Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

이 작품은 제임스와 에스더 킹 생물 의학 연구 프로그램 (6JK03 및 20K07)과 Bankhead-Coley 암 연구 프로그램 (4BF02 및 6BC03), 플로리다 보건부, 플로리다 유방암 재단 및 UF 건강 암 센터의 보조금에 의해 지원되었습니다. 또한, 우리는 출판 과정에서 그들의 지원에 대한 박사 Zachary Osking과 안드레아 린 박사에게 감사드립니다.

1. 체외 HAT 분석
<ol><li>버퍼 준비 참고: 버퍼 레시피의 표 1을 참조하십시오.<ol>
<li>5배 분석 버퍼와 6배 의 도데킬 설페이트 나트륨(SDS)을 준비하고 -20°C에 보관하십시오. 알리쿼트 SDS 에서 1 mL 알리쿼트.</li>
		<li>10x SDS 젤 러닝 버퍼와 10배 TBST를 준비하고 실온에서 보관하십시오.</li>
		<li>1x 이송 버퍼를 준비하고 4°C에 보관하십시오. 주의: 이 프로토콜에 사용되는 모?...

리신 아세틸트랜스퍼라제(KATs)는 유전자전사를조절하기 위한 히스톤 꼬리 및 전사 인자에 대한 여러 리신 잔류물을 아세틸레이트2,3. 지난 2년간의 연구에 따르면 CBP/p300, PCAF 및 GCN5와 같은 KAT는 종양 발생 성 전사 인자와 상호 작용하고 여러 고형 종양 유형4,,5,9,9,<sup class="xre...

