Name: assays for validating histone acetyltransferase inhibitors
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra James og Esther King Biomedical Research Program (6JK03 og 20K07), og Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 og 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation og UF Health Cancer Center. I tillegg vil vi takke Dr. Zachary Osking og Dr. Andrea Lin for deres støtte under publiseringsprosessen.

1. In vitro HAT-analyse
<ol><li>Klargjøring av buffer MERK: Se tabell 1 for bufferoppskrifter.<ol>
<li>Forbered 5x analysebuffer og 6x natrium dodecylsulfat (SDS) og oppbevar ved -20 °C. Aliquot SDS i 1 ml aliquots.</li>
		<li>Forbered 10x SDS gel kjører buffer og 10x TBST og lagre ved romtemperatur.</li>
		<li>Forbered 1x overføringsbuffer og oppbevar ved 4 °C. FORSIKTIG: Kontroller sikkerhetsdatabladet for alle kjemikalier som brukes i denne protokollen. SDS, DTT og bromo...

Lysin acetyltransferaser (KATs) acetylat flere lysin rester på histone haler og transkripsjon faktorer for å regulere gentranskripsjon2,3. Arbeid i de siste to tiårene har avslørt at KATs, som CBP/p300, PCAF og GCN5, samhandler med onkogene transkripsjonsfaktorer og bidrar til å drive tumorvekst i flere solide tumortyper4,,5,,9,,15,</sup...

