi dettagliati per la convalida della potenza e della selettività dei nuovi inibitori hat, che sono importanti strumenti di ricerca e potenziali terapie. Le tecniche dimostrate in questo video sono facili da eseguire e forniscono informazioni sugli effetti degli inibitori hat sull'acetilazione istono globale e regionale. Rendono possibile comprendere la regolazione epigenetica dell'espressione genica.L'attenzione ai dettagli è fondamentale. È importante seguire i protocolli passo dopo passo. Inizia preparando la reazione enzimatica in un volume di 10 microlitri all'interno di un tubo PCR da 0,2 millilitri secondo le indicazioni manoscritte.Quindi incubare la miscela di reazione completa a 30 gradi Celsius per un'ora in un ciclore termico PCR. Nel frattempo, aggiungere due mercaptoetanolo con un rapporto uno a 10 al tampone campione 6X SDS. Rimuovere i campioni dal ciclore termico PCR e aggiungere due microlitri del tampone campione SDS preparato a ciascuna miscela di reazione.Scaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti su un blocco di calore, quindi raffreddarli sul ghiaccio. Conservare i campioni a meno 20 o meno 80 gradi Celsius o procedere con elettroforesi gel e immunoblotting. Semina 100.000 cellule MCF-7 in un millilitro di mezzo di coltura cellulare in ogni pozzo di una piastra da 12 pozzetto e consente alle cellule di crescere fino all'80-90% di confluenza.Quando le cellule raggiungono la confluenza desiderata, aspirare il mezzo di coltura cellulare da pozzi quattro, cinque e sei e pipettare un millilitro di tre micromolare MS275 in mezzo in ogni pozzo. Quindi aspirare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi uno, due e tre, e pipettare un millilitro di DMSO diluito in ogni pozzo. Riportare le cellule nell'incubatrice per quattro ore per consentire l'accumulo di istoni acetilati nelle cellule esposte all'MS275.Mentre le cellule stanno incubando, preparare diluizioni di A-485 in DMSO secondo le indicazioni manoscritte. Al termine dell'incubazione, aspirare il mezzo dai pozzi e aggiungere le diluizioni. Riportare le cellule nell'incubatrice e culturerle per 20 ore, quindi aspirare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi e lavare le cellule con un millilitro di PBS.Aspirare il PBS e aggiungere 100 microlitri di tampone dilisi passiva. Conservare la piastra a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Pipetta 100 microlitri di cromatina sonicata da celle trattate con DMSO in due tubi da 1,5 millilitri, quindi pipettare 400 microlitri di tampone di diluizione ChIP in ogni tubo per portare il volume totale fino a 500 microlitri.Rimuovere cinque microlitri della soluzione da uno dei tubi e conservarla a meno 20 gradi Celsius come ingresso DMSO. Preparare due tubi con cromatina sonicata da cellule trattate con A-485 allo stesso modo. Utilizzare una pipetta per aggiungere gli anticorpi acetil IgG e H3K27 ai campioni DMSO e A-485.Quindi aggiungere 20 microlitri di proteine A perline magnetiche ad ogni tubo, assicurandosi che le perline siano ben rimorsi. Ruotare i campioni durante la notte a quattro gradi Celsius. Pellettare la proteina A perline magnetiche utilizzando un separatore magnetico e rimuovere il supernatante senza disturbare le perline.Lavare le perline con 500 microlitri in un millilitro di tampone di lavaggio a basso contenuto di sale e ruotarle per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Eseguire uno spin down rapido, pelletare le perline con un separatore magnetico e rimuovere il supernatante. Ripetere la procedura di lavaggio con tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale, tampone di lavaggio al cloruro di litio e tampone TE.Dopo il lavaggio con tampone TE, rimuovere i campioni di ingresso dal congelatore e metterli sul ghiaccio. Scongelare un'aliquota di proteinasi K, quindi pelletare le perline utilizzando un separatore magnetico e rimuovere il tampone TE dalle perline. Aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione ChIP e un microlitro di proteinasi K a ogni campione, compresi i campioni di input, e incubarli con tremori a 62 gradi Celsius per due ore utilizzando un