리신 아세틸트랜스퍼라제(KATs)는 히스톤과 비히스톤 단백질11,2,,3,,4모두에서 리신 잔류물의 아세틸화를 촉매한다. 최근 연구에 따르면 KAT와 그들의 아세틸트랜스퍼라아제 기능은 고형 종양성장을촉진할 수 있음을4,5,,6,,7,,8,,9. 예를 들어, CREB 결합 단백질(CBP)/p300은 암2,,3에서수많은 신호 경로를 조절하는 두 개의 파라로고우스 KAT이다. CBP/p300은 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 기능을 잘 특성화하고 히스톤 3 리신 27아세틸레이션(H3K27ac)22,4,,5,,10,,11,활성 강화, 프로모터 영역 및 활성 유전자전사12,13, 14을위한 중요한마커를14갖는다., CBP/p300은 히스톤 및 기타 전사인자의아세틸화를 통해 종양유전자의 전사를 활성화하여 고형 종양에서 의 프로 성장 신호 전달 경로를 위한 중요한 공동 활성화제로서4,9,15,,16,,,17,,18. 종양 진행에 그들의 역할 때문에, CBP/p300 및 그밖 KATs는 그들의 종양원성기능을막는 새로운 억제제의 발달을 위해 조사되고4,5,,6,7,77,8,,9,,18,,19,,20. A-485 및 GNE-049는 CBP/p3004,,9에대한 강력하고 특정 억제제개발을 성공적으로 시도한 두 가지 성공적인 시도를 나타낸다. 추가 억제제는 CBP/p300 및 그밖 KATs에 대한 현재 조사되고 있습니다.
이전에 설명된 KAT 억제제(KATi)의 품질은 많은 억제제가 표적 효과와 불량한특성화를과시하는 것으로, 의문을 제기하고 있다. 따라서, 새로운 약물 후보의 엄격한 특성화 및 검증은 고품질화학 프로브의 개발에 필수적이다. 여기에 설명된 세 가지 프로토콜은 KAT의 HAT 기능(HATi)을 억제하는 데 중점을 두고 새로운 KATi의 효능과 특이성을 선별하고 엄격하게 검증하기 위한 파이프라인을 형성하는 세 가지 프로토콜입니다. CBP/p300 및 그 억제제는 예로 사용되지만, 이러한 프로토콜은 HAT 함수7을갖는 다른 KAT에 맞게 조정할 수 있다.
첫 번째 프로토콜은 제어 된 시험관 반응에서 정제 된 재조합 p300 및 히스톤을 사용하는 시험관 히트톤 아세틸 트랜스퍼라제 (HAT) 분석입니다. 이 분석법은 수행하기 가 간단하고, 비용 효율적이며, 낮은 처리량 설정에서 화합물을 선별하는 데 사용할 수 있으며 방사성 물질을 필요로하지 않습니다. 이 프로토콜에서, 재조합 p300 촉매는 짧은 잠복기 동안 히스톤 꼬리에 리세틸리제이션과 히스톤 아세틸화의 수준은 표준 면역 blotting 절차를 사용하여 측정된다. 효소 반응은 CBP/p300 억제제의 존재 또는 부재에서 수행될 수 있다. 또한, HAT 분석체는 PCAF와 같은 다른 정제 된 KAT에 대한 활동을 평가하여 새로운 화합물이 CBP / p300에 대한 선택적지 여부를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. HAT 분석은 단순성, 저렴한 비용 및 억제제의 효능/선택성을 결정하는 능력으로 인해 새로운 억제제를 조사하기위한 훌륭한 출발점입니다. 실제로,이 프로토콜은 종종 시험관 내 화면5,,10으로문학에 사용된다 . 그러나, HAT 분석에서 확인된 억제제는 시험관 반응이 살아있는 세포 시스템보다는 훨씬 간단하기 때문에 세포 배양에서 항상 효과적이지는 않다. 따라서, 세포 배양실험(22,,23)에서억제제의 특징을 더 특성화하는 것이 필수적이다.
파이프라인의 두 번째 프로토콜은 크로마틴 고과성 억제(ChHAI) 분석이다. 이 세포 기반 분석은 히스톤 deacetylase 억제제 (HDACi)를 HATi24와공동 인큐베이션하기 전에 크로마틴에서 히스톤을 과대 광고하는 도구로 활용합니다. 기저 히스톤 아세틸화는 세포 배양에서 낮을 수 있으므로, 탈염을 증가시키기 위해 HDACi를 첨가하지 않고 면역 블로팅을 통해 프로브하기가 어렵다. ChHAI 분석의 목적은 HDAC 억제에 의한 히스톤 아세틸화의 증가를 감쇠시킬 수 있는 새로운 HATi를 식별하는 것입니다. 이 분석법의 장점은 낮은 비용, 수행 할 상대적 용이성 및 배양세포의 사용을 포함하며, 이는 시험관 HAT 분석보다 더 많은 생리적 관련성을 제공합니다. HAT 분석과 마찬가지로 이 프로토콜은 데이터 수집에 표준 면역 블로팅을 사용합니다.
HAT 및 ChHAI 분석서는 글로벌 히스톤 아세틸화를 억제하기 위한 새로운 화합물의 효능에 대한 데이터를 제공하지만, 이러한 화합물이 특정 게놈 영역의 수정에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공하지 는 않습니다. 따라서, 최종 프로토콜, 크로마틴 면역 침전-정량적 폴리머라제 연쇄 반응(ChIP-qPCR)은 게놈의 특정 영역에서 DNA 단백질 상호작용을 조사하는 세포 배양 실험이다. ChIP 프로토콜에서, 크로마틴은 DNA 단백질 상호 작용을 보존하기 위하여 교차 연결됩니다. 크로마틴은 세포로부터 추출된 다음 DNA 단백질 복합체가 관심 있는 단백질에 대한 선택적 면역 침전을 겪는다(예를 들어, H3K27ac에 특이적인 항체를 사용하여). DNA는 qPCR을 사용하여 정제되고 분석됩니다. 예를 들어, ChIP-qPCR은 새로운 HATi가 Cyclin D125와같은 개별 종양 유전자에서 히스톤 아세틸레이션을 저하시키는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있다. ChIP-qPCR은 현장에서 사용되는 일반적인 기술이지만4,,10,,26을최적화하기 어려울 수 있다. 이 프로토콜은 ChIP-qPCR 절차를 수행하는 동안 발생할 수 있는 잠재적인 함정을 방지하는 팁을 제공하며 데이터에서 수행해야 하는 품질 관리 검사를 포함합니다.
이 세 가지 프로토콜을 함께 사용하면 새로운 HATi의 엄격한 특성과 검증이 가능합니다. 또한 이러한 방법은 수행하기 쉽고 상대적으로 저렴하며 지역 히스톤 아세틸레이션뿐만 아니라 글로벌에 대한 데이터를 제공하기 때문에 많은 이점을 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