Lysin acetyltransferaser (KATs) katalyser acetylering av lysinrester på både histone og ikke-histonproteiner1,,2,,3,,4. Nyere forskning viser at KATs og deres acetyltransferase funksjon kan fremme solid tumorvekst4,5,6,7,8,9. For eksempel er CREB-bindende protein (CBP) / p300 to paraloge KATs som regulerer mange signalveier i kreft2,3. CBP/p300 har en godt karakterisert histone acetyltransferase (HAT) funksjon og katalysere Histone 3 Lysine 27 acetylering (H3K27ac)2,4,5,10,11, en viktig markør for aktive enhancers, promotor regioner og aktiv gentranskripsjon12,13,14. CBP/p300 fungerer som kritiske medaktivatorer for pro-vekst signalisering veier i faste svulster ved å aktivere transkripsjon av onkogener gjennom acetylering av histoner og andretranskripsjonsfaktorer 4,9,15,16,17,18. På grunn av deres rolle i tumorprogresjon, CBP/p300 og andre KATs er under etterforskning for utvikling av nye hemmere som blokkerer deres onkogenefunksjon 4,,5,,6,7,8,9,18,19,20. A-485 og GNE-049 representerer to vellykkede forsøk på å utvikle potente og spesifikke hemmere for CBP/p3004,,9. Ytterligere hemmere er under etterforskning for CBP/p300 og andre KATs.
Kvaliteten på tidligere beskrevne KAT-hemmere (KATi) blir stilt spørsmålstegn ved, med mange hemmere som viser frem måleffekter og dårlig karakterisering21. Derfor er streng karakterisering og validering av nye legemiddelkandidater avgjørende for utviklingen av kjemiske sonder av høy kvalitet. Skissert her er tre protokoller som danner en rørledning for screening og grundig validering av styrken og spesifisiteten til romanen KATi, med et spesielt fokus på å hemme HAT-funksjonen (HATi) av KATs. CBP/p300 og deres hemmere brukes som eksempler, men disse protokollene kan tilpasses for andre KATs som har en HAT-funksjon7.
Den første protokollen er en in vitro histone acetyltransferase (HAT) analyse som benytter renset rekombinant p300 og histoner i en kontrollert reagensrørreaksjon. Denne analysen er enkel å utføre, er kostnadseffektiv, kan brukes til å screene forbindelser i en lav gjennomstrømmingsinnstilling, og krever ikke radioaktive materialer. I denne protokollen, rekombinant p300 katalyser lysin acetylering på histone haler i løpet av en kort inkubasjonsperiode og nivåene av histone acetylering måles ved hjelp av standard immunoblotting prosedyrer. Den enzymatiske reaksjonen kan utføres i nærvær eller fravær av CBP/p300-hemmere for å screene for forbindelser som reduserer histonesecetylering. I tillegg kan HAT-analysen brukes til å kontrollere om nye forbindelser er selektive for CBP/p300 ved å vurdere deres aktivitet mot andre rensede KATs, for eksempel PCAF. HAT-analysen er et utmerket utgangspunkt for å undersøke nye inhibitorer på grunn av sin enkelhet, lave kostnader og evnen til å bestemme styrken / selektiviteten til en inhibitor. Faktisk er denne protokollen ofte brukt i litteraturen som en in vitro skjerm5,10. Imidlertid er inhibitorer identifisert i HAT-analysen ikke alltid effektive i cellekulturen fordi en testrørreaksjon er mye enklere enn et levende cellesystem. Derfor er det viktig å ytterligere karakterisere hemmere i cellekultureksperimenter22,23.
Den andre protokollen i rørledningen er Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI)-analysen. Denne cellebaserte analysen benytter histondeacetylasehemmere (HDACi) som et verktøy for å hyperacetylate histoner i kromatin før samtidig inkubasjon med en HATi24. Basal histone acetylering kan være lav i cellekultur, noe som gjør det vanskelig å sondere for via immunoblotting uten tilsetning av en HDACi for å øke acetylering. Formålet med ChHAI-analysen er å identifisere romanen HATi som kan dempe økningen i histone acetylering forårsaket av HDAC hemming. Fordelene med denne analysen inkluderer lave kostnader, relativ letthet å utføre, og bruk av celler i kultur, noe som gir mer fysiologisk relevans enn testrøret HAT analyse. I likhet med HAT-analysen bruker denne protokollen standard immunoblotting for datainnsamling.
HAT- og ChHAI-analysene gir data om styrken av nye forbindelser for å hemme global histone acetylering, men gir ikke innsikt i hvordan disse forbindelsene påvirker modifikasjoner på bestemte genomiske regioner. Derfor er den endelige protokollen, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) et cellekultureksperiment som undersøker DNA-proteininteraksjoner på bestemte områder av genomet. I ChIP-protokollen er kromatin krysskoblet for å bevare DNA-proteininteraksjoner. Kromatin ekstraheres deretter fra celler, og DNA-proteinkomplekset gjennomgår selektiv immunforekomst for protein av interesse (f.eks. ved hjelp av et antistoff som er spesifikt for H3K27ac). DNA blir deretter renset og analysert ved hjelp av qPCR. For eksempel kan ChIP-qPCR brukes til å avgjøre om en roman HATi nedregerer histonesecetylering ved individuelle onkogener, for eksempel Cyclin D125. Mens ChIP-qPCR er en vanlig teknikk som brukes i feltet, kan det være vanskelig åoptimalisere 4,,10,,26. Denne protokollen inneholder tips for å unngå potensielle fallgruver som kan oppstå mens du utfører ChIP-qPCR-prosedyren, og inkluderer kvalitetskontrollkontroller som skal utføres på dataene.
Når de brukes sammen, tillater disse tre protokollene streng karakterisering og validering av romanen HATi. I tillegg tilbyr disse metodene mange fordeler fordi de er enkle å utføre, relativt billige og gir data om global samt regional histone acetylering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3902</td>
			<td>For cell culture of MCF-7 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4846</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Glycine buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>For Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-200249</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TBST with 5% milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4844</td>
			<td>For all Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% polyacrylamide gel</td>
			<td>Thermo Fisher: Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Assay buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 1. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Passive lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-485</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-107455</td>
			<td>CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4771</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2056</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 8173</td>
			<td>antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 9675</td>
			<td>antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha tubulin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>For Method 2. Dilute 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anacardic acid</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13144</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>BX810</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belly Dancer Rotating Platform</td>
			<td>Stovall Life Science Incorporated</td>
			<td>not available</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum (BCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30072.03</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>125572-95-4</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3010</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP Elution Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete DMEM for MCF-7 Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris 130 &#181;l microTUBE</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td>Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>S220</td>
			<td>DNA sonicator for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>for drug dilution and vehicle control treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example transfer tank and transfer apparatus</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1704070</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>17-10086</td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK228 (Romidepsin)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128517-07-7</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5341</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>494437</td>
			<td>For buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini gel tank</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A25977</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-275 (Entinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>209783-80-2</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>P120-101</td>
			<td>Control rabbit antibody for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei swelling buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>For Methods 2 and 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80635</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>powdered milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 200 for western blot transfer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac 3000 for SDS gel running</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26616</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PI8340</td>
			<td>for use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Magentic Beads</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1425S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td>For use in Method 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-100 Programmable Thermal Controller</td>
			<td>MJ Research Inc.</td>
			<td>PTC-100</td>
			<td>For Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IEVH00005</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant H3.1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M2503S</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant p300</td>
			<td>ENZO Life Sciences</td>
			<td>BML-SE451-0100</td>
			<td>for use in Method 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA (Vorinostat)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>149647-78-9</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26628-22-8</td>
			<td>For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71725</td>
			<td>for SDS sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heatblock</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>MPN: 949030</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>For all methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Method 3. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>58880-19-6</td>
			<td>HDAC Inhibitor for use in Method 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>for buffer preparation in Methods 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta Medical &#38; Graphic, Inc.</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>For Methods 1 and 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for validating histone acetyltransferase inhibitors