termociclo.Dopo l'incubazione, riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti, quindi raffreddarli a temperatura ambiente. Pellet le perline magnetiche con un separatore magnetico e trasferire il supernatante contenente DNA in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Purificare il DNA utilizzando un kit di pulizia PCR standard ed eseguire qPCR.Il saggio istonico in vitro acetiltransferasi è stato utilizzato per studiare l'effetto dell'acido anacardico sull'attività del HAT p300 verso un substrato istonico. È stato testato un intervallo di concentrazione e l'acetil-CoA non è stato aggiunto alla reazione di controllo negativo. I risultati dell'immunoblot sono stati quantificati con ImageJ, mostrando una chiara riduzione dell'acetil H3K18 e dell'acetil H3K9 a 100 acido anacardico micromolare rispetto al controllo DMSO.Nel saggio di inibizione dell'iper-acetilazione della cromatina, trattamento delle cellule MCF-7 con HDACi MS275 acetilazione fortemente upregolata dell'istone 3 su diversi residui di lisina. I livelli basali di acetil H3K18 e acetil H3K27 erano bassi, mostrando i vantaggi dell'aggiunta di un HDACi nel saggio ChHAI. L'aggiunta di A-485 in cellule pretrattate con MS275 attenua l'aumento dell'acetilazione istono a H3K18 e H3K27, ma non H3K9.I risultati dell'immunoblot sono stati quantificati anche con ImageJ. ChIP qPCR è stato utilizzato per indagare gli effetti degli inibitori hat sugli elementi regolatori genici che controllano l'espressione oncogene. Nel campione DMSO, il DNA precipitato dall'anticorpo di controllo IgG ha prodotto un valore Ct superiore rispetto all'anticorpo acetil H3K27 nella reazione qPCR per il promotore cyclin D1, indicando che il controllo IgG non specifico ha precipitato meno complessi istonali di DNA rispetto all'anticorpo specifico acetil H3K27 al promotore.Rispetto al controllo DMSO, L'A-485 ha ridotto l'arricchimento dell'acetil H3K27 presso il promotore cyclin D1. È importante sottolineare che L'A-485 è noto per ridurre significativamente l'acetil H3K27 nella coltura cellulare. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che le fasi di pre-incubazione dei saggi HAT e ChHAI in vitro sono essenziali e non devono essere dimenticate.È anche importante ricordare di salvare i campioni di input ed evitare la perdita delle perline durante il ChIP. Dopo aver eseguito queste procedure, ChIP-seq è un metodo aggiuntivo che può essere eseguito per ottenere informazioni globali sull'acetilazione dell'istono agli elementi normativi per l'intero genoma. Questi protocolli sono utili per gli scienziati per convalidare attentamente nuovi inibitori hat e per evitare di pubblicare sonde chimiche di bassa qualità in letteratura.Gli inibitori del HAT convalidati possono subire un ulteriore sviluppo come potenziali terapie.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Valutazione preclinica della bioattività dell'OT48 di cumarina anticancro di sferoidi, Colony Assays formazione e xenotrapianti di Zebrafish

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Valutazione della resistenza agli inibitori della tirosina chinasi di un interrogatorio di trasduzione del segnale da matrici di anticorpo

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Analisi Live Cell Imaging Studio Glioblastoma cerebrale tumore cellule staminali migrazione e invasione

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Indagine delle dipendenze genetiche utilizzando dosaggi di concorrenza basati su CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Il lievito come telaio per lo sviluppo di saggi funzionali per studiare l'Uomo P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caratterizzazione degli effetti degli inibitori espastatici sull'invasione 3D dello spheroid del tumore mediante microscopia confocale ad alta risoluzione

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Valutazione dell'impegno del bersaglio cellulare da parte degli inibitori della fosfatasi SHP2 (PTPN11)

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identificazione di inibitori EGFR e RAS utilizzando Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...