리신 아세틸 트랜스퍼라제 (KATs)는 크로마티닌 역학 및 유전자 발현을 조절하기 위해 히스톤 및 기타 단백질에 대한 리신 잔류물의 촉매 아세틸화. CBP/p300과 같은 KAT는 다양한 암의 종양 발생에 중요한 역할때문에 치료 대상으로 강도 높은 조사를 받고 있습니다. KATs의 히스톤 아세틸 트랜스퍼라아제(HAT) 기능을 대상으로 하는 새로운 소분자 억제제의 개발은 도전적이며 잠재적 억제제의 특이성과 효능을 검증할 수 있는 강력한 작용이 필요합니다.
이 문서에서는 새로운 HAT 억제제(HATi)에 대한 엄격한 체외 검증을 제공하는 세 가지 방법의 파이프라인을 간략하게 설명합니다. 이러한 방법에는 시험관 HAT 분석, 크로마티닌 고과실화 억제(ChHAI) 분석, 크로마티닌 면역 침전-정량성 PCR(ChIP-qPCR)이 포함된다. HAT 분석에서 재조합 HAT는 시험관 반응에서 히스톤으로 배양되어 히스톤 꼬리에 특정 리신 잔류물을 아세틸화할 수 있습니다. 이러한 반응은 HATi에 의해 차단될 수 있으며, 현장별 히스톤 아세틸화의 상대적 수준은 면역블로팅을 통해 측정될 수 있다. HAT 분석에서 확인된 억제제는 세포 환경에서 확인되어야 합니다.
ChHAI 분석체는 히스톤 디스틸라제 억제제(HDACi)에 의해 유도된 히스톤의 견고한 hyperacetylation을 감쇠하는 새로운 HATi를 위해 면역 블로팅을 사용합니다. HDACi의 추가는 히스톤 아세틸화의 기저 수준이 면역 블로팅을 통해 검출하기 어려울 수 있기 때문에 도움이 됩니다.
HAT 및 ChHAI 아세서는 히스톤 아세틸화의 글로벌 변화를 측정하지만 특정 게놈 지역에서 아세틸화에 관한 정보를 제공하지는 않습니다. 따라서 ChIP-qPCR은 유전자 조절 원소에서 히스톤 아세틸화 수준에 대한 HATi의 효과를 조사하는 데 사용됩니다. 이는 그의 톤-DNA 복합체의 선택적 면역 침전및 qPCR을 통해 정제된 DNA의 분석을 통해 달성된다. 이 세 가지 에세이는 함께 새로운 HATi의 특이성, 효능 및 작용 메커니즘에 대한 신중한 검증을 가능하게 합니다.

시험관 내 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 분석은 히스톤 기판을 향해 p300 HAT 활성을 억제하는 화합물을 탐사하는 데 사용될 수 있다. 도 1A는 HAT 분석에 대한 실험 적인 회로도를 제공합니다. 알려진 HATi3,38인아나카르산은 12.5-100 μM의 농도 범위에서 이 분석에서 활용되었다.3 100 μM에서 아나카르산 다운조절은 히스톤 3, 리신 9, 18?...

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Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

CBP/p300과 같은 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제(HATs, 리신 아세틸 트랜스퍼라아제라고도 함)의 억제제는 암 치료에 대한 잠재적 치료법이다. 그러나 이러한 억제제의 유효성을 검사하기 위한 엄격한 방법이 필요합니다. 검증을 위한 3개의 시험관내 방법은 재조합 아세틸 전달을 가진 HAT 분석, 세포 배양에 있는 히스톤 아세틸화를 위한 면역blotting 및 ChIP-qPCR를 포함합니다.