Lysinacetyltransferaser (KATs) katalyser acetylering av lysinrester på histoner og andre proteiner for å regulere kromatindynamikk og genuttrykk. KATs, som CBP/p300, er under intens undersøkelse som terapeutiske mål på grunn av deres kritiske rolle i tumorigenesis av ulike kreftformer. Utviklingen av nye små molekylhemmere rettet mot histone acetyltransferase (HAT)-funksjonen til KATs er utfordrende og krever robuste analyser som kan validere spesifisiteten og styrken til potensielle hemmere.
Denne artikkelen skisserer en rørledning av tre metoder som gir streng in vitro validering for nye HAT-hemmere (HATi). Disse metodene inkluderer et testrør HAT analyse, Kromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) analyse, og Chromatin Immunoprecipitation-kvantitativ PCR (ChIP-qPCR). I HAT-analysen inkuberes rekombinante HATs med histoner i en reagensrørreaksjon, noe som åpner for acetylering av spesifikke lysinrester på histonehalene. Denne reaksjonen kan blokkeres av en HATi, og de relative nivåene av stedsspesifikk histonesecetylering kan måles via immunoblotting. Hemmere identifisert i HAT-analysen må bekreftes i cellulært miljø.
ChHAI-analysen bruker immunoblotting til å screene for romanen HATi som demper den robuste hyperacetyleringen av histoner indusert av en histondeacetylasehemmer (HDACi). Tilsetning av en HDACi er nyttig fordi basale nivåer av histone acetylering kan være vanskelig å oppdage via immunoblotting.
HAT- og ChHAI-analysene måler globale endringer i histoneseedylering, men gir ikke informasjon om acetylering i bestemte genomiske regioner. Derfor brukes ChIP-qPCR til å undersøke effekten av HATi på histone acetyleringsnivåer ved genregulatoriske elementer. Dette oppnås gjennom selektiv immunforekomst av histone-DNA-komplekser og analyse av renset DNA gjennom qPCR. Sammen gir disse tre analysene mulighet for nøye validering av spesifisitet, styrke og virkningsmekanisme av romanen HATi.

In vitro histone acetyltransferase (HAT)-analysen kan brukes til å sondere for forbindelser som hemmer p300 HAT-aktivitet mot et histoneunderstrat. Figur 1A gir en eksperimentell skjematisk for HAT-analysen. Anacardinsyre, en kjent HATi3,38, ble brukt i denne analysen i et konsentrasjonsområde fra 12,5-100 μM. Ved 100 μM nedregregerer anakarinsyre p300 histone acetylering ved Histone 3, Lysines 9 og 18 versus kontrollen DMSO beha...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors at JoVE.com

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Hemmere av histone acetyltransferaser (HATs, også kjent som lysin acetyltransferaser), som CBP/p300, er potensielle terapeutiske midler for behandling av kreft. Imidlertid er det nødvendig med strenge metoder for å validere disse hemmerne. Tre in vitro metoder for validering inkluderer HAT-analyser med rekombinante acetyltransferaser, immunoblotting for histone acetylering i cellekultur, og ChIP-qPCR.

Analyser for validering av histone acetyltransferasehemmere

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Disse protokollene er betydelige fordi de gir detaljerte trinn for validering av styrken og selektiviteten til nye HAT-hemmere, som er viktige forskningsverktøy og potensielle terapeutiske midler. Teknikkene som er demonstrert i denne videoen er enkle å utføre og gi informasjon om effekten av HAT-hemmere på global og regional histone acetylering. De gjør det mulig å forstå epigenetisk regulering av genuttrykk.Oppmerksomhet til detaljene er kritisk. Det er viktig å følge protokollene trinnvis. Begynn med å forberede den enzymatiske reaksjonen i et 10 mikrolitervolum inne i et 0,2 milliliter PCR-rør i henhold til manuskriptretninger.Inkuber deretter den komplette reaksjonsblandingen ved 30 grader Celsius i en time i en PCR termisk cycler. I mellomtiden legger du til to mercaptoethanol med ett til 10-forhold til 6X SDS-prøvebufferen. Fjern prøver fra PCR termisk cycler og legg til to mikroliter av den forberedte SDS prøvebufferen til hver reaksjonsblanding.Varm prøvene til 95 grader Celsius i fem minutter på en varmeblokk, og avkjøl dem på is. Oppbevar prøvene ved minus 20 eller minus 80 grader Celsius eller fortsett med gelelektroforese og immunoblotting. Seed 100, 000 MCF-7 celler i en milliliter cellekultur medium i hver brønn av en 12-brønns plate og la cellene vokse til 80 til 90% samløpet.Når cellene når ønsket samløpet, aspirerer cellekulturmediet fra brønner fire, fem og seks, og pipetter en milliliter tre mikromos MS275 i medium inn i hver brønn. Deretter aspirerer cellekulturmediet fra brønner en, to og tre, og pipette en milliliter fortynnet DMSO inn i hver brønn. Returner cellene til inkubatoren i fire timer for å tillate akkumulering av acetylaterte histoner i celler eksponert for MS275.Mens cellene inkuberer, forberede fortynninger av A-485 i DMSO i henhold til manuskript retninger. Når inkubasjonen er ferdig, aspirer mediet fra brønnene og tilsett fortynningene. Returner cellene til inkubatoren og kultur dem i 20 timer, deretter aspirer cellekulturmediet fra brønnene og vask cellene med en milliliter PBS.Aspirer PBS og tilsett 100 mikroliter passiv lysisbuffer. Oppbevar platen på minus 80 grader Celsius over natten. Pipette 100 mikroliter sonikert kromatin fra celler behandlet med DMSO i to 1,5 milliliter rør, deretter pipette 400 mikroliter chip fortynning buffer til hvert rør for å bringe det totale volumet opp til 500 mikroliter.Fjern fem mikroliter av løsningen fra et av rørene og oppbevar den på minus 20 grader Celsius som DMSO-inngang. Forbered to rør med sonikert kromatin fra celler behandlet med A-485 på samme måte. Bruk en pipette til å legge til IgG- og H3K27 acetyyantistoffene til DMSO- og A-485-prøvene.Tilsett deretter 20 mikroliter protein A magnetiske perler til hvert rør, og pass på at perlene er godt resuspended. Roter prøvene over natten på fire grader Celsius. Pellet proteinet En magnetiske perler ved hjelp av en magnetisk separator og fjern supernatanten uten å forstyrre perlene.Vask perlene med 500 mikroliter til en milliliter lav saltvaskbuffer og roter dem i fem minutter ved fire grader Celsius. Utfør en rask spinn ned, pellet perlene med en magnetisk separator og fjern det overnaturlige. Gjenta vaskeprosedyren med høy saltvaskbuffer, litiumkloridvaskbuffer og TE-buffer.Etter vasken med TE-bufferen fjerner du inndataprøvene fra fryseren og legger dem på is. Tin en aliquot av proteinase K, deretter pellet perlene ved hjelp av en magnetisk separator og fjern TE-bufferen fra perlene. Tilsett 100 mikroliter ChIP elution buffer og en mikroliter proteinase K til hver prøve, inkludert inngangsprøver og inkuber dem med risting på 62 grader Celsius i to timer ved hjelp av en termocycler.Etter