히스톤 아세틸트랜스퍼효소 억제제 검증을 위한 아세서

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

이러한 프로토콜은 중요한 연구 도구 및 잠재적 치료법인 새로운 HAT 억제제의 효능 및 선택성을 검증하기 위한 상세한 단계를 제공하기 때문에 중요합니다. 이 비디오에서 입증 된 기술은 수행하기 쉽고 글로벌 및 지역 히스톤 아세틸화에 HAT 억제제의 효과에 대한 정보를 제공하기 쉽습니다. 그(것)들은 유전자 발현의 후성유전학 적인 규정을 이해하는 가능하게 합니다.세부 사항에 대한 주의가 중요합니다. 프로토콜을 단계별로 따르는 것이 중요합니다. 원고 방향에 따라 0.2 밀리리터 PCR 튜브 내부의 10 마이크로리터 부피에서 효소 반응을 준비하는 것으로 시작합니다.그런 다음 PCR 열 사이클러에서 1 시간 동안 섭씨 30도에서 전체 반응 혼합물을 배양합니다. 한편, 6X SDS 샘플 버퍼에 1 대 10 비율로 두 개의 mercaptoethanol을 추가합니다. PCR 열 사이클러에서 샘플을 제거하고 각 반응 믹스에 준비된 SDS 샘플 버퍼의 2개의 마이크로리터를 추가합니다.시료를 열블록에서 5분간 섭씨 95도로 가열한 다음 얼음 위에서 식힙니다. 샘플을 영하 20도 또는 영하 80도에 저장하거나 겔 전기 전광 및 면역 blotting진행합니다. 종자 100, 000 MCF-7 세포는 세포 배양 배지의 1 밀리리터로 12웰 플레이트의 각 웰로 세포가 80 ~ 90%의 합류로 자랄 수 있도록 한다.세포가 원하는 합류성에 도달하면, 3개의 마이크로몰러 MS275의 3개의 마이크로몰라 MS275의 4, 5 및 6, 및 파이펫 1 밀리리터에서 각각의 우물로 세포 배양 배지를 흡인한다. 그런 다음 세포 배양 배지를 1, 2, 3에서 흡인시키고 희석된 DMSO의 1밀리리터를 각각 양으로 배양한다. MS275에 노출된 세포에서 아세틸화 히스톤의 축적을 허용하기 위해 세포를 4시간 동안 인큐베이터로 되돌립니다.세포가 배양하는 동안 원고 방향에 따라 DMSO에서 A-485의 희석을 준비하십시오. 인큐베이션이 완료되면 우물에서 배지를 흡인하고 희석기를 추가합니다. 세포를 인큐베이터로 돌려보내 20시간 동안 배양한 다음 우물에서 세포 배양 배지를 흡인한 다음 PBS의 1밀리리터로 세포를 세척합니다.PBS를 흡인하고 수동 리시스 버퍼 100 마이크로리터를 추가합니다. 하룻밤 동안 영하 80도에 접시를 보관하십시오. DMSO로 처리된 세포로부터 초음파 염색제 100마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브로 처리한 다음 각 튜브에 ChIP 희석 버퍼의 파이펫 400 마이크로리터를 각 튜브에 최대 500 마이크로리터까지 가져온다.튜브 중 하나에서 용액 5 마이크로리터를 제거하고 DMSO 입력으로 섭씨 영하 20도에 저장합니다. 같은 방법으로 A-485로 처리 된 세포에서 초음파 염색질로 두 개의 튜브를 준비합니다. 파이펫을 사용하여 DMSO 및 A-485 샘플에 IgG 및 H3K27 아세틸 항체를 추가합니다.그런 다음 각 튜브에 20 마이크로 리터의 단백질 A 자기 구슬을 추가하여 구슬이 잘 재중단되었는지 확인합니다. 하룻밤 사이에 샘플을 섭씨 4도에서 회전합니다. 단백질 자극제 마그네틱 구슬을 사용하여 자기 분리기와 구슬을 방해하지 않고 상퍼를 제거합니다.500 마이크로리터로 구슬을 저염 세척 버퍼 1밀리리터로 씻고 섭씨 4도에서 5분간 회전합니다. 빠른 스핀 다운을 수행하고, 자석 분리기와 구슬을 펠릿과 상체를 제거합니다. 높은 소금 세척 버퍼, 염화물 세척 버퍼 및 TE 버퍼로 세척 절차를 반복하십시오.TE 버퍼로 세척한 후 냉동고에서 입력 샘플을 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 단백질 제 K의 알리쿼트를 해동한 다음, 마그네틱 분리기로 구슬을 펠릿하고 구슬에서 TE 버퍼를 제거합니다. ChIP 용출 버퍼 100 마이크로리터와 1개의 단백질Ae K 마이크로리터를 입력 샘플을 포함한 모든 샘플에 추가하고 열순환기를 사용하여 2시간 동안 섭씨 62도에서 흔들림으로 배양합니다.인큐베이션 후 샘플을 섭씨 95도로 10분 간 가열한 다음 실온으로 식힙니다. 