inkubasjonen, varme prøvene til 95 grader Celsius i 10 minutter, og deretter kjøle dem til romtemperatur. Pellet de magnetiske perlene med en magnetisk separator og overfør DNA-inneholdende supernatant til et nytt 1,5 milliliter rør. Rens DNA ved hjelp av et standard PCR-oppryddingssett og kjør qPCR.In vitro histone acetyltransferase analysen ble brukt til å undersøke effekten av anacardinsyre på p300 HAT aktivitet mot et histone substrat. Et konsentrasjonsområde ble testet og acetyler-CoA ble ikke lagt til den negative kontrollreaksjonen. Immunoblotresultatene ble kvantifisert med ImageJ, som viste en klar reduksjon i acetyl H3K18 og acetyl H3K9 ved 100 mikromolar anakarinsyre sammenlignet med DMSO-kontrollen.I kromatin hyper-acetyleringshemmingsanalysen, behandling av MCF-7 celler med HDACi MS275 sterkt oppregulert acetylering av histone 3 på flere lysinrester. Basalnivåene av acetyl H3K18 og acetyl H3K27 var lave, noe som viser fordelene ved å legge til en HDACi i ChHAI-analysen. Tilsetning av A-485 i celler som er forbehandlet med MS275, demper den økte histonesecetyleringen ved H3K18 og H3K27, men ikke H3K9.Immunoblotresultatene ble også kvantifisert med ImageJ. ChIP qPCR ble brukt til å undersøke effekten av HAT-hemmere ved genregulatoriske elementer som kontrollerer onkogenuttrykk. I DMSO-prøven produserte DNA-et som ble utløst av IgG-kontrollantistoffet en høyere Ct-verdi enn acetyl H3K27-antistoffet i qPCR-reaksjonen for cyklin D1-promotoren, noe som indikerer at den ikke-spesifikke IgG-kontrollen utløste mindre DNA-histonkomplekser enn acetyl H3K27-spesifikt antistoff ved arrangøren.Sammenlignet med DMSO-kontrollen reduserte A-485 acetyl H3K27-berikelsen ved cyklin D1-arrangøren. Viktigere, A-485 er kjent for å redusere acetyl H3K27 i cellekultur. Når du prøver denne protokollen, må du huske på at trinnene for forhåndsinkubasjon av in vitro HAT- og ChHAI-analysene er avgjørende og ikke bør glemmes.Det er også viktig å huske å lagre inndataprøvene og for å unngå tap av perlene under ChIP. Etter å ha utført disse prosedyrene, er ChIP-seq en ekstra metode som kan utføres for å få global informasjon om histone acetylering ved regulatoriske elementer for hele genomet. Disse protokollene er nyttige for forskere å nøye validere nye HAT-hemmere og for å unngå å publisere kjemiske sonder av lav kvalitet i litteraturen.De validerte HAT-hemmere kan gjennomgå videre utvikling som potensielle terapeutiske midler.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser å studere macrophage og Microglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Prekliniske vurdering av Bioactivity av Anticancer kumarin OT48 ved Spheroids, koloni formasjon analyser og sebrafisk Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Vurdering av motstand mot Tyrosine Kinase hemmere av en avhør av signaltransduksjon trasé av antistoff matriser

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Undersøkelse av genetisk avhengigheter ved hjelp av CRISPR-Cas9-baserte konkurranse analyser

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Gjær som et chassis for å utvikle funksjonelle analyser for å studere Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering av effekter av Migrastatic hemmere på 3D tumor spheroid Invasion av høy oppløsning Konfokalmikroskopi mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Kombinert bruk av hale vene metastasering analyser og Real-Time in vivo Imaging å kvantifisere brystkreft metastatisk kolonisering og byrde i lungene

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

Vurdere cellulært målengasjement etter SHP2 (PTPN11) Fosfatasehemmere

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Identifisering av EGFR- og RAS-hemmere ved bruk av Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...