자기 분리기로 자기 구슬을 펠렛하고 DNA함유 상체를 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기다. 표준 PCR 정리 키트를 사용하여 DNA를 정화하고 qPCR을 실행합니다.시험관 내 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 분석체는 기판을 향한 p300 HAT 활성에 대한 아나카르산의 효과를 조사하는 데 사용되었다. 농도 범위를 테스트하였고 아세틸-코아는 음의 대조반응에 첨가되지 않았다. 면역블롯 결과는 ImageJ로 정량화되었으며, DMSO 대조군과 비교하여 100 마이크로몰라 아나카르산에서 아세틸 H3K18 및 아세틸 H3K9의 명확한 감소를 나타냈다.크로마틴 하이퍼 아세틸화 억제 분석에서 HDACi MS275를 가진 MCF-7 세포의 치료는 여러 리신 잔류물에서 히스톤 3의 아세틸화를 강력하게 강화하였다. 아세틸 H3K18과 아세틸 H3K27의 기저 수준은 낮았으며 ChHAI 분석에서 HDACi를 추가하는 이점을 보여 주면서 나타났습니다. MS275로 전처리된 세포에 A-485를 첨가하면 H3K18 및 H3K27에서 히스톤 아세틸레이션이 증가했지만 H3K9는 그렇지 않다.면역블롯 결과도 ImageJ로 정량화되었다. ChIP qPCR은 종양 유전자 발현을 제어하는 유전자 조절 원소에서 HAT 억제제의 효과를 조사하는 데 사용되었습니다. DMSO 샘플에서, IgG 대조군 항체에 의해 침전된 DNA는 사이클린 D1 프로모터에 대한 qPCR 반응에서 아세틸 H3K27 항체보다 더 높은 Ct 값을 생성하여, 비특이적 IgG 대조군이 아세틸 H3K27 특이적 항체보다 적은 DNA 히스톤 복합체를 침전시켰다는 것을 나타낸다.DMSO 대조군과 비교하여, A-485는 사이클린 D1 프로모터에서 아세틸 H3K27 농축을 감소시켰습니다. 중요한 것은, A-485는 세포 배양에서 아세틸 H3K27을 현저히 감소시키는 것으로 알려져 있다. 이 프로토콜을 시도할 때, 시험관 내 HAT 및 ChHAI 분석의 사전 인큐베이션 단계는 필수적이며 잊혀서는 안된다는 것을 명심하십시오.또한 입력 샘플을 저장하고 ChIP 중에 구슬이 손실되는 것을 방지하는 것도 중요합니다. 이러한 절차를 수행한 후 ChIP-seq는 전체 게놈에 대한 조절 원소에서 히스톤 아세틸화에 대한 글로벌 정보를 얻기 위해 실행할 수 있는 추가 방법입니다. 이러한 프로토콜은 과학자들이 새로운 HAT 억제제의 유효성을 신중하게 검증하고 문헌에 저품질 화학 프로브를 게시하지 않도록 하는 데 유용합니다.검증된 HAT 억제제는 잠재적인 치료제로서 추가 개발을 거칠 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

연구

암 연구학

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Spheroids, 식민지 대형 분석 실험, 그리고 Zebrafish Xenografts 제 Coumarin OT48의 Bioactivity의 전 임상 평가

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

항 체 배열에 의해 신호 변환 통로의 심문에 의해 Tyrosine Kinase 억제제에 평가

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

CRISPR-Cas9-기반 경쟁 분석 실험을 사용 하 여 유전 종속성의 조사

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

인간 P53을 연구하기 위한 기능성 어세이 개발을 위한 섀시로 효모

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3D 종양 스페로이드 침습에 대한 Migrastatic 억제제의 특성화

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

SHP2(PTPN11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans를 사용하여 EGFR 및 RAS 억제제의 